Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Het algemene doel van deze procedure is om muis myeloïde celsubpopulaties van de ischemische hersenen te karakteriseren door middel van twee verschillende methodologieën. Eerst wordt een permanent model van cerebrale ischemie geïntroduceerd door het occluderen van zowel de gemeenschappelijke halsslagader of CCA en de distale stam van de middelste hersenslagader of MCA, waardoor een infarct ontstaat dat voornamelijk de hersenschors aantast. Vervolgens wordt voor de stereologische kwantificering van de myeloïde celsubpopulaties, seriële coronale secties van de hersenen immuno gekleurd voor de cellen van belang, en vervolgens worden de geïnfiltreerde cellen gekwantificeerd door de optische fractionator benadering.

Alternatief kunnen de myeloïde cellen worden geïsoleerd uit vers hersenweefsel door mechanische dissociatie, en vervolgens gekleurd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Uiteindelijk kan een nauwkeurige kwantificering en gedetailleerde kwalitatieve karakterisering van de specifieke myeloïde celsubpopulaties die de muizenhersenen infiltreren na cerebrale ischemie worden bereikt door stereo kwantificering en multiparametrische flowcytometrie respectievelijk. Het belangrijkste voordeel van dit seriële ischemie model boven andere bestaande is dat onze techniek een significant lagere mortaliteitsgraad heeft dan andere methoden waardoor het aantal dieren dat nodig is voor het onderzoek wordt geminimaliseerd.

Dit gebied is een methode die kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het beroerteveld, zoals wat zijn de rollen van micro reactivatie, extravasatie van hematogene macrofagen of neutrofielen in hersenletsel? Ze nauwkeurige theologische kwantificering op de multiparametrische cytometrie benaderingen gedemonstreerd in dit papier kunnen inzicht geven in het aantal fenotype en functie van de myeloïde cellen populatie in zowel de aangeboren immuunrespons naar CE ischemie. Om de CCA eerst te ligeren, maak een snede van één centimeter rond de ventrale oppervlakte van de hals van het dier onder een chirurgische microscoop.

Eenmaal gedissected, gebruik een zes nul nylon naald om de linker CCA te occluderen met een permanente knoop om de distale MCA te ligeren. Maak vervolgens een horizontale incisie op de temporale spier van rechts naar links. Maak dan een tweede verticale incisie op de rechterzijde van de temporale spier.

Zorg ervoor dat u de temporale ader niet snijdt. Trek de temporale spier uit elkaar van de schedel en houd hem vast met een naald om een schone schedeloppervlakte te behouden. Reinig vervolgens de schedel met koud steriel zoutje om de exacte positie van de linker MCA via schedeltransparantie te detecteren.

Eenmaal de MCA is geïdentificeerd, gebruik een roestvrij stalen boor om een ronde craniotomie van één millimeter in de frontale kwab uit te voeren tussen de jukboog en het squamale bot. Verwijder voorzichtig de schedel om de MCA bloot te leggen. Gebruik vervolgens een negen nul nylon naald om de linker MCA in de distale stam te occluderen net voor de bifurcatie tussen de frontale en achterste MCA takken met een permanente knoop.

Om de hersenen te verwijderen, onthoofd de geëuthaniseerde muis net boven het ruggenmerg en maak een achterste anterieure incisie in de huid om de schedel bloot te leggen. Maak vervolgens twee laterale sneden bij de verbinding van de laterale wanden en de basis van de schedel en verwijder het kleine stukje bot. Maak vervolgens een snede door de schedel langs de sagittale naad en gebruik een pincet om de schedel bovenliggende elk halfrond te verwijderen om de hersenen bloot te leggen.

Gebruik een spatel om de hersenen van de schedel te scheiden en breng ze over in een 4% PFA oplossing. Na drie uur, verwijder de PFA en incubeer de hersenen in een 30% sucrose oplossing om de hersenen te cryo beschermen. Na 48 uur, verwijder de sucrose oplossing en bevries de hersenen snel in negentig veertig graden Celsius isopentaan en gebruik vervolgens een vriesmicrotoom om 30 micrometer coronale hersensecties te maken.

Verzamel 10 seriële sets in een cryo conserveringsoplossing. Elke seriële set bestaat uit ongeveer 14 tot 16 coronale plakken met een afstand tussen de plakken van 300 micrometer. Om voldoende bemonstering van de muizenhersenen tussen 1,94 en negentig 2,46 posterieure ten opzichte van de bgma te garanderen om het totale aantal geïnfiltreerde neutrofielen te schatten.

Na MCA occlusie door een optische fractionator immunokleuren eerst de neutrofielen met de rat anti LY zes G antistof en de juiste secundaire antistof op drijvende secties door conventionele immunofluorescentietechniek. Monteer vervolgens de hersensecties op super frosts microscoopglazen met het infarcteerde gebied aan de rechterkant en open de stereo onderzoeker software. Klik vervolgens op het menugereedschap seriële sectiebeheer en voeg een nieuwe sectie toe met de nieuwe sectieknop.

Stel het evaluatieinterval in op 10 voor een monsterfractie van één tiende plak. Selecteer vervolgens vanuit het contourdown menu de infarcteerde gebied contour tool. Teken een contour om het infarcteerde gebied onder de 10 x objectief af te bakenen.

Schakel vervolgens over naar het 100 x objectief op de microscoop en onder het objectiefmenu. Om de neutrofielen onder het probes menu te kwantificeren, selecteer nu de optische fractionator en stel de XY plaatsing van de telframes in op 230 voor zowel de X als Y rastergroottes. Selecteer nu de neutrofiel knop van de markeringsbalk en markeer de gekleurde neutrofielen in het infarcteerde gebied.

Exporteer de resultaten van de kwantificering naar een spreadsheetbestand om de hersenen te dissociëren in een enkele cel suspensie. Nadat de hersenen zijn verwijderd zoals net gedemonstreerd, dissecteer de kern en per infarct gebieden van de ipsilaterale cortex uit de hersenen van een muis met hersenischemie. Weeg het hersenweefsel en plaats het in vijf milliliter ijskoud RPMI per oproep voor normalisatie tussen de experimentele groepen, en gebruik vervolgens een weefselmolen met Teflon kolven om het weefsel te dissociëren in een enkele cel suspensie.

Breng de cel suspensies over in een 50 milliliter ultracentrifugebuis en voeg vijf extra milliliters RPMI per oproep oplossing toe aan de monsters. Centrifugeer vervolgens de cel suspensies gedurende 30 minuten bij 7.