Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Het algemene doel van deze procedure is om de relatieve veranderingen in het niveau van een eiwit bij Centrosomen onder verschillende omstandigheden te kwantificeren. Bijvoorbeeld, op een specifiek punt in de celcyclus na remming van het proteasoom, dit wordt bereikt door eerst cellen die op deksels groeien te behandelen met ofwel de proteasoomremmer MG een 15 of met de controleoplossing DMSO. Vervolgens wordt onmiddellijk BRDU toegevoegd aan beide cellen en worden ze gedurende vier uur in een celcultuurincubator geïncubeerd.

De tweede stap is om de deksels over te brengen naar een 24-wellplaat om de cellen te fixeren. Vervolgens worden de cellen gekleurd met antilichamen tegen BRDU en de eiwitten van belang, en vervolgens met corresponderende secundaire antilichamen. De laatste stap is om afbeeldingen van BRDU-positieve cellen te verkrijgen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en digitale beeldvormingssoftware om identieke belichtingstijd en Z-aslengte toe te passen op cellen uit elk monster.

Vervolgens worden de afbeeldingen geanalyseerd om het relatieve niveau van romal VDA C3 te kwantificeren. Uiteindelijk wordt kwantitatieve immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om te tonen dat de Centrosomale pool van VDA C3 verdubbelt wanneer het proteasoom wordt geremd tijdens de S-fase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals flowcytometrie, immunoblotting of kwantitatieve microscopie, is dat deze techniek het relatieve romalniveau van het eiwit analyseert in twee verschillend behandelde monsters die op twee verschillende deksels worden verwerkt. Deze methode gebruikt normalisatie naar een interne standaard om de noodzaak te controleren om de twee experimentele celpopulaties te verwerken.

Afzonderlijk, hoewel deze methode inzicht kan geven in de regulatie van specifieke eiwitten bij centrosomen. Het kan ook worden toegepast op andere situaties zoals andere subcellulaire structuren of het onderzoeken van specifieke eiwitpools die op meerdere locaties binnen de cel worden aangetroffen. Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door schu majumder, een postdoc uit mijn laboratorium. Om het experiment te beginnen, passeer asynchrone groeiende RPE een cellen twee keer 10 tot de vijfde in eerder voorbereide 35 millimeter schotels met deksels en laat de cellen groeien in twee milliliter volledig medium.

Vervang het kweekmedium elke 24 uur met vers voorverwarmd medium Na 44 uur. Vervang het kweekmedium met compleet medium dat 0,05%DMSO of MG een 15 bevat met een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar, en voeg gelijktijdig BRDU toe aan de cellen met een uiteindelijke concentratie van 40 micromolar. Incubeer de cellen gedurende vier uur. Vervolgens wordt elke deksel overgebracht naar een 24-wellplaat.

Voeg 500 microliter vooraf gemaakt methanol toe aan elke put en incubeer de plaat bij min 20 graden Celsius om de cellen te fixeren. Na 10 minuten, spoel de deksels onmiddellijk drie keer met 500 microliter wasbuffer. Incubeer de gefixeerde cellen op deksels in 200 microliter blokkeringsbuffer gedurende 30 minuten terwijl de cellen worden geïncubeerd.

Maak een bevochtigde kamer klaar door een nat papieren handdoek in de onderste helft van een lege 1000 microliter pipettentipbox te plaatsen. Leg een strook parfum op het rekoppervlak en voeg een druppel van 20 microliter van de konijn anti V DDA drie en muis anti gamma tubuline antilichaam, verdund in blokkeringsbuffer, toe aan het parfum. Na het blokkeren, draai een deksel om op elke druppel antilichaamoplossing.

Zorg ervoor dat de cellen ondergedompeld zijn en sluit het deksel van de tipbox. Incubeer de cellen met primaire antilichamen gedurende de nacht bij vier graden Celsius in de bevochtigde kamer. Draai de deksels opnieuw om en breng ze terug naar de 24.

Was de deksels in een schaal, en incubeer ze vervolgens in een oplossing van 150 microliter secundaire antilichamen, verdund in blokkeringsbuffer, gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na incubatie, spoel de deksels drie keer met wasbuffer. Fixeer de gekleurde RPE een cellen met 500 microliter methanol gekoeld bij min 20 graden Celsius. Nadat de cellen 10 minuten zijn gefixeerd, spoel ze drie keer met wasbuffer.

Incubeer vervolgens de cellen in 200 microliter twee normale HCL gedurende 30 minuten. Neutraliseer de cellen bij kamertemperatuur met 300 microliter een molair tris CL pH acht, en spoel de cellen drie keer. Blokkeer de cellen met 200 microliter blokkeringsbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Na het blokkeren, incubeer de cellen met rat anti BRDU antilichaam en blokkeringsbuffer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius in de bevochtigde kamer. Breng de deksels terug naar de 24. Was de cellen.

Incubeer ze vervolgens met secundair antilichaam verdund in 150 microliter blokkeringsbuffer. In een 24-wellplaat gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de deksels drie keer met een XPBS spot, een druppel van zes microliter van een montageoplossing die Antifa-reagens bevat op een glazen microscoop.

Keer een deksel om met de celzijde naar beneden op de montageoplossing. Druk met een zacht schoonmaakdoekje voorzichtig op het deksel om overtollige vloeistof te verwijderen en verzegel het deksel op de microscoop. Plak het deksel vast met nagellak langs de rand van het deksel.

Gebruik een 100 x plan APO olie-immersieobjectief met een numerieke opening van 1,4 om de afbeeldingen van BRDU-positieve RPE een cellen bij kamertemperatuur te verkrijgen. Bepaal het juiste bovenste en onderste brandvlak langs de Z-as met een stapgrootte van 0,2 micrometer en verwerf afbeeldingen langs de Z-as. Voer vervolgens deconvolutie uit van alle beeldstacks die langs de Z-as zijn verkregen.

Verkrijg de totale intensiteitsprojectie van elk beeld. Stapel langs de Z-as voor cellen waarvan de centrosomen zijn gescheiden door minder dan twee micrometer. Teken een klein vierkant van 20 tot 30 pixels per zijde rond beide centrosomen en markeer het geselecteerde gebied.

Tek