Name: Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer stereologische en flowcytometrische karakterisering van myeloidale cellen in muizenhersenen na cerebrale ischemie. Deze methoden combineren kwantitatieve en kwalitatieve analyse voor nauwkeurige celtypering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Spaanse Ministerie van Economie en Concurrentievermogen CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) en RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), en van de Lokale Regering van Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) en S2010/BMD-2349 (IL). IB en MIC zijn fellows van het Spaanse Ministerie van Economie en Concurrentievermogen.

<ol><li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+after+trauma%3A+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods%3A+the+optical+disector+and+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li>
<li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke%3B+a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Circulation%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li>
<li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174(2011).</li>
<li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li>
<li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li>
<li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung%3A+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li>
<li>Hernández-Jiménez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li>
<li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li>
<li>García-Yébenes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+overload%2C+measured+as+serum+ferritin%2C+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li>
<li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent%2C+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPAR%CE%B3+Agonist+Rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li>
<li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De cerebrale ischemie model hier geïntroduceerd geeft zeer reproduceerbare infarct volumes bepaald 24-48 uur en 7 dagen na MCA ligatie door verschillende benaderingen 8,15,17. Dit MCAO model heeft een lage sterftecijfer (minder dan 1%) in vergelijking met anderen, het minimaliseren van het aantal dieren dat in studies. Een cruciale stap om deze lage sterfte te verkrijgen is om de juiste aseptische omstandigheden te handhaven voor infecties die overleven, kunnen gevolgen na een beroerte inductie te voorkomen. Dit MCAO model kan niet alleen worden gebruikt als permanent MCAO model, die als klinisch relevant model voor translationeel onderzoek 18, maar ook als tijdelijke voorbeeld door voorbijgaande ligatie van het CCA en MCA met een schuifknoop en achterste reperfusie op het gewenste tijdstip 19. Deze werkwijze is met succes gebruikt bij muizen en ratten 17,20. Al deze gegevens blijkt dat MCAO door ligatie is een hoog veelzijdige model van cerebrale ischemie met meerdere toepassingen. Een critical stap van deze techniek is dat het invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop vereist; de craniotomie moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om niet aan het jukbeen bot en beschadigen als het MCA. Echter, het gebruik van sham dieren (die is onderworpen aan de chirurgische procedure maar CCA en MCA ligatie niet uitgevoerd) een nuttig hulpmiddel voor chirurgie-afhankelijke effecten discrimineren. De omvang van hersenletsel na deze techniek kunnen worden met verschillende methoden. Onze protocol van hersenen snijden, Nissl kleuring en daaropvolgende schatting van het volume Cavalieri maakt een nauwkeurige kwantificering van het beschadigde gebied en minimaliseert het aantal muizen gebruikt in dit type studies aangezien seriële hersencoupes kan ook worden gebruikt voor verschillende immunohistochemische analyse. Voor een betere prestatie van deze methode, is het essentieel om de juiste parameters in de stereology software te kiezen (tabel 1) die nodig zijn voor het schatten the volume van de verschillende regio&#39;s van de formule: V = 1 / ssf * a f * t * i zp (Ssf het segment steekproeffractie, t de gemiddelde dikte van de secties, een f het gebied van de rasterafstand en zp het aantal punten raken van de structuur). Het distale MCAO door ligatie kan nuttig zijn om het geïnfiltreerde leukocyten en immuuncellen subpopulaties 8,13 die aan het ontstekingsproces na hersenletsel 1-4 karakteriseren. Hier stellen we twee verschillende methodes voor de hersenen immuun cel karakterisering, een precieze stereological aanpak en een flowcytometrische analyse voor een betere karakterisering van meerdere leukocyten subpopulaties. Gebruikmakend seriële hersenen snijden, kan de kwantificering van het totaal aantal neutrofielen worden bereikt door de optische fractioneerinrichting werkwijze 16 die het totale aantal cellen schattingen van het aantal cellen bemonsterde witha Systematische aselect verzameld (SRS) set van onpartijdige virtuele tellen ruimtes die de gehele regio van belang, in ons geval het infarct gebied, met uniforme afstand tussen onpartijdige virtuele tellen ruimtes in richtingen X, Y en Z. Deze methode biedt een nauwkeurig instrument om schatten totale aantal neutrofielen in de ischemische hersenen op verschillende tijdstippen na ligatie. Hoewel niet getoond in deze studie, kan dit protocol worden gebruikt voor de schatting van de verschillende subpopulaties neutrofielen na ischemie 21 en een nauwkeurige kwantificering van elke andere celpopulatie die in de ischemische hersenen zoals andere geïnfiltreerde leukocyten (monocyten / macrofagen) en ook voor het schatten overlevende neuronen of voor neurogenese kwantificering na een beroerte. De belangrijkste stap voor een nauwkeurige schatting van het gewenste gebied is de selectie van de geschikte parameters, zoals die aangegeven zijn in tabel 3 voor neutrofielen kwantificering in het ischemische gebied.Deze parameters worden gebruikt voor de stereology software om de totale positieve cel aantal (N) te berekenen met de volgende formule N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- is het totale aantal cellen geteld met de fractioneerinrichting, SSF is het gedeelte steekproeffractie, asf is het steekproeffractie gebied, en TSF is de steekproeffractie dikte) 5. Hoewel deze methode is langzamer dan andere kwantificatietechnieken (bijvoorbeeld analyse van neutrofielen markers door mg weefsel, densitometrie van representatieve beelden of het aantal neutrofielen per veld), heeft het voordeel een neutrale en een vaste techniek die een nauwkeurig bepaald te zijn kwantificering van celaantallen. De hersenen leukocyten isolatie aanpak maakt een gelijktijdige identificatie en kwantificering van verschillende subtypen van immuuncellen zonder vertekening het systeem in vivo kleuring of genetische manipulaties. Latere celsortering van de gekarakteriseerde myeloïde populations of hun immunomagnetische scheiding kan worden gebruikt voor meerdere stroomafwaartse toepassingen, zoals verdere studies op gen- of eiwitexpressie. De nauwkeurige karakterisering van neutrofielen, monocyten en microglia verkregen met deze methode een hoge specificiteit met betrekking tot bestaande werkwijzen zoals immunohistochemische studies, een voordeel waardoor het specifieke opdrachten aan de verschillende myeloïde cellen die hersenen aangeboren immuunrespons mediëren. Bovendien kan het verder worden uitgebreid naar andere hersendelen populaties te karakteriseren met het geschikte label, zoals het bloed macrofagen (CD11b + CD45 hi CD68 +) en kan worden toegepast voor de studie van andere CNS aandoeningen of letsels. Daarom verschaft deze techniek een essentieel instrument om de heterogeniteit van de ontstekingsreactie in de hersenen verkennen. Een belangrijke beperking van deze techniek zich op de bereiding van de leukocyten suspensies verse hersenweefsel, die wegactivering toestand van de cellen of hun antigeen wijziging. Hoewel deze techniek maakt een meer gedetailleerde kwalitatieve karakterisering vergelijking immunohistochemische studies biedt een minder nauwkeurige kwantificering basis van celisolatie. Desondanks wordt het rendement van onze celisolatie protocol is vergelijkbaar met andere gepubliceerde methoden 9 en efficiënt worden gebruikt om verschillen in het aantal hersenen immuuncellen tussen controle en MCAO groepen of zelfs tussen MCAO groepen aan verschillende behandelingen 8 detecteren. Kritische stappen van dit protocol zijn de weefsel dissectie, het weefsel verstoring procedure, en de myeline verwijderen. Ten aanzien van het weefsel collectie, kan een normalisering stap worden opgenomen (door weging van het weefsel verzameld) om de variabiliteit te voorkomen als gevolg van verschillende dissectie optredens. Bovendien kan normalisatie verschillende MCAO groepen ook optreden door infarct volume (tevoren door magnetische Resonance). Een andere manier om dit probleem op te lossen is om de gehele ipsilaterale hemisfeer van zowel ischemische en controlegroepen gebruikt, of zelfs de contralaterale hemisfeer van de ischemische muizen als controle om het aantal gebruikte dieren te minimaliseren. Deze aanpak vermijdt verschillen tussen elke sectie, heeft een nadeel; een verdunningsfactor wordt toegevoegd door het verhogen van het totale aantal cellen, maar niet het aantal myeloïde cellen die uitsluitend in de kern en peri-infarct gebied van de ipsilaterale cortex. Wat weefselverstoring dit protocol illustreert de stappen van de mechanische verbreking van hersencellen, vermijden enzymatische behandelingen en oppervlakteantigeen wijziging 9,22, een essentiële kwestie voor verdere kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de inflammatoire cel subpopulaties voorkomen. In aanvulling op de voorbereiding van de celsuspensie van belang, myeline verwijdering uit de hersenen monsters is een sterk aanbevolen stap om interferentie met downst voorkomenriem toepassingen, zoals immunomagnetische scheiden van cellen of flowcytometrie 23,24. Dit kan worden bewerkstelligd op verschillende manieren, zoals sucrose of Percoll gradiënten, of anti-myeline kralen. Hier, en op basis van eerdere studies die verschillende methoden voor de hersenen celsuspensie isolatie, mechanische verbreking in combinatie vergelijken met Percoll gebruik myeline verwijderen wordt gebruikt om cellen opbrengst verbeteren en de levensvatbaarheid 25.

Morfologische, fenotypische en genexpressie veranderingen van microglia, en extravasatie en activering van hematogene macrofagen en neutrofielen worden verondersteld een belangrijke rol spelen bij de pathofysiologische cascade na hersenletsel 1-4. Dit protocol geeft twee benaderingen schatting het aantal verschillende myeloïde cel subsets van de ischemische hersenen en hun fenotypische karakterisatie voeren. Daarnaast beschrijft ook een experimenteel model van cerebrale ischemie in muizen, die bestaat uit de tijdelijke of permanente ligatie van beide distale midden cerebrale slagader (MCA) en de gemeenschappelijke halsslagader (CCA), inclusief hoe het infarct evalueren Door de nauwkeurige Cavalieri methode waarbij een stereological software. De eerste benadering myeloïde cel subsets karakteriseren van de ischemische hersenen een stereological basis van de optische fractioneerinrichting benadering 5. Dit is de meestveelgebruikte stereological sonde in life sciences en biedt een hoge mate van precisie met lage coëfficiënten van fouten 5-7. Dit is de beste keuze voor mobiele kwantificering wanneer het weefsel wordt gesneden in secties, zoals het voorkomt de bias op mobiele schatting omwille van de versnippering van het weefsel in secties. Deze methode is een zeer krachtige manier om cijfers, dynamiek en fenotypische veranderingen geïnfiltreerd neutrofiel subpopulaties van het ischemische weefsel 8 karakteriseren. De tweede karakterisering benadering is gebaseerd op een gemodificeerd protocol van Campanella en medewerkers 9, die op een eenvoudige manier hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie bepaald. In tegenstelling tot conventionele immunohistochemische technieken, flowcytometrie karakterisering maakt onderscheid tussen microglia (CD45 lo CD11b +) en geïnfiltreerd myeloïde cellen (CD45 hi CD11b +) op basis van hun diffErent expressie van CD45 9-13. Bovendien, pro-inflammatoire monocyten (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), neutrofielen (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) en andere leukocyten subsets van het ischemische weefsel te onderscheiden. Deze aanpak zorgt voor een betrouwbare en snelle test om neuroinflammation beoordelen in experimentele modellen van de hersenen ischemie. Echter, Weefselbewerkingswerkwijze de activeringstoestand en nummers van de verschillende celpopulaties in het ischemische weefsel die een semi-kwantitatieve karakterisering beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>Photonic Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Temp Controller&nbsp;</td><td>Panlab&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Stainless Steel Burrs</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Suture 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Suture 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Surgical material</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td>570681</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>Lab material</td></tr><tr><td>Cresyl violet acetate</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Microscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>XYZ motorized computer stage and controller</td><td>Ludl electronics Products</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Stereo Investigator System</td><td>Microbrightfield</td><td>Version 7.003 software</td><td>Software</td></tr><tr><td>5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Lab Material</td></tr><tr><td>Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>Lab material</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifugue</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Lab Material</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, human and mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD45-PE, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, mouse</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4-color</td><td>BD</td><td>342975</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Software</td><td>BD</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

stereological en flowcytometrie karakterisering van leukocytsubpopulaties in modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activatie en extravasatie van hematogene macrofagen en neutrofielen, wordt aangenomen dat het een belangrijke rol in spelen hersenletsel na een beroerte. Deze myeloïde cel subpopulaties kunnen verschillende fenotypes en functies weer te geven en worden onderscheiden en worden gekenmerkt om hun regelgeving en de bijdrage tot weefselschade te bestuderen. Dit protocol biedt twee verschillende methoden voor de hersenen immuun cel karakterisering: een nauwkeurige stereological aanpak en een flowcytometrische analyse. De stereological benadering is gebaseerd op de optische fractioneerinrichting methode, waarbij het totale aantal cellen berekent in een gebied van belang (infarct hersenen) geschat door systematisch steekproefsgewijs. De tweede kwalificatie aanpak is een eenvoudige manier om hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie, waardoor de karakterisering van microglia, geïnfiltreerd monocyten en neutrofielen van het ischemische weefsel. Daarnaast ook dIJZE een cerebrale ischemie model in muizen die uitsluitend van invloed op de hersenen cortex, het genereren van zeer reproduceerbare infarcten met een lage sterfte, en de procedure voor de histologische bewerking hersenen om infarctvolume karakteriseren door de Cavalieri methode.

De cerebrale ischemie model hier genereert infarcten uitsluitend waargenomen in de cortex zonder dat de striatale weefsels aangezien de lenticulostriatal takken van de MCA dat het striatum irrigatie niet afgesloten (figuur 1). Door Nissl kleuring, kan het beschadigde gebied worden geïdentificeerd als een hypochrome corticaal gebied (Figuur 2). Dit model wordt gekarakteriseerd door zeer reproduceerbare infarct volumes bij 24 uur na MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) geraamd Cavalieri werkwijze Nissl-gekleurde coupes (figuur 2). Schatting van het infarct volume Cavalieri werkwijze een nauwkeurige benadering met een lage fout die wordt weerspiegeld in de coëfficiënt van fouten (CE) van Gundersen in de contralesional en ipsilesional hemisferen en in het infarctgebied (tabel 2). Beschadigde volume weefsel kan worden uitgedrukt in mm3, maar ook als% IH met de formule in de sectie 3.2.13. Bovendien, de schattingvan het totale volume van de ipsilesional en contralesional regio maakt de berekening van oedeem index het infarct volume corrigeren en een overschatting van het beschadigde weefsel (tabel 2) te vermijden. Gezien de seriële snijden verwerking van het hersenweefsel, kan deze worden benut om een nauwkeurige schatting van het totale aantal cellen subpopulaties voeren, zoals geïnfiltreerd neutrofielen, in het ischemische gebied, de optische Fractionator benadering (figuur 3 en tabel 4) met Tabel 3 parameters. Dit protocol schat totaal aantal neutrofielen (Ly6G-positieve cellen) in het infarctgebied van 23.328 ± 3623 op 24 uur en 82.856 ± 8.143 48 uur bij muizen na pMCAO (Figuur 3D). In overeenstemming met eerdere studies, is infiltratie van neutrofielen rechtstreeks gecorreleerd met de grootte van het infarct (figuur 3E). Schatting van tHij aantal neutrofielen door de optische Fractionator werkwijze een nauwkeurige benadering een lage fout die wordt gereflecteerd door de CE van Gundersen (tabel 4). De leukocyten isolatie en flowcytometrie karakterisering protocol maakt de isolatie van 47.922 ± 23.174 myeloïde cellen van de cortex van de ipsilesional halfrond van ischemische muizen. Deze bestaat 10-30% van het totale gebeurtenissen in de celsuspensie. De meeste gevangen gebeurtenissen met dit protocol met een lage parameter FSC, geassocieerd met cellulaire resten (figuur 4). CD11b kleuring blijkt dat CD11b + cellen een hogere FSC waarde (figuur 4), wat suggereert dat celresten niet is gelabeld met deze marker en, zoals eerder aangegeven, dat verder onderzocht door de FSC drempel 200 9 kunnen worden uitgesloten. De variabele hoeveelheid celresten verkregen met deze methode suggereert dat verschillen bij monster procesing (timing, behoud weefsel, temperatuur van het monster, efficiënte myeline verwijdering, etc.) kunnen verklaren. Bovendien wordt het gebruik van cel zeven ook nodig om de aanwezigheid van cellulaire klemmen in de monsters te voorkomen; Deze stap moet worden gedaan voorafgaand aan de cel kleuring. De gating strategie in de figuur 5 die is gebaseerd op CD11b en CD45 expressie, kunnen we onderscheid tussen verblijvende en geïnfiltreerd myeloïde cellen in het ischemische weefsel. Deze CD11b + bevolking toeneemt in de ischemische hemisfeer in vergelijking met naïeve en de sham groep, waarbij deze cellen meestal geassocieerd met een lage expressie van CD45 aangeeft dat microglia wordt prolifererende na ischemie (Figuur 4, Figuur 5 en Tabel 5) . Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan infiltratie van de periferie, zoals blijkt uit het optreden van een CD11b + CD45 hi cellen subpopulatie in de ischemische hersenen (Figuur 4, Figuur 5 en Tabel 5), dat lage aantal in naïef en in schijnvertoning hersenen. De bijdrage van infiltraten aan de CD11b + celpopulatie in de hersenen ischemie is een zeer dynamisch proces 4. In de MCAO model van ligatuur kan variëren van 30% tot 60% van de totale CD11b + cellen afhankelijk van de grootte van de laesie en het tijdstip waarop de karakterisering gedaan. Neutrofielen, gekenmerkt door Ly-6G + cellen, de meest talrijke geïnfiltreerde celpopulatie vinden op 24 uur na MCAO in de ischemische hersenen van muizen met dit model van cerebrale ischemie, zij omvatten de 70-80% van de CD11b + CD45 hi. De overige cellen zijn meestal een subpopulatie van CD11b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi pro-inflammatoire monocyten. In dit model, zal deze populatie in aantal te verhogen in de ischemische hersengebieden 24-48 uur na MCAO. Figuur 1:. Chirurgische procedure voor de MCA ligatie (A) na het terugtrekken van de temporale spier, wordt een kleine craniotomie uitgevoerd in de muis schedel. MCA wordt geligeerd door een knoop of een slipknot met behulp van een 9/0 hechtdraad. (B) Vertegenwoordiger beelden van de corticale laesie gegenereerd door de MCAO model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figuur 2: Kwantificering van infarctvolume door Cavalieri. (A) Vertegenwoordiger beelden van Nissl-gekleurde hersensecties 24 uur na permanente MCA ligatie. De hoge vergroting toont de hipocromatic gebied na Nissl vlekken dieidentificeert na MCAO het beschadigde gebied (kern). De peri-infarct (PI) regio wordt ook getoond. (B) Kwantificering van het infarct volume weergegeven als% Geïnfarceerde halfrond (% IH) met behulp van de Cavalieri methode in seriële Nissl-gekleurde coupes, 24 uur na MCAO (n = 50 muizen ). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figuur 3: Stereologische kwantificering van neutrofielen in het infarctgebied 24 en 48 uur na ligatie met de optische Fractionator methode. (A) representatief beeld van geïnfiltreerde neutrofielen (Ly6G-positieve cellen) in het ischemische gebied op 24 uur na MCAO. Afbakening toont het infarctgebied. (B, C) ​​Voorbeelden van een optische dissector voor neutrofielen kwantificering door de optische fractioneerinrichting. (D) Kwantificering van totaal neutrofielen in het geïnfarceerde gebied 24 en 48 uur (n = 4 muizen). (E)Correlatie van het aantal neutrofielen met de grootte van het infarct op 24 en 48 uur na MCA ligatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figuur 4:. Representatieve dot-plot scatter analyse van hersenen leukocyten verkregen uit naïeve, sham en ischemische (24 uur na MCAO) hemisferen op basis van fysische parameters (SSC en FSC) Een populatie van gebeurtenissen die CD11b (rood) tot expressie werd geïdentificeerd in alle groepen. Deze populatie werd afgesloten en gekenmerkt volgens de expressie van CD45. Cellen die lage niveaus van CD45 (groen) waren aanwezig in de ischemische en niet-ischemische cortex en kwam overeen met microgliale cellen. Daarentegen cellen die hoge niveaus van CD45 (geel) alleen werdengevonden in de ischemische halfrond en in mindere mate in sham-groep. Nadere analyse van de CD11b + CD45 hi bevolking geeft aan dat neutrofielen (Ly-6G + cellen, blauw) en pro-inflammatoire monocyten (Ly-6C hi cellen, oranje) zijn de belangrijkste celsubpopulaties gevonden in de hersenen infiltreert 24 uur na een beroerte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figuur 5:. Gating strategieën inwoner van geïnfiltreerd myeloïde cellen differentiëren in het ischemisch weefsel CD11b + cellen werden eerst gated volgens isotype fluorescentie-intensiteit (A). Een vertegenwoordiger dot plot van cel suspensies van de ischemische hersenen wordt weergegeven in de up-rechterbovenhoek van het paneel. InBovendien typische waarden voor het totaal aantal gebeurtenissen en het aantal CD11b + gebeurtenissen verkregen met deze techniek is getoond (aantal cellen / ischemische hersenen halfrond. (A) CD45 fluorescentie intensiteit analyse van het CD11b + cellen wordt getoond in panel B. Een vertegenwoordiger puntdiagram analyse van CD45 en CD11b uitdrukking van de gated CD11b + subpopulatie wordt weergegeven in de up-rechterbovenhoek van het scherm. Bovendien is de typische aantal CD45 lo CD45 hi cellen verworven per ischemische hersenhelft gebruik van deze techniek weergegeven (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parameters die worden gebruikt voor Cavalieri methode </td></tr><tr><td> Sectie Dikte (t) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objectief </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Slice steekproeffractie (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Afstand tussen de secties </td><td> 600 pm </td></tr><tr><td> Rasterafstand </td><td> 100 pm </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Parameters voor stereological kwantificering van het infarct weefsel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Resultaten </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarct </td></tr><tr><td> Area (μm²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volume Gecorrigeerd voor Meer dan Projectie (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0.017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van Error (Gundersen), alpha (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Geïnfarceerde halfrond </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Brain Oedeem (Ips Vol / Cont Vol) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Representatieve voorbeelden van contralesional, ipsilesional en infarct volumes door de Cavalieri methode met behulp van de Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td coloverspanning = &quot;2&quot;&gt; Parameters gebruikt voor de optische fractioneerder </td></tr><tr><td> Sectie Dikte (TSF) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objectief </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Slice steekproeffractie (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Counting Frame Hoogte </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Counting Frame Breedte </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Maat X raster </td><td> 230 micrometer </td></tr><tr><td> Maat X raster </td><td> 230 micrometer </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> Optische Disector Hoogte </td><td> 14 micrometer </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Parameters gebruikt voor de stereological kwantificering van geïnfiltreerd neutrofielen na hersenen ischemie met de optische fractioneerinrichting sonde met behulp van de Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Schatting van neutrofielen door de Optical Fractionator </td></tr><tr><td> Aantal Sampling sites </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Vorm Factor </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Totaal markers Geteld </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Geschatte Neutrofielen door Optical Fractionator </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Representatief voorbeeld van de geschatte geïnfiltreerd neutrofielen na hersenen ischemie met de Optical Fractionator sonde met behulp van de Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Neutrofielen </td><td> Monocyten </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> Naïef </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19,012 ± 1523 </td></tr><tr><td> Sham 24 hr </td><td> 24.563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 hr </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4.874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1.345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabel 5: Representatieve resultaten van de geschatte myeloïde cellen na hersenen ischemie met de Flow cytometrie aanpak.

Brain myeloïde cellen karakterisatie volgende slag kan worden uitgevoerd door stereology de optische fractioneerinrichting methode of een flowcytometrische analyse van hersenen leukocyten suspensies. Beide zijn nuttige technieken om een ​​nauwkeurige fenotypische onderscheiding van de belangrijkste myeloïde cel subsets in de ischemische hersenen voeren.

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Het algemene doel van deze procedure is om muis myeloïde celsubpopulaties van de ischemische hersenen te karakteriseren door middel van twee verschillende methodologieën. Eerst wordt een permanent model van cerebrale ischemie geïntroduceerd door het occluderen van zowel de gemeenschappelijke halsslagader of CCA en de distale stam van de middelste hersenslagader of MCA, waardoor een infarct ontstaat dat voornamelijk de hersenschors aantast. Vervolgens wordt voor de stereologische kwantificering van de myeloïde celsubpopulaties, seriële coronale secties van de hersenen immuno gekleurd voor de cellen van belang, en vervolgens worden de geïnfiltreerde cellen gekwantificeerd door de optische fractionator benadering.Alternatief kunnen de myeloïde cellen worden geïsoleerd uit vers hersenweefsel door mechanische dissociatie, en vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Uiteindelijk kan een nauwkeurige kwantificering en gedetailleerde kwalitatieve karakterisering van de specifieke myeloïde celsubpopulaties die de muizenhersenen infiltreren na cerebrale ischemie worden bereikt door stereo kwantificering en multiparametrische flowcytometrie respectievelijk. Het belangrijkste voordeel van dit seriële ischemie model boven andere bestaande is dat onze techniek een significant lagere mortaliteitsgraad heeft dan andere methoden waardoor het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek wordt geminimaliseerd.Dit gebied is een methode die kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het beroerteveld, zoals wat zijn de rollen van micro reactivatie, extravasatie van hematogene macrofagen of neutrofielen in hersenletsel? Ze nauwkeurige theologische kwantificering op de multiparametrische cytometrie benaderingen gedemonstreerd in dit papier kunnen inzicht geven in het aantal fenotype en functie van de myeloïde cellen populatie in zowel de aangeboren immuunrespons naar CE ischemie. Om de CCA eerst te ligeren, maak een snede van één centimeter rond de ventrale oppervlakte van de hals van het dier onder een chirurgische microscoop.Eenmaal gedissected, gebruik een zes nul nylon naald om de linker CCA te occluderen met een permanente knoop om de distale MCA te ligeren. Maak vervolgens een horizontale incisie op de temporale spier van rechts naar links. Maak dan een tweede verticale incisie op de rechterzijde van de temporale spier.Zorg ervoor dat u de temporale ader niet snijdt. Trek de temporale spier uit elkaar van de schedel en houd hem vast met een naald om een schone schedeloppervlakte te behouden. Reinig vervolgens de schedel met koud steriel zoutje om de exacte positie van de linker MCA via schedeltransparantie te detecteren.Eenmaal de MCA is geïdentificeerd, gebruik een roestvrij stalen boor om een ronde craniotomie van één millimeter in de frontale kwab uit te voeren tussen de jukboog en het squamale bot. Verwijder voorzichtig de schedel om de MCA bloot te leggen. Gebruik vervolgens een negen nul nylon naald om de linker MCA in de distale stam te occluderen net voor de bifurcatie tussen de frontale en achterste MCA takken met een permanente knoop.Om de hersenen te verwijderen, onthoofd de geëuthaniseerde muis net boven het ruggenmerg en maak een achterste anterieure incisie in de huid om de schedel bloot te leggen. Maak vervolgens twee laterale sneden bij de verbinding van de laterale wanden en de basis van de schedel en verwijder het kleine stukje bot. Maak vervolgens een snede door de schedel langs de sagittale naad en gebruik een pincet om de schedel bovenliggende elk halfrond te verwijderen om de hersenen bloot te leggen.Gebruik een spatel om de hersenen van de schedel te scheiden en breng ze over in een 4% PFA oplossing. Na drie uur, verwijder de PFA en incubeer de hersenen in een 30% sucrose oplossing om de hersenen te cryo beschermen. Na 48 uur, verwijder de sucrose oplossing en bevries de hersenen snel in negentig veertig graden Celsius isopentaan en gebruik vervolgens een vriesmicrotoom om 30 micrometer coronale hersensecties te maken.Verzamel 10 seriële sets in een cryo conserveringsoplossing. Elke seriële set bestaat uit ongeveer 14 tot 16 coronale plakken met een afstand tussen de plakken van 300 micrometer. Om voldoende bemonstering van de muizenhersenen tussen 1,94 en negentig 2,46 posterieure ten opzichte van de bgma te garanderen om het totale aantal geïnfiltreerde neutrofielen te schatten.Na MCA occlusie door een optische fractionator immunokleuren eerst de neutrofielen met de rat anti LY zes G antistof en de juiste secundaire antistof op drijvende secties door conventionele immunofluorescentietechniek. Monteer vervolgens de hersensecties op super frosts microscoopglazen met het infarcteerde gebied aan de rechterkant en open de stereo onderzoeker software. Klik vervolgens op het menugereedschap seriële sectiebeheer en voeg een nieuwe sectie toe met de nieuwe sectieknop.Stel het evaluatieinterval in op 10 voor een monsterfractie van één tiende plak. Selecteer vervolgens vanuit het contourdown menu de infarcteerde gebied contour tool. Teken een contour om het infarcteerde gebied onder de 10 x objectief af te bakenen.Schakel vervolgens over naar het 100 x objectief op de microscoop en onder het objectiefmenu. Om de neutrofielen onder het probes menu te kwantificeren, selecteer nu de optische fractionator en stel de XY plaatsing van de telframes in op 230 voor zowel de X als Y rastergroottes. Selecteer nu de neutrofiel knop van de markeringsbalk en markeer de gekleurde neutrofielen in het infarcteerde gebied.Exporteer de resultaten van de kwantificering naar een spreadsheetbestand om de hersenen te dissociëren in een enkele cel suspensie. Nadat de hersenen zijn verwijderd zoals net gedemonstreerd, dissecteer de kern en per infarct gebieden van de ipsilaterale cortex uit de hersenen van een muis met hersenischemie. Weeg het hersenweefsel en plaats het in vijf milliliter ijskoud RPMI per oproep voor normalisatie tussen de experimentele groepen, en gebruik vervolgens een weefselmolen met Teflon kolven om het weefsel te dissociëren in een enkele cel suspensie.Breng de cel suspensies over in een 50 milliliter ultracentrifugebuis en voeg vijf extra milliliters RPMI per oproep oplossing toe aan de monsters. Centrifugeer vervolgens de cel suspensies gedurende 30 minuten bij 7.

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.

Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Cerebrale perfusie controle is aangetoond dat de nauwkeurigheid van ischemische beroerte modellen te verbeteren. Technische moeilijkheden beperken vaak het gebruik van dit essentieel instrument voor cerebrovasculaire onderzoek. In deze video wordt een geoptimaliseerd systeem getoond op een of meerdere locaties hemodynamische bewaking verkrijgen tijdens intraluminale middelste cerebrale slagader occlusie in ratten.

Geoptimaliseerde Systeem voor cerebrale perfusie Monitoring in het Rat Stroke Model van intraluminale midden cerebrale slagader occlusie

Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Modellen voor trombo-embolische beroertes zijn essentiële hulpmiddelen voor het optimaliseren van de recanalisatietherapie. Hier beschrijven we een muismodel voor trombotische beroerte gebaseerd op een tijdelijk cerebraal hypoxisch-ischemisch (tHI) letsel, dat trombose en infarct veroorzaakt en gunstig reageert op weefselplasminogeenactivator (tPA)-gemedieerde fibrinolyse in een therapeutisch venster vergelijkbaar met dat bij beroertepatiënten.

Een Trombotische Stroke model op basis van Transient Cerebrale hypoxie-ischemie

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Dit protocol beschrijft het gebruik van flowcytometrie om de veranderingen in de samenstelling van immuuncellen, het cytokineprofiel en het chemokineprofiel in de pulmonale omgeving te identificeren na voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader, een muizenmodel van ischemische beroerte.

Karakterisering van immuuncellen en pro-inflammatoire mediatoren in de pulmonale omgeving

Om de immuunrespons op hersenaandoeningen te onderzoeken, is een veelgebruikte benadering het analyseren van veranderingen in immuuncellen. Hier worden twee eenvoudige en effectieve protocollen gegeven voor het isoleren van immuuncellen uit muizen hersenweefsel en schedelbeenmerg.

Het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en de schedel van muizen

Hier presenteren we een protocol om de immuuncelfunctie na een ischemische beroerte te beoordelen met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van neuro-immuuninteracties mogelijk en kan worden aangepast voor het bestuderen van andere neurodegeneratieve ziekten, waardoor ons begrip van immuunresponsen bij beroertepathologie wordt vergroot.

Isolatie en flowcytometrische beoordeling van neuro-immuuninteracties in een mini-beroerte muizenmodel

Leer stereologische en flowcytometrische karakterisering van myeloidale cellen in muizenhersenen na cerebrale ischemie. Deze methoden combineren kwantitatieve en kwalitatieve analyse voor nauwkeurige celtypering.

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie (Video) | JoVE Journal

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Meer video's verkennen