Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection
21 september 2014
-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.
Het algemene doel van deze procedure is om specifieke celpopulaties te isoleren uit het zich ontwikkelende cerebellum. Dit wordt bereikt door eerst cerebella te oogsten van neonatale muizen die fluorescente eiwitten dragen. De tweede stap van de procedure is om levende weefselsecties te verkrijgen met behulp van een vibrato.
De derde stap is om de externe germinale laag van het cerebellum te microdisseceren onder een fluorescente dissectiemicroscoop. De laatste stappen zijn om het weefsel te dissociëren in een enkele celsuspensie en cellen te verzamelen door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering. Uiteindelijk kunnen de resultaten aantonen dat specifieke celpopulaties uit het cerebellum kunnen worden geïsoleerd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals laser capture, microdissectie, is dat cellen levend zijn en kunnen worden gekweekt. Voor verder experimenteren Steriliseer voor deze procedure de chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf. Maak verse of opgewarmde 3% lage smeltaros klaar voor gebruik in een 37 graden Celsius waterbad.
Maak de vereiste oplossingen voor de papayan-gebaseerde celdissociatie. Bereid verse NBB 27 kweekmedia voor. Filter vervolgens, steriliseer en bewaar in een incubator.
Bereid de fax buffer voor en bereid de poly de lycine dekglasjes voor. Bekleed eerst autoclaaf dekglasjes met 100 microgram poly de lycine per milliliter steriel water. Bewaar vervolgens de dekglasjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius of een nacht bij kamertemperatuur.
Was later de dekglasjes met gedestilleerd water gevolgd door NBB 27 media voordat u de dekglasjes gebruikt. Droog ze volledig. Dit zal minimaal een uur duren voordat u begint.
Bereid eerst het dissectiegebied voor. Veeg het schoon met 70% ethanol. Bedek het vervolgens met een absorberend kussen.
Verwijder ten tweede de gereedschappen uit de sterilisatiezak en plaats ze voor gebruik. Laad vervolgens een schaal met ijskoud steriel DPBS met 1% pen strip en zet het op ijs. Dissecteer de hersenen van een P vier pup die fluorescente markers toont.
Breng het vervolgens over naar de voorbereide schaal met DPBS. Gebruik pincetten om het cerebellum voorzichtig te scheiden van de rest van de hersenen. Deze cerebella tonen de markers math een, GFP en nest in CFP waarbij de EGL GFP toont en de moleculaire laag positief is voor CFP.
Vul vervolgens een twee centimeter kubieke inbeddingsvorm met de agro-oplossing. Zorg ervoor dat deze niet warmer is dan 37 graden Celsius. Pak een cerebellum op met een geperforeerd lepel en demp het droog met een zacht tikken van weefsel.
Gebruik vervolgens pincetten om het in de mal te plaatsen. Gebruik een naald om de cerebella in verticale oriëntaties te brengen. Zodra er ongeveer vier in de mal zijn geladen.
Plaats de mal op ijs zodat deze snel zal stollen. Gebruik een scheermesje. Trim de blok om de sectieertijd te verkorten. Lijm vervolgens de blok op het plaatje zodat de cerebella verticaal staan.
Laad de vulbak met ijskoud DPBS met 1% pentriem en zet ijs onder de bak zodat deze koud blijft. Snijd nu de blokken met een vibrator. Snijd en verzamel 600 micron secties.
Verwijder ze van de ijsbak met een geperforeerd lepel en breng ze over naar een A-D-P-B-S gevulde schaal op ijs. Onder een fluorescente dissectiemicroscoop. Onderzoek de plakjes zo snel mogelijk.
Separeer voorzichtig de EGL van de rest van de cerebellaire sectie. Gebruik fijne pincetten om te dissecteren tussen de CFP-positieve moleculaire laag en de GFP-positieve EGL. Wees zeer voorzichtig tijdens microdissectie om besmetting van aangrenzende regio's te voorkomen.
Breng het GFP-positieve EGL-weefsel over naar een nieuwe DPBS-gevulde schaal op ijs. Vermijd het opnemen van enig moleculair laagweefsel, aangezien dit de cultuur zal besmetten met nestling expresserende Bergman-glia. Verwijder vervolgens de agro's rond het geïsoleerde EGL-weefsel.
De EGL kan nu worden gedissocieerd met behulp van een paan-gebaseerd protocol voor een enkele celsuspensie. Wanneer dit is voltooid, wordt de celsuspensie in fax buffer opgeschort. Ga verder met het verzamelen van de CFP-cellen met behulp van fax.
Sorteer ze met behulp van een hoge snelheid cytometer en een CFP-filter en trek ze in ijskoud fax buffer. Ongeveer 100.000 NPS zou per P vier cerebellum moeten worden verkregen. Centrifugeer vervolgens de gepoolde cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten.
Maak onmiddellijk gebruik van de cellen om ze te kweken. Suspendeer ze in voorverwarmd NBB 27 media. Laad ze vervolgens op de poly D lysine gecoate dekglasjes.
Cell bella-sneden werden bereid van P vier math een GFP nest in CFP muizen. Cerebellaire EGL bevatte voornamelijk GFP-expresserende GMP's en kon gemakkelijk worden gescheiden van de moleculaire laag verrijkt met CFP-expresserende glia. Facts-analyse toonde aan dat meer dan 85% van de cellen in de EGL conventionele GNP's waren. NEP's werden geïsoleerd uit de diepe delen van de EGL door microdissectie, gevolgd door facts.
Deze cellen vertegenwoordigden ongeveer 5% van de cellen in de EGL na vier dagen cultiveren. De door facts geïsoleerde NPS gaf aanleiding tot beta-tubuline-expresserende neuronen. Dit is kenmerkend voor lijnbeperkte neuronale voorlopercellen.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om snel te werken en het weefsel zoveel mogelijk op ijs te houden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van nestine-expresserende progenitors uit het zich ontwikkelende cerebellum van neonatale muizen. De techniek combineert microdissectie en fluorescent-geactiveerde celsortering om deze progenitors te zuiveren voor verder onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Nestine-expresserende progenitors zijn een nieuw geïdentificeerde populatie in het cerebellum.
- Inzicht in deze progenitors kan inzicht geven in neuronale ontwikkeling.
- Bestaande methoden voor celisolatie resulteren vaak in besmetting.
- Deze studie is gericht op het verbeteren van de zuiverheid van geïsoleerde celpopulaties.
Doel van het onderzoek
- Specifieke neuronale progenitorpopulaties isoleren uit het cerebellum.
- Verder experimenteren en analyseren van deze cellen mogelijk maken.
- Een techniek demonstreren die de cellevensvatbaarheid voor cultuur behoudt.
Gebruikte methoden
- Cerebella oogsten van neonatale muizen met fluorescente markers.
- Microdissectie van de externe germinale laag onder een fluorescente microscoop.
- Dissociatie van weefsel in een enkele celsuspensie.
- Fluorescent-geactiveerde celsortering om specifieke celpopulaties te verzamelen.
Belangrijkste resultaten
- Specifieke celpopulaties werden succesvol geïsoleerd uit het cerebellum.
- Meer dan 85% van de geïsoleerde cellen werd bevestigd als conventionele GNP's.
- NEP's werden geïsoleerd en vormden ongeveer 5% van de EGL-cellen.
- Geïsoleerde progenitors gaven aanleiding tot beta tubuline-expresserende neuronen.
Conclusies
- De methode maakt het mogelijk om levende neuronale progenitors te isoleren.
- Deze techniek kan het onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling verbeteren.
- Het behoud van weefsellevensvatbaarheid is cruciaal voor succesvolle celcultuur.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
