Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om efficiënt geïnduceerde pluripotente stamcellen of IPSC te genereren vanuit celculturen afkomstig uit urine van patiënten met spierdystrofie, en dit via een integratievrije herprogrammeringsmethode. Dit wordt bereikt door eerst urinemonsters te verzamelen van patiënten met spierdystrofie. In een tweede stap worden de urinecellen geïsoleerd en uitgebreid tot urine-afgeleide celculturen.

Vervolgens worden de urine-afgeleide cellen getransduceerd met Sendai-virus dat Yamanaka-factoren bevat en typische pluripotente kolonies ontstaan na 12 dagen. Uiteindelijk kan bij passage 13 de transgeenvrije toestand van de pluripotente stamcellen worden bevestigd door R-T-P-C-R-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de herprogrammering van geïsoleerde huidfibroblasten met behulp van lentivirale vectoren, is dat met deze techniek de somatische cellen niet-invasief van patiënten kunnen worden verkregen en gebruikt om efficiënt de IPC's te genereren met behulp van een zero footprint-methode van virale herprogrammering.

Deze methode kan helpen om sleutelvragen op het gebied van spierdystrofie te beantwoorden, zoals hoe deze aandoeningen in vitro kunnen worden gemodelleerd zonder veiligheidsbezwaren voor menselijk gebruik. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Mohammad Zishan Al, een postdoctoraal onderzoeker, Courtney Guesting, een technicus, en Melanie Ryder, een afstudeerstudente, allemaal uit mijn laboratorium. Om een urinemonster te verzamelen, adviseert u de patiënt om 30 minuten voor het verzamelen vloeistoffen te drinken om ervoor te zorgen dat ongeveer 30 tot 40 milliliter urine kan worden verzameld. Wanneer de patiënt klaar is, geeft u de patiënt een urineverzamelset die de volgende items bevat: schriftelijke instructies over hoe een steriele of schone opvang en monster vochtige antibacteriële toiletten te verkrijgen, en een 100 milliliter steriele specimenverzamelcup.

Wanneer het monster is verzameld, plaatst u de verzamelbeker onmiddellijk op ijs en brengt u het monster in een koelbox naar het laboratorium. Gebruik vervolgens steriele pipetten om het urinemonster over te brengen naar steriele 50 milliliter centrifugeerbuisjes en draai de buisjes 10 minuten bij 400 keer G op kamertemperatuur. Vervolgens aspireert u in een BSL twee biologische veiligheidscabinet alle oplosmiddelen behalve de laatste 1 milliliter, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.

Was vervolgens de cellen in zeven milliliter wasbuffer en centrifugeer de cellen opnieuw. Aspirier dit keer alle oplosmiddelen behalve de laatste ongeveer 0,2 tot 0,5 milliliter. Gebruik nu de pellet opnieuw in twee tot drie milliliter urine progenitor cel of UPC-medium en breng de suspensie over in vier tot zes putjes van een ongecoate 24-putjesplaat na 72 uur. Geef de cultuur aanvulling met 0,5 milliliter vers UPC-medium per putje.

Bewaak de cultuur gedurende vier tot zes dagen incubatie. Kleine kolonies van twee tot vier cellen van afgeronde of langwerpige cellen die type één of type twee nierepitheelcellen vertegenwoordigen, zouden moeten beginnen te verschijnen. Vervolg het verversen van het medium elke twee tot drie dagen.

Aangezien de kolonies een snelle expansiefase zullen ondergaan rond de negen tot vijftien dagen van de cultuur, moeten de cellen op dit moment 80 tot 90% confluërend zijn. Verdeel de cellen op twee tot vier putjes van een 24-putjesplaat voor verdere expansie. Markeer deze cultuur als celpassage één, de urinecellen kunnen vervolgens worden gekarakteriseerd op lijnspecifieke markers door middel van flowcytometrische analyse, immunohistologische kleuring of door omgekeerde transcriptase polymerasekettingreactie om een hoge efficiëntie herprogrammering te garanderen dagen voorafgaand aan de transductie, 60.000 cellen per putje. Van passage één tot vijf, kweek in twee putjes van een zes-putjesplaat op dag nul.

Bereid de Sendai herprogrammeringsvector voor door elk van de vier OSKM-factoren toe te voegen bij een geschikte MLI voor herprogrammering naar één milliliter voorverwarmd UPC-medium, aspireer het suspensiemedium en voeg langzaam de virussuspensie toe aan één putje van de urinecellen gedurende de volgende zes dagen. Vervang dagelijks het oplosmiddel door vers UPC-medium op dag vijf en plateer op dag zes mitomycine-zaadbehandelde MES op met gelatine gecoate 100 millimeter vierkante kweekschotels. Dissocieer de urinecellen met trypsine, suspendeer ze in UPC-medium en plateer ze bij vijf keer 10 van de vierde tot twee keer 10 van de vijfde cellen per meth feederplaat.

De volgende dag vervangt u het UPC-medium door humaan embryonaal stadium of HES-medium en bewaakt u de cellen onder een microscoop om de getransformeerde cellen rond de 12 tot 18 dagen te observeren. Na transductie moeten de cellen clonale aggregaten vormen met een karakteristieke mozaïekvormige morfologie en een hogere kern tot cytoplasmaverhouding. Om de geherprogrammeerde IPSC-klonen te identificeren, voert u levende celkleuring uit voor een TRA 180 1-antilichaam.

Gebruik vervolgens een 26 gauge halve inch naald om de TRA 180 1-positieve clonale aggregaten in vier tot zes kleine gelijke stukken per kloon over te steken. Gebruik vervolgens een steriele pipettentip om 10 tot 20 overgestreepte stukken van meerdere klonen te plukken en over te brengen naar elke put A 24-putjes matrigelkote plaat met HESC-medium, 24 tot 48 uur nadat de geherprogrammeerde klonen zijn geplateerd op het matrigelovervlak.

Vervang het medium door IPSC-medium. Gebruik een pipettentip om handmatig eventuele gedifferentieerde cellen of besmettende meth feeder-cellen te schrabben om de zuivering van de volledig geherprogrammeerde en pluripotente dystrofische IPSC-klonen te vergemakkelijken. Nadat de klonen ongeveer 100 micrometer groot zijn geworden, dissocieert u de cellen gedurende drie minuten met EDTA en plateert u vervolgens kleine celaggregaten van de geherprogrammeerde dystrofische IPSC, gesuspendeerd in IPSC-medium aangevuld met RO-kinase-remmer op een verse met matrigeel bedekte 12 folieplaat.

Bevestig tenslotte de pluripotentie van elke kloon