Name: Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Leer hoe retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellen de hematopoëtische differentiatie beïnvloedt. Deze methode gebruikt hangende druppelcultuur en flowcytometrie om genexpressie tijdens ontwikkeling te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Pilot en Feasibility Grants van het Indiana University School of Medicine Center (IUSM) voor Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948). Aanvullende financiering werd verstrekt door een Biomedical Enhancement Grant van IUSM. We willen Dr. Karen Cowden Dahl bedanken voor het commentaar op het manuscript.

1 embryoiden Body (EB) Vorming <ol><li> Gelatine-passen SER&#39;s die zijn aangehouden op de muis embryo fibroblasten (MEF). Passage SER 3 keer op 6 en weefselkweek plaat gecoat met 0,1% gelatine MEF verwijderen. <ol><li> Groeien cellen in ESC onderhoudsmedium met LIF om de cellen ongedifferentieerd (tabel 1) te houden. Zorg ervoor dat de cellen nooit meer dan 80% samenvloeiing. Gebruik lage passage (10 of minder passages na het verwijderen van MEF) cellen voor differentiatie. </li></ol></li><li> Op de dag voor SER worden gedurende EB differentiatie doorgang de cellen zodat ze ongeveer 50-70% confluent de volgende dag. Blijven kweken van cellen in ESC onderhoud medium naar cel pluripotency behouden. </li><li> Op de dag van de differentiatie, aspiratie ESC onderhoudsmedium en wassen met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl en 11,9 mM fosfaatbuffer, pH 7,4) per putje van een 6-wells plaat. <ol><li> Voeg 200 ul van 0,25% trypsIn / EDTA aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten. </li><li> Inactivatie van het trypsine / EDTA met 800 ul van differentiatie media. Pipet op en neer in een 2 ml serologische pipet met een P200 tip te breken-de cellen in een enkele celsuspensie. Zorg ervoor dat de p200 tip past precies op het uiteinde, zodat de media niet omhoog gaan tussen de pipet en tip-interface. </li><li> Pipet op en neer ongeveer 5-10 keer. Zorg dat er geen luchtbellen te creëren tijdens het pipetteren. </li></ol></li><li> Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. Breng het volume op 10 ml met PBS. Centrifugeer bij 315 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder supernatant. Was tweemaal met 5 ml PBS om de resterende media met LIF verwijderen. Centrifugeer zoals in stap 1.4 voor elke wasbeurt. <ol><li> Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 2 ml van differentiatie medium (tabel 2). </li></ol></li><li> Tellen cellen met een hemocytometer of celteller en plaat 6,000-10,000 cellen / ml in een 10 cm Petri schaaltje(Niet-weefselkweek behandeld). <ol><li> Bepaal de juiste cellen / ml empirisch voor elk ESC regel. Gebruik steriele Petri platen normaal gebruikt voor bacteriële werk of lage therapietrouw platen. OPMERKING: Voor de beste differentiatie leidt, moet de EBS bollen die in suspensie blijven zonder bevestiging aan de plaat te vormen. Test verschillende merken van platen tot degenen met de minste therapietrouw te vinden. </li><li> Incubeer de differentiërende SER in een 37 ° C weefselkweek incubator met 5% CO2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Voorraad </td><td> Uiteindelijke concentratie </td><td> Deel </td><td> Bedrijf </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> IGMA / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES Afgeschermde) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / streptomycine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> 14.3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ui </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Leukemie Remmende Factor (LIF) </td><td> 10 7 eenheden / ml </td><td> 1000 eenheden / ml </td><td> 50 gl </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>NHOUD &quot;&gt; Tabel 1: ESC Maintenance Media. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Voorraad </td><td> Uiteindelijke concentratie </td><td> Deel </td><td> Bedrijf </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (User Afgeschermde voor optimale differentiatie) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / streptomycine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> 14.3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ui </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Differentiatie Media. 2 Voorbereiding EB Cellen voor Virus Infection <ol><li> Op het gewenste stadium van ontwikkeling (tussen dag 2 en dag 3), breng het EBS uit de 10 cm petrischaal tot 15 ml conische buis. Was de plaat met 5 ml PBS en voeg de was de conische buis. </li><li> Pellet de EBS 315 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Was de EB cellen met 5 ml PBS. </li><li> Voeg 1 ml van de ontdooide cellen loslaten oplossing (bevattende proteolytische en collagenolytische enzymen) en plaats de buizen in een 37 ° C waterbad (of incubator) gedurende 30 min met occasional agitatie (van vegen of licht vortexen). </li><li> Voeg 1 ml van differentiatie media. Pipet op en neer met een pipet 2 ml van een p200 pipet tip. Plaats de buis bij 37 ° C waterbad gedurende 30-60 min weer. </li><li> Draai de cellen af ​​bij 315 xg gedurende 5 minuten en was de cellen met PBS. </li></ol> 3 Virus Infection <ol><li> Resuspendeer de cellen in 1,5 ml van differentiatie media. Breng de celsuspensie in een 6-well niet-weefselkweek behandelde plaat. </li><li> Bereid de retrovirus door standaard technieken van tevoren. Voeg 5 tot 100 gl virus supernatant cellen afhankelijk van de virale titer. Voeg geen polybreen om infectie te verbeteren, omdat dit remt de verdere hervorming van EBS. </li><li> Spinoculate de cellen met virus door centrifugeren bij 2120 xg gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li></ol> 4 Onderscheidende Virale Besmette EB Cellen in Opknoping Drops <ol><li> Voeg 2 ml van differentiatie medium aan elk putje van infected EB celsuspensie. </li><li> Pipetteer 3,5 ml EB geïnfecteerde celsuspensie in een steriele reagensreservoir voor multipipettors. Gebruik multipipettor 15-20 rijen van acht 20 ul druppels op het omgekeerde deksel 15 cm Petri schaaltje pipet. </li><li> Voeg 10 ml steriel PBS of water om de onderste helft van de Petri plaat. Dan keer het deksel met de druppels en de plaats op de Petri plaat. Zorg ervoor dat de druppels opknoping ondersteboven van deksel met PBS of water onder te houden de kamer bevochtigd. </li><li> Leg de schalen in de 37 ° C weefselkweek incubator met 5,0% CO 2. </li><li> Na 2 dagen, verzamel EBS gevormd in de hangende druppels door het omkeren deksel en wassen met 4,5 ml van differentiatie media. <ol><li> Transfer media en EBS een nieuwe 10 cm niet-weefselkweek Petri plaat. Was het deksel nogmaals met 3 ml van differentiatie media en transfer naar de 10 cm plaat. </li></ol></li><li> Oogst cellen voor analyse door flowcytometrie na in totaal 8dagen cultuur vanaf de eerste overdracht van cellen tot differentiatie media (-LIF). </li></ol> 5 Voorbereiding Cellen voor doorstroomcytometer Analyse <ol><li> Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis met een 10 ml pipet. Was de plaat met 5 ml PBS en dragen dezelfde conische buis. </li><li> Pellet de cellen bij 315 x g. Was pellets met 10 ml PBS. </li><li> Voeg 1 ml van de ontdooide cellen onthechting oplossing en zet de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten met af en toe roeren. Voor detectie van bepaalde celoppervlak antigenen, kan trypsine worden gebruikt. </li><li> Voeg 1 ml differentiatie media en pipet op en neer met een 2 ml pipet. Gebruik een P200 tip aan het eind van de pipet om break-up gedigereerd EB in enkele celsuspensie. <ol><li> Plaats de buis in een 37 ° C waterbad opnieuw voor 60 min zodat het integrale membraaneiwitten te recyclen aan het celoppervlak. </li></ol></li><li> Pellet cellen bij 315 g gedurende 5 minuten. </li><li> Was de cellen with 0,1% runderserumalbumine fractie V (BSA) bereid in PBS (PBS / BSA) en incubeer de cellen met specifieke fluorescent gelabeld antilichamen. </li></ol> 6 Flowcytometrieanalyse voor hematopoietische voorlopercellen <ol><li> Plaats 10 6 EB-afgeleide cellen in een 5 ml 12 x 75 mm met ronde bodem buis. Voor het aanpassen van doorstroomcytometer compensatie, instellingen, gebruik compensatie kralen volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Pellet de cellen bij 315 x g. Giet af en resuspendeer pellet in de resterende PBS / BSA-oplossing in de buis. </li><li> Voor het detecteren ESC HPCs Incubeer de cellen met fluorescent gemerkte antilichamen: anti-muis CD41-PE (R-Phycoerytherin) en anti-muis CD117 (cKit) APC-/ CY7 (allofycocyanine Cyanine 7). <ol><li> Verdun antilichamen 1: 100 in PBS / BSA. Voeg 100 ul verdund antilichaam aan elk monster. Bepaal de juiste verdunning van antilichamen voor elke leverancier, kloon, en veel of antilichaam. Bepaal optimale verdunning voor het labelen van cellen individueel. </li&gt; </ol></li><li> Incubeer de monsters op ijs in het donker 30 minuten. </li><li> Voeg 2 ml PBS / BSA en pellet cellen bij 315 g gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren en resuspendeer pellet in 300 pi PBS of een andere isotone buffer. </li><li> Filter geresuspendeerde cellen door een cel zeefdop (0,35 uM) om grote cel aggregaten te verwijderen. </li><li> Analyseer cellen op een flowcytometer. </li></ol>

<ol><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).</li>
<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Tian, X., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+towards+hematopoietic+cells%3A+progress+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls.</a> Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336, 348-352 (1988).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323, 445-448 (1986).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+efficiency+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors.</a> Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+signaling+restricts+hematopoietic+potential+after+promoting+hemangioblast+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment.</a> Blood. 117, 6489-6497 (2011).</li>
<li>Zafonte, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+expands+the+hemangioblast+population+within+a+limited+developmental+window%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window.</a> Blood. 109, 516-523 (2007).</li>
<li>Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxB4+confers+definitive+lymphoid-myeloid+engraftment+potential+on+embryonic+stem+cell+and+yolk+sac+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors.</a> Cell. 109, 29-37 (2002).</li>
<li>Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+regulates+the+bone+morphogenic+protein+pluripotency+pathway+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).</li>
<li>Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+patterning+activity+of+SCL%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesodermal patterning activity of SCL.</a> Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).</li>
<li>Kyba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hematopoietic+differentiation+of+embryonic+stem+cells+conditionally+expressing+Stat5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-23a+regulates+TGF-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+by+targeting+E-cadherin+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells.</a> Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).</li>
<li>Chan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+antagonism+between+PDGF+and+the+TGFbeta+family+of+signalling+pathways+by+control+of+miR-24+expression%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression.</a> EMBO J. 29, 559-573 (2010).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+miR-23a+approximately+27a+approximately+24+decreases+transforming+growth+factor-beta-induced+tumor-suppressive+activities+in+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells.</a> Int J Cancer. 123, (2008).</li>
<li>Min, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-associated+miR-27a+inhibits+dendritic+cell-mediated+differentiation+of+Th1+and+Th17+cells+by+TAB3%2C+p38+MAPK%2C+MAP2K4+and+MAP2K7%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7.</a> Genes Immun. 13, 621-631 (2012).</li>
<li>Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+marks+the+initiation+of+definitive+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo.</a> Blood. 101, 508-516 (2003).</li>
<li>Mitjavila-Garcia, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+on+hematopoietic+progenitors+derived+from+embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 129, 2003-2013 (2002).</li>
<li>Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+hematopoietic+stem+cell+functions+during+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews.</a> Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).</li>
<li>Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spi-B+can+functionally+replace+PU.1+in+myeloid+but+not+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development.</a> Embo J. 21, 2220-2230 (2002).</li>
<li>Dahl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+and+neutrophil+cell+fates+by+the+PU.1%3AC%2FEBPalpha+ratio+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.

Zoals hierboven besproken, kan ESC klonen die induceerbare expressie van een gen van interesse worden gegenereerd met behulp doxycycline systemen echter generatie van deze lijnen is tijdrovend en arbeidsintensief. Beschreven in dit protocol is een methode om een ​​gen van belang in een enkele celsuspensie bereid uit ESC afgeleid EBS drukken. Deze geïnfecteerde cellen worden vervolgens hervormd tot EBs door opknoping druppel op latere differentiatie te onderzoeken. In het voorbeeld (figuur 3), wordt aang...

Muis embryonale stamcellen (ESCs) zijn pluripotent, blijven ongedifferentieerd en vernieuwen zichzelf in aanwezigheid van de cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1. Bij het wegnemen van LIF zullen ze spontaan differentiëren in 3-dimensionale (3D) structuren genaamd embryoïde lichamen (EBs)2. De 3D-architectuur maakt de ontwikkeling van de drie kiembladen ectoderm, endoderm en mesoderm mogelijk, die later uitgroeien tot volwassen weefselsoorten3. ESCs zijn een uitzonderlijk model voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van cellulaire differentiatie, met name de onderzoek van de ontwikkeling van vroege hematopoietische voorlopercellen (HPC's)4. 
Genexpressie in ESCs kan worden gemanipuleerd door verschillende technieken die het mogelijk maken om een rol voor individuele moleculen in de ontwikkeling te bepalen. Een van de meest gebruikelijke technieken is het gebruik van homologe recombinatie om ESC-lijnen te genereren die een gen van belang missen5,6. Er zijn ook een aantal technieken die zijn gebruikt om genen te overexpresseren. De eerste techniek die werd gebruikt om genexpressie in ESCs te wijzigen, was het infecteren ervan met recombinante retrovirussen7,8. Het gen van belang wordt echter vaak gedempt terwijl de ESCs differentiëren in voorlopercellen en volwassen celtypen. Het gebruik van lentivirussen is succesvol geweest in het beperken van de demping van door virus uitgedrukte genen9. Andere virale vectoren die worden gebruikt voor overexpressie zijn adenovirus en adeno-geassocieerd virus10. Daarnaast worden standaard transfectietechnieken voor het stabiel introduceren van expressieplasmiden veel gebruikt voor ESC transgenexpressie11. Een moeilijkheid met deze systemen is dat vaak expressie van een specifiek gen verschillende effecten heeft, afhankelijk van de tijdelijke expressie. Bijvoorbeeld, het Smad1-eiwit beïnvloedt de ontwikkeling van hematopoëtische cellen op verschillende manieren tijdens verschillende stadia van EB-ontwikkeling12,13. 
Dit probleem kan worden omzeild door het genereren van ESCs die op inductieve wijze een gen van belang tot expressie brengen. Het meest gebruikte systeem voor inducibele expressie van transgenen in ESCs maakt gebruik van het tetracycline-resistentie-operon van E. Coli (Escherichia coli). Er zijn verschillende tetracycline-systemen ontwikkeld. Een van de meer populaire strategieën is ontwikkeld door Kyba en collega's14. Ze genereerden een ESC-lijn (Ainv15), die het omgekeerde tetracycline-transactivatorgen in de constitutief actieve ROSA26-locus heeft ingebracht. Een tetracycline-responselement (TRE), een downstroom LoxP-site (locus van X-over P1 van bacteriofaag P1) en een promotorloos neomycine-casset werden geïntroduceerd in de HPRT (Hypoxanthine-guanine-fosforibosyltransferase)-locus op het X-chromosoom. Met behulp van een CRE-recombinatie-aanpak kan een gen van belang samen met een eukaryotisch promotor om de expressie van het neomycine-resistentiegen aan te drijven, worden geïntroduceerd in de LoxP-site. Correct getargeteerde ESCs worden geïsoleerd door G418-selectie. Deze getargeteerde klonen moeten vervolgens worden getest op doxycycline (of tetracycline) induceerbare expressie van het transgen. Deze aanpak heeft met succes ESC-lijnen gegenereerd die op inducibele wijze HoxB4, Stat5, SCL en Smad7 tot expressie brengen14-17. De generatie van deze inducibele cellijnen is echter tijdrovend. Hier wordt een methode beschreven om ESC-afgeleide embryoïde lichamen (EBs) te disgregeren in enkele celsuspensies, retroviraal de celsuspensies op verschillende ontwikkelingsdagen te infecteren en vervolgens de EBs opnieuw te vormen door middel van een druppelmethode. Differentiatie stroomafwaarts wordt later geëvalueerd door middel van flowcytometrie. In dit artikel wordt een voorbeeld gegeven van hoe miRNA-expressie in EB-afgeleide cellen de hematopoëtische differentiatie beïnvloedt. Deze methode is nuttig voor het onderzoeken van de rol van genen nadat specifiek kiembaandweefsel is afgeleid.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoethanol</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES Screened)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Defined)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Non-treated Plates 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri dish 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri dish 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>White sterile resevoirs</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 ESCs</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen afgeleid embryoiden lichaamscellen voor analyse van hematopoietische differentiatie

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonale stamcellen (ESCs) zijn een uitstekend model voor het verduidelijken van de moleculaire mechanismen van cellulaire differentiatie. Ze zijn vooral nuttig voor het onderzoeken van de ontwikkeling van vroege hematopoëtische progenitorcellen (HPCs). Genexpressie in ESCs kan worden gemanipuleerd door verschillende technieken die het mogelijk maken om de rol van individuele moleculen in de ontwikkeling te bepalen. Een moeilijkheid is dat expressie van specifieke genen vaak verschillende fenotypische effecten heeft, afhankelijk van hun temporele expressie. Dit probleem kan worden omzeild door de generatie van ESCs die induceerbaar een gen van belang tot expressie brengen, met behulp van technologie zoals het doxycycline-induceerbare transgensysteem. De opwekking van deze inductible cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Hier wordt een methode beschreven voor het disaggregeren van ESC-afgeleide embryoïde lichamen (EBs) in enkele celsuspensies, retroviraal infecteren van de celsuspensies, en vervolgens het hervormen van de EBs door middel van een druppelmethode. Downstream differentiatie wordt vervolgens geëvalueerd door middel van flowcytometrie. Met behulp van dit protocol werd aangetoond dat exogene expressie van een microRNA-gen aan het begin van ESC-differentiatie HPC-generatie blokkeert. Wanneer het echter wordt uitgedrukt in EB-afgeleide cellen nadat het naaste mesoderm is geproduceerd, verbetert het microRNA-gen de hematopoëtische differentiatie. Deze methode is nuttig voor het onderzoeken van de rol van genen na de afgeleide specifieke kiembaanweefsel.

In deze studies ontsloten RW4 (Afgeleid van 129X1 / SVJ muis stam) SER&#39;s werden gebruikt. EBS werden geïsoleerd op 3 dagen van differentiatie. Voor het beste resultaat moet de EBS sferische en niet-hechtende (Figuur 1A, B) zijn. Na spinoculation met virus co-expressie van de fluorescente merker GFP samen met een gen van interesse, werd EBS hervormd door de hangende druppel methode. EVSA&#39;s werden met succes hervormd uit celsuspensies bereid uit 2,0, 2,5, en 3,0 dag EBS. Echter, kon EBS niet worde...

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Het algemene doel van deze procedure is om te onderzoeken hoe de expressie van een gen op verschillende tijdstippen tijdens de differentiatie van embryonale stamcellen de hematopoëtische differentiatie beïnvloedt. Na transductie van het embryolichaam, wordt een enkele celsuspensie door centrifugatie gevormd en embryolichamen worden opnieuw gevormd door een hangende druppel en gekweekt om verdere differentiatie in hematopoëtische cellen mogelijk te maken. Vervolgens worden enkele celsuspensies van de gevormde embryolichamen bereid, geïncubeerd met fluorochroom geconjugeerde antilichamen en geanalyseerd op een flowcytometer voor hematopoëtische differentiatie.Uiteindelijk toont deze methode aan of expressie van een gen tijdens de differentiatie van embryonale stamcellen de hematopoëtische ontwikkeling beïnvloedt. Het is vooral nuttig voor het aantonen van rollen voor genen die mogelijk alleen actief zijn na de vorming van vroeg embryonaal weefsel. Dus van de gebruikelijke technieken om een gen expressief te maken op verschillende tijdstippen tijdens de differentiatie van embryonale stamcellen vereist de generatie van embryonale stamcellijnen en inductieve expressie van een gen van be

retroviral-infection-murine-embryonic-stem-cell-derived-embryoid-body

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.

Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Leer hoe retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellen de hematopoëtische differentiatie beïnvloedt. Deze methode gebruikt hangende druppelcultuur en flowcytometrie om genexpressie tijdens ontwikkeling te analyseren.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie (Video) | JoVE Journal

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Meer video's verkennen