Name: De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer neurovasculaire veranderingen analyseren in entorhino-hippocampale orgaanspecifieke sliceculturen. Deze methode maakt gelijktijdige studie van neuronale overleving en vaatveranderingen na ischemisch hersenletsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Basel, afdeling Medische biologie, en de Zwitserse National Science Foundation (31003A_141007). Markus Saxer verleende technische ondersteuning.

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen van de Raad van 22 september 2010 worden uitgevoerd (2010/63 / EU) en werden beoordeeld en toegestaan ​​door de Zwitserse autoriteiten. 1 instellen Organotypische Entorhino-hippocampus Slice culturen <ol><li> Bereid entorhino-hippocampus organotypische slice culturen (EHOSCs) van postnatale dag 4 (P4) muis pups met behulp van de statische incubatie methode 4,11. Hier gebruiken C57Bl6 en CB6F1 muizen. <ol><li> Duurt ongeveer 30 minuten per muis pup voor de voorbereiding van slice culturen, dat wil zeggen, 3 uur voor een nest van 6 pups muis. Het uitvoeren van alle stappen onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming werkbank met gesteriliseerde chirurgische instrumenten. </li><li> Met het oog op een mogelijke storing van de positie van het segment samen de Septo-temporele as te voorkomen uitsluitend hippocampus plakjes van het septum helft. Indien niet anders vermeld, het uitvoeren van alle stappen bij RT. </li></ol></li><li> Afgesneden thij hoofd van een P4 muis pup met chirurgische schaar. Geen verdoving nodig voor deze stap. <ol><li> Verwijder de schedel rond de hersenen en het identificeren van de kloof tussen het caudale einde van de hersenhelften en de middenhersenen. Verwijder voorzichtig het gedeelte van de hersenen rostraal van de middenhersenen van de schedel en plaats deze in ijskoud bereiding medium bestaande uit MEM aangevuld met een gestabiliseerde vorm van L-glutamine. </li></ol></li><li> Blijven de dissectie onder een stereomicroscoop met de hersenen wordt ondergedompeld in het ijskoude voorbereiding medium. Verwijder de resterende hersenvliezen van de corticale hemisferen. Identificeer de hippocampus op het caudale mediale oppervlak van de halve bol en scheiden samen met het aangrenzende entorhinale cortex van de rest van de hersenen. <ol><li> Breng het weefsel een weefsel chopper en snijd 400 urn dikke plakken onder aseptische omstandigheden dwars op de Septo-temporele as van de hippocampus. </li></ol></li><li> Leg de plakjes op cell cultuur inserts (ongeveer 6 segmenten per insert) en incubeer ze in 6-well platen met 1 ml per putje incubatiemedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml paardenserum, 1 ml glutamax I, 1 ml van een steriele 10% glucose-oplossing, pH 7,3) in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 ° C. Verander het medium de volgende dag en dan om de andere dag tot 1 week. </li></ol> 2 In Vitro Hypoxie en zuurstof-glucose beroving met Reperfusie <ol><li> Zie tabel 1 voor een exacte tijdschema van de procedure. Cultuur EHOSCs voor 5 dagen (DIV5) voor de blootstelling aan hypoxie of OGD. Op dat tijdstip schakelt het medium incubatiemedium met 25% paardenserum om serum-vrij medium met de volgende samenstelling: Neurobasal medium met 2% B27 supplement, 1% glutamax en extra 0,1% glucose. </li><li> Bereid de OGD medium zoals beschreven in Reference 7 .De uiteindelijke concentraties van de componenten zijn de volgende: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH 2PO 4, 2 mM MgSO4 en 10 mM sucrose bij pH 6.8. Voeg 1 ml van OGD medium aan elk putje van twee 6-well weefselkweekplaten. <ol><li> Perfuseren de OGD medium met N2 gedurende 1 uur in een kamer hypoxie en verzegel en bewaar O / N in een incubator bij 37 ° C. </li><li> Gebruik anaërobe strips als hypoxische indicatoren. Beschouw het medium zuurstofvrij wanneer de kleur van de stroken veranderd van roze naar wit. </li><li> Voor de inductie van hypoxie, gebruik serumvrij medium met glucose plaats van OGD medium. Voor het gebruik, perfuse het medium met N2 in een hypoxie kamer zoals hierboven beschreven voor OGD medium. </li></ol></li><li> Voor de plakjes worden blootgesteld aan OGD, perfuseren de OGD medium opnieuw met N2 gedurende 30 minuten. Voeg 2 ui van een 1 mg / ml propidiumjodide (PI) oplossing per putje (voor een uiteindelijke concentratie van 2 ug / ml) aan de schijfjes gedurende 30 min en selecteeralleen gezond plakjes voor experimenten zoals aangegeven door lage aantallen PI positieve cellen. </li><li> Gebruik het tijdschema OGD blootstelling en reperfusie in figuur 1. Beroven plakjes hetzij alleen zuurstof (hypoxie) of zuurstof en glucose (OGD) gedurende 15 minuten. <ol><li> Voor de inductie van hypoxie of OGD, overdragen plakjes in OGD medium en bewaar ze voor 15 min in de hypoxie kamer. Zorg ervoor dat alle vloeistoffen die blijven de zijkanten van het inzetstuk weg aangezogen wanneer de kweken overgang van reguliere medium OGD medium en terug. </li><li> Na hypoxie of OGD, vervangen OGD zuurstofrijk medium serumvrij medium en kweken mogen herstellen gedurende 3, 24 of 48 uur in serumvrij medium in de normale incubator bij 37 ° C met 5% CO2. PI Voeg nogmaals vóór bevestiging voor de bepaling van celdood. </li></ol></li></ol> 3 farmacologische behandelingen van Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen <ol><li> Culture EHOSCs voor 5 dagen (DIV5) in incubatie medium voor de blootstelling aan farmacologische behandelingen. Beginnen farmacologische behandelingen hetzij tijdens of onmiddellijk na OGD OGD wanneer plakjes worden overgebracht naar serumvrij medium. </li><li> Behandelingen voor de bescherming van OGD. <ol><li> Voeg 100 uM 6-cyaan-7-nitrochinoxaline-2,3-dion (CNQX) of 1 uM tetrodotoxine (TTX) aan het kweekmedium tijdens OGD inductie (15 min) of onmiddellijk na OGD inductie gedurende 30 minuten. Vervolgens incuberen in normoxische serumvrij medium gedurende 48 uur vóór fixatie. </li></ol></li><li> Behandelingen voor de inductie van excitotoxische dood. <ol><li> Na 5 dagen incubatie medium schakel kweken op medium dat 100 uM (RS) -α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) gedurende 30 min serum. </li><li> Verwijder het kweekmedium met AMPA door aspiratie (hij eventuele resten van het medium op de inserts te verwijderen), vervolgens over de plakjes verse platen met normale serum vrij medium enbewaar ze voor 48 uur tot fixatie. </li></ol></li></ol> 4 Fixatie en Immunokleuring van Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen <ol><li> Propidium jodide (PI) kleuring. <ol><li> PI&#39;s van 30 min aan het kweekmedium van levende segmenten in een concentratie van 2 ug / ml. Bekijk levende culturen met een omgekeerde microscoop uitgerust met fluorescentie optiek en selecteer plakken voor verdere behandelingen. Voor PI kleuring in combinatie met immunohistochemie, commentaar PI oplossing 30 min voor fixatie van de kweken. </li></ol></li><li> Fixatie van de plakjes. <ol><li> Verwijder het kweekmedium van de 6-well plaat en voeg 3 ml vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) in elk putje. Plaats de 6-well plaat in een koelkast en lossen O / N bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de PFA oplossing de volgende dag was de plakjes 3-4 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li></ol></li><li> Verwijdering van de segmenten van de celkweek insert en het blokkeren van de procedure voor immunohistochemie van vrij zwevende delen. <ol><li> Voorzichtig los en verwijder de plakjes uit de inserts cultuur met een kunst penseel van de maat 0 of kleiner. Breng elk individu sneetje in een putje van een plaat met 96 putjes gevuld met blokkerende buffer (PBS met 3% normaal geitenserum (NGS) en 2% Triton-X100). Houd de segmenten in de blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder constant roeren met een rondschudapparaat. </li></ol></li><li> Immunokleuring van de slice culturen <ol><li> Voor labeling bloedvaten polyklonale anti-laminine bij een verdunning van 1: 200 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100. </li><li> Voor labeling neuronen gebruiken anti-microtubule geassocieerde proteïne 2 (MAP2) bij een verdunning van 1: 500 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100. </li><li> Incubeer de segmenten met primaire antilichamen gedurende 48 uur bij 4 ° C onder constant roeren. Na de incubatieperiode wassen in PBS met 0,5% Triton-X100 voor 3-4 keer. </li&gt; <li> Verdun secundaire antilichamen 1: 500 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100. Incubeer de schijfjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker met de Alexa fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen. Toepasselijke geit anti-konijn of geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 350 of 488. </li><li> Verwijder het secundaire antilichaam oplossing en was de schijfjes driemaal met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS); monteer ze op glasplaatjes en dekglaasje de dia&#39;s met Mowiol. </li></ol></li><li> Microscopie van de gebrandschilderde plakjes </li><li> Bekijk de gekleurde schijfjes worden op een standaard microscoop met epifluorescentie apparatuur of met een confocale microscoop. Maak opnamen met een geschikte camera. Voor sommige foto&#39;s, draai de fluorescentie contrast om donkergele schepen op een lichte achtergrond geven (figuur 5 en 6). </li></ol> 5 Bepaling van de Regionale Vessel Density in de culturen <ol><li> Kwantificeren van de vessel dichtheid gebaseerd op schip kruisingen zoals beschreven in referentie 8. </li><li> Gebruik plakjes gekleurd voor laminin voor deze metingen. Superponeren opgenomen beelden van 10x vergroting met een 6 x 6 rooster, waarbij elk rooster is gelijk aan 100 x 100 micrometer per vierkante, totale gebied van 0,25 mm 2. </li><li> Overlay drie van dergelijke roosters in de CA1, CA3, DG en EG (Figuur 2). De vaartuigen die de lijnen van het raster te tellen. </li><li> Voor het behalen van resultaten met een goede statistische relevantie, maken metingen in minstens 3 onafhankelijke experimenten, elk met gegevens uit 3 muis pups met 3 plakjes per muis pup. </li><li> Bepaal de gemiddelde waarde van het vaartuig overtochten van de netten voor elke regio en het uitvoeren van een statistische analyse met ANOVA met Bonferroni correctie als post hoc-test (p &lt;0,05 gedefinieerd als significant) met behulp van geschikte statistische software. </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two%3A+modeling+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurol+J%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li>
<li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures%3A+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li>
<li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4%2C+GDNF%2C+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li>
<li>Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+%E2%80%98ischemia%E2%80%99+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li>
<li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice%3A+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li>
<li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li>
<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG) uitgevoerd en werden beoordeeld en toegestaan ​​door de Zwitserse autoriteiten. De auteurs hebben niets te onthullen.

Met de hier beschreven werkwijzen kunnen hippocampale organotypische slice cultures worden gebruikt als een veelzijdige tool kunststof veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging. Terwijl organotypische slice cultures in het verleden gebruikt voor het bestuderen van neuronale reacties na ischemie 6, 7 de nieuwe aspect van de gelijktijdige onderzoek van vasculaire veranderingen verbetert aanzienlijk de mogelijke toepassingen van deze methode. De inductie van OGD of hypoxie kan met vrij eenvoudige...

Het centrale zenuwstelsel is bijzonder gevoelig voor verlies of vermindering van zuurstof en glucose levering door de vasculatuur. Zelfs een vrij korte onderbreking van de bloedtoevoer naar de hersenen kan een permanent verlies van functie van het betreffende hersengebieden die tot de typische beroerte syndromen veroorzaken. Naast de neuronaal verlies in de primaire getroffen gebieden, is er meestal extra vertraagde neuronale verlies door secundaire schade. Helaas heden geen neuroprotectieve behandeling voor de vermindering van secundaire neuronale dood beschikbaar 1. Onderzoeksinspanningen voor het bestuderen van de mechanismen van secundaire schade afhankelijk van het gebruik van dierlijke modellen van cerebrale ischemie, zoals midden cerebrale slagader occlusie en diverse trombotische occlusie technieken (voor een recent overzicht zie 2). Parallel, ook als gevolg van beperkingen en ethische bezwaren met gebruik van diermodellen, organotypische slice cultuur van verschillende CNS weefsels gebruikt dat de stu toestaandy van neuronale reacties op verschillende soorten verwondingen 3-5. Voor het bestuderen van de neuronale reactie onder omstandigheden die ischemische hersenschade na te bootsen, is het modelsysteem zuurstof glucosedeprivatie (OGD) ontwikkeld. In dit model worden slice cultures tijdelijk blootgesteld aan een medium dat glucose mist en is geëquilibreerd met stikstofgas in afwezigheid van zuurstof. Met een dergelijke behandeling is het mogelijk om neuronaal letsel en schade die vrij vergelijkbaar met die waargenomen na ischemisch letsel in vivo 6, 7 induceren. In de hippocampus, een dergelijke behandeling induceert specifiek neuronaal verlies in het CA1, maar niet in de CA3 gebied of de dentate gyrus van de hippocampus. In tegenstelling, de studie van vasculaire reacties slice cultures nu toe niet op grote schaal uitgevoerd. Een voor de hand liggende reden is het gebrek aan circulatie en bloedvat perfusie in de slice cultuur-model. Wij hebben echter eerder aangetoond dat het mogelijk is b handhavenlood schepen in CNS slice culturen voor meerdere dagen 8, 9. Het algemene doel van deze methode is om niet alleen toezicht houden op de lot van neuronen na OGD maar de studie uit te breiden tot het lot en de herinrichting van het vaatstelsel dat een belangrijk deel van de schade respons. Tot nu toe dergelijke studies het gebruik van dierproeven hebben geëist (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al, 2001.). In de hier gepresenteerde protocol, we detail hoe deze studies kan op entorhino-hippocampale organotypische slice cultures uitgedaagd ofwel met hypoxie of door excitotoxische laesies gevolgd door analyse van zowel neuronale overleving en bloedvaten reacties. Dit protocol is gebaseerd op een eerder gepubliceerde studie hierover 10 en kan nuttig zijn voor een laboratoriumtest vindt het neurovasculaire interacties in het CZS.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>gestabiliseerde vorm van L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaërobe strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodide oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaal anti-laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-muis 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-muis 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-konijn 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-konijn 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistieken software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain weefselsnijder</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxiekamer</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

de analyse van neurovascular verbouwing in entorhino-hippocampus organotypische slice culturen

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemisch hersenletsel is een van de meest voorkomende en verwoestende omstandigheden afbreuk goede werking van de hersenen en leidt vaak tot blijvende functionele tekorten in de getroffen patiënten. Ondanks intensief onderzoek is er nog steeds geen effectieve behandeling optie die neuronale schade vermindert en beschermt neuronen in de ischemische gebieden van vertraagde secundaire dood. Onderzoek op dit gebied omvat gewoonlijk het gebruik van ingewikkelde en problematische diermodellen. Entorhino-hippocampus organotypische slice culturen uitgedaagd met zuurstof en glucose deprivatie (OGD) gevestigd zijn in vitro modellen die cerebrale ischemie na te bootsen. Het nieuwe aspect van deze studie is dat veranderingen in de hersenen bloedvaten bestudeerd naast neuronale veranderingen en de reactie van zowel neuronale compartiment en het vasculaire compartiment kan worden vergeleken en gecorreleerd. De in dit protocol de werkwijze van de mogelijke toepassingen van de substantieel te verbreden ofganotypic slice cultuur aanpak. De inductie van OGD of hypoxie kan met vrij eenvoudige middelen in organotypische slice cultures worden toegepast en leidt tot betrouwbare en reproduceerbare schade in neuraal weefsel. Dit staat in schril contrast met de ingewikkelde en problematische dierproeven inducerende beroerte en ischemie in vivo. Door verbreding van de analyse voor de studie van de reactie van het vaatstelsel nieuwe manieren over hoe om te behouden en te herstellen de hersenfuncties zou kunnen bieden omvatten. De slice cultuur aanpak hier gepresenteerd zou kunnen ontwikkelen tot een aantrekkelijk en belangrijk instrument voor de studie van ischemisch hersenletsel en kan nuttig zijn voor het testen van potentiële therapeutische maatregelen gericht op neuroprotection zijn.

Zuurstof glucose ontbering en hypoxie induceert neuronale dood en vermindering van bloedvaten met name in de hippocampus CA1 regio. OGD of zuurstof-deprivatie alone gedurende 15 minuten induceerde een sterke inductie van celdood zoals gezien door propidium iodide kleuring specifiek in het CA1 gebied van de hippocampus (figuur 3) hetzelfde als hiervoor 7 beschreven. Met markers het netwerk van bloedvaten te visualiseren, werd vastgesteld dat bloedvat dichtheid en organisatie ve...

Een protocol voor entorhino-hippocampus organotypische slice culturen, die het mogelijk maakt het reproduceren vele aspecten van ischemisch hersenletsel, wordt gepresenteerd. Door het bestuderen van veranderingen in de neurovasculatuur naast veranderingen in de neuronen, dit protocol is een veelzijdig gereedschap plastic veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging.

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Het algemene doel van deze procedure is om tegelijkertijd veranderingen in neuronen en bloedvaten te bestuderen in een weefselkweekmodel van ischemische hersenbeschadiging. Dit wordt bereikt door eerst enter rhino hippocampal slice cultures op te zetten. De tweede stap is om ischemische hersenbeschadiging na te bootsen door de culturen bloot te stellen aan hypoxische omstandigheden.De laatste stap is om neuronale overleving en vasculaire veranderingen te analyseren en te correleren. Uiteindelijk wordt een in vitro-aanpak op basis van organische hippocampale slice-cultures gebruikt om de complexe interacties tussen neuronen en de vaatwand onder ischemische omstandigheden te tonen. Het grote voordeel van deze techniek is dat na een hypoxische uitdaging neuronale overleving en veranderingen in bloedvaten gelijktijdig kunnen worden bestudeerd in een slice-kweekmodelsysteem.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van neuro-ischemie, zoals het onthullen van de complexe interacties tussen neuronen en vaatwand en de ischemische omstandigheden. Om te beginnen, bereid enter rhino hippocampal organotypische slice-cultures voor van postnatale dag van muispo

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De organoptypic hippocampus slice cultuur-model is...

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan ​​om een ​​interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.

Organotypische hippocampus Slice culturen

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

We beschrijven een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen van de muis forebrain. Bovendien, we laten zien hoe deze sensor gebruiken voor dynamische beeldvorming van cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten.

Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk

Hier beschrijven we de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Onder een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum, deze plakken verbeelden evoluerende epileptische-achtige gebeurtenissen en kan worden beschouwd als een ex vivo model van epileptogenese. Dit systeem is een uitstekend hulpmiddel voor het monitoren van de dynamiek van spontane activiteit, evenals voor het beoordelen van de progressie van neuro-inflammatoire kenmerken gedurende de loop van...

Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen

In dit artikel bieden we een reproduceerbare methode om organotypische plakjes ruggenmerg te genereren en te onderhouden die zijn getransplanteerd met neurale stamcellen als een ex vivo-model voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën.

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Leer neurovasculaire veranderingen analyseren in entorhino-hippocampale orgaanspecifieke sliceculturen. Deze methode maakt gelijktijdige studie van neuronale overleving en vaatveranderingen na ischemisch hersenletsel mogelijk.

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Meer video's verkennen