Calcium-imaging in neuronen

Calcium-imaging is een uiterst nuttige techniek voor het onderzoeken van de diverse rollen die calciumionen spelen in functionerende neuronen. Calciumionen genereren een veelvoud aan intracellulaire signalen die sleutelfuncties aansturen, zoals de afgifte van neurotransmitters vanuit synaptische blaasjes. Calcium-imagingmethoden maken directe meting mogelijk van de dynamische calciumflux binnen neuronen en neuraal weefsel. Deze video geeft een overzicht van hoe calciumindicatorkleurstoffen werken, hoe een calcium-imagingexperiment wordt uitgevoerd en bespreekt tot slot enkele toepassingen van deze techniek.

Laten we eerst de biochemische principes van calciumindicatorstoffen herhalen.

Calciumindicatorstoffen zijn gemodificeerde chelator-moleculen, zoals Fura-2, die zijn opgebouwd uit twee hoofdonderdelen. Het eerste is de chelatorplaats die calcium op een selectieve manier bindt. Het tweede is een fluorescentieplaats die licht uitzendt op een specifieke golflengte wanneer deze wordt bestraald met een excitatiegolflengte van ultraviolet licht.

De binding van calcium aan de kleurstof verandert de fluorescentie eigenschappen, wat een manier biedt om veranderingen in de calciumconcentratie te kwantificeren; dit wordt hier weergegeven door het verschil in fluorescentie-intensiteit die door dit neuron wordt uitgezonden bij twee verschillende excitatiegolflengten.

De meeste calciumindicatorstoffen zijn verder gemodificeerd om ze in staat te stellen het celmembraan gemakkelijk te passeren en worden ofwel toegevoegd aan de bath-oplossing met de neuronen, of geïnjecteerd in hersenweefsel voor studies aan het hele dier.

Sommige kleurstoffen hebben dubbele excitatie- of emissie-eigenschappen, afhankelijk van of calcium gebonden is of niet. Neem bijvoorbeeld de kleurstof Fura-2, die een andere excitatiegolflengte heeft wanneer calcium gebonden is in vergelijking met wanneer dat niet het geval is. Door de ratio van de emissie-intensiteit bij de twee excitatiegolflengten te bepalen, kan een veel nauwkeurigere schatting van de calciumconcentratie worden gemaakt.

Kleurstoffen met dubbele excitatie of emissie, zoals Fura-2, worden ratiometrische calciumindicatoren genoemd. Er bestaan ook niet-ratiometrische kleurstoffen met enkele excitatie- en emissiegolflengten. Deze zijn echter gevoeliger voor fotobleken, wat de verzwakking of het verlies van fluorescentie is bij langdurige blootstelling aan licht.

Een cruciale stap voordat een kleurstof in een experiment wordt gebruikt, is het kalibreren van de fluorescentiemetingen van de kleurstof met oplossingen van bekende calciumconcentraties. Hierdoor kunnen wetenschappers de intracellulaire calciumconcentraties nauwkeurig schatten op basis van de gemeten emissie-intensiteiten tijdens de experimenten.

Nu we hebben geleerd hoe calciumindicatoren werken, gaan we onderzoeken hoe calciumflux in geplaatste neuronen kan worden gevisualiseerd.

Begin met het klaarmaken van de gekozen calciumindicator-kleurstof, zoals Fura-2, en meng deze met aanvullende fysiologische oplossingen. Vortex de oplossing om een goede menging te waarborgen. Breng de oplossing, zodra deze voldoende is gemengd, over in een schaal. Plaats nu het dekglas met de gekweekte neuronen in de schaal met de kleurstofoplossing. Incubeer de neuronen vervolgens in het donker gedurende de vereiste tijd bij de juiste temperatuur, wat in dit geval 30 minuten bij 37 ˚C is. Breng het dekglas na de incubatieperiode over naar een schaal zonder kleurstof.

De volgende stap is het monteren van het dekglas op de beeldkamer van de microscoop. Sluit na montage de toevoerlijn van het perfusiesysteem aan en vul de kamer langzaam. Bevestig de kamer aan de objecttafel van de microscoop en installeer de afvoerlijnen voor de perfusie, zodat een continue stroom door het perfusiesysteem wordt gewaarborgd.

Nu de objecttafel van de microscoop gereed is, worden de neuronen in focus gebracht met behulp van zichtbaar licht. Test de kleurstof door de cellen te belichten bij golflengten van 340 en 380 nm. Denk eraan dat bij Fura-2 niet-geactiveerde neuronen meer licht zouden moeten emitteren wanneer ze worden geëxciteerd bij 380 nm, aangezien calcium niet is gebonden.

Pas vervolgens de camera-instellingen aan om het dynamische bereik te optimaliseren voordat het experiment begint. Leg bij elke golflengte een beeld vast en gebruik daarna de region of interest- of ROI-tool om de achtergrondintensiteit bij elke golflengte te meten. Voer de achtergrondwaarden in de besturingssoftware in, zodat deze van opeenvolgende beelden kunnen worden afgetrokken.

Zodra de initiële opstelling is voltooid, kiest u de vijf of zoveel gezichtsvelden die tijdens het experiment moeten worden gefotografeerd en slaat u de coördinaten op in de besturingssoftware. Tijdens het experiment beweegt de automatische tafel naar een veld, registreert een ratio van de veldintensiteit bij golflengten van 340 en 380 nm, en gaat door naar het volgende veld totdat alle velden zijn geregistreerd.

In sommige experimenten wordt een farmacologische stof aan de perfusievloeistof toegevoegd die veranderingen in de intracellulaire calciumspiegels veroorzaakt. Een oplossing met een hoog kaliumgehalte, die neuronen depolariseert, kan ervoor zorgen dat de intracellulaire calciumconcentratie stijgt, zoals te zien is in deze timelapse-serie beelden, en dient als een goede positieve controle. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, volgt de analyse.

Om de resultaten te analyseren, selecteert u met behulp van de software regions of interest die neuronen of delen van neuronen bevatten. Gebruik vervolgens de software om de ratiometrische intensiteitsinformatie van beide golflengten bij elke ROI in alle verzamelde beelden te meten. Met deze informatie kan een kwantitatieve beoordeling worden gemaakt van de veranderingen in de intracellulaire calciumconcentraties in de loop van de tijd.

Nu u begrijpt hoe calcium-imaging in neuronen wordt uitgevoerd, bekijken we enkele manieren waarop deze waardevolle methode tegenwoordig in het onderzoek wordt toegepast.

In de eerste plaats wordt calcium-imaging gebruikt om te onderzoeken hoe de intracellulaire calciumconcentratie fluctueert in relatie tot de neurale activiteit.

In deze studie werden individuele neuronen gevuld met een calciumindicator-kleurstof terwijl er patch-clamp registraties werden uitgevoerd. De nauwkeurige controle van het membraanpotentiaal die door de patch-clamp techniek mogelijk wordt gemaakt, biedt inzicht in de dynamiek van de calciumstroom.

Calcium-imaging stelt onderzoekers in staat om de sterk synchrone netwerkactiviteit van neuronen te onderzoeken.

Hier gebruikten neurowetenschappers calcium-imaging om het fluorescentiesignaal van 40 neuronen te beoordelen. Met deze informatie kunnen netwerkeigenschappen, zoals signaalvoortplanting en neurale correlaties, worden bepaald.

Calciumdynamiek kan ook onthullen hoe neuronen signalen uit de buitenwereld, zoals geuren, verwerken.

In dit experiment werden feromoon-waarnemende organen, geëxtraheerd uit een muizenneus, in cultuur gekweekt. Neuronen binnen het weefsel werden geïncubeerd met Fura-2 en afgebeeld terwijl ze werden blootgesteld aan geurstoffen zoals urine of gezuiverde feromonen. Door de expressie van geurreceptorproteïnen in olfactorische neuronen te manipuleren, is het mogelijk om direct te visualiseren hoe een enkel eiwit de eigenschap van een cel beïnvloedt om te reageren op unieke geuren.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over calcium-imaging in neuronen bekeken. In deze video hebben we de eigenschappen achter de techniek besproken en een typisch experiment beoordeeld.

Gezien de vele belangrijke rollen van calcium, zal calcium-imaging een essentieel instrument blijven voor het begrijpen van neuronen en hoe zij met elkaar interacteren.

Bedankt voor het kijken!