Name: Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer toxicologische testen voor het evalueren van epigenetische drug DZNep op ontwikkeling, vruchtbaarheid en overleving van malariamuggen. Deze methode helpt onderzoekers bij populatiebeheersing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Victor Marquez voor het leveren van DZNep.HCl en Scotty Bolling voor het vervaardigen van de bloodfeeders. De Mopti en SUA2La stammen van An. gambiae werden verkregen van het Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). Dit werk werd ondersteund door het Fralin Life Science Institute en de subsidie van National Institutes of Health 1R21AI094289 aan Igor V. Sharakhov.

OPMERKING: De drie delen van het protocol beschrijven waterige blootstelling van de DZNep geneesmiddel larvale muggen, een bloed gebaseerde blootstelling van DZNep volwassen vrouwtjes om het effect van vruchtbaarheid te bestuderen en SAH hydrolase remming door DZNep gemeten met een eenvoudige colorimetrische techniek. Een schematische weergave van deze testen wordt in figuur 1. 1. Onvolwassen Mosquito Ontwikkeling en Survivorship Testen OPMERKING: Dit gedeelte legt het gebruik van een in water oplosbaar geneesmiddel dat muggenlarven ontwikkeling en overleving beïnvloedt. <ol><li> Hatch A. gambiae eieren bij 28 ° C in gedestilleerd water (dH 2 O) en larven achter hen 2e instar. </li><li> Neem een zes-goed DNAse, RNAse vrij celkweekplaat en giet 10 ml dH 2 O aan elk putje. </li><li> Selecteer muggenlarven op 2e larvestadium en voeg 15 larven per well. Voor het toevoegen van larven 2 e instar tot het bord, put ze op een papieren handdoek voor 2-3 seconden om het overtollige water te verwijderen. </li><li> Label putten met kleurcode tapes aan experiment willekeurig. Label 2 waterputten per testconcentratie op elk bord (figuur 2). </li><li> Bereid een 1 mM DZNep hydrochloride (MW = 298,73) stock-oplossing door het oplossen van 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Voeg voorraadoplossing van DZNep.HCl gelabelde putjes tot een eindconcentratie van 0,5 uM en 5,0 uM. OPMERKING: De voorraad oplossing kan op 4 worden opgeslagen ° C voor de korte termijn (1 dag tot een maand) of -20 ° C voor lange termijn (langer dan een maand). OPMERKING: Toevoeging van de voorraadoplossing van bovengenoemde concentraties de hoeveelheid water niet veranderen in de putjes significant. Echter bij veel hogere concentraties, is het raadzaam om de verbinding oplossen in het larvale medium om onnodige verdunning van de verbinding te voorkomen. </li><li> Voeg gelijke hoeveelheid vlok visvoer aan elk putje. Bedek de plaats en incubeer ze op 28 ° C in een incubator. </li><li> Noteer de sterfte voor de DZNep-behandelde en onbehandelde larvale muggen na een 24-uur blootstelling periode. Verwijderen en eventuele dode larven weggooien. Herhaal deze opname elke dag tot alle larven sterven of verpoppen en naar voren als volwassenen. Noteer de grootte van larven om de dag, dat wil zeggen dag 0, 2, 4, 6, 8, totdat ze verpoppen. </li><li> Analyseer de larvale ontwikkeling en sterfte gegevens met behulp van een adequate statistische analyse software. OPMERKING: Een grafiek kan worden gebruikt om de sterfte in Microsoft Excel vertegenwoordigen. Multivariate Analysis of Variance (MANOVA) uitgevoerd met een software zoals JMP of SPSS zal onthullen indien verschillende doses van het geneesmiddel aanzienlijke verschillen in de overleving van muggenlarven. </li></ol> 2. Vruchtbaarheid Assay door het toedienen van drugs door middel van kunstmatige Feeder aan vrouwelijke muggen OPMERKING: Dit hoofdstuk beschrijft de toevoeging van het geneesmiddel aan het bloed van eennd dit naar volwassen vrouwelijke muggen met een kunstmatig voedingssysteem. <ol><li> Opgezet volwassen mug kooien met een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke muggen voor controle en testen kooi. Zorg voor 10% suikeroplossing gedrenkt in katoen ballen om zowel de kooien tot de vrouwtjes zijn klaar voor het voeden (3-5 dagen is optimaal voor Anopheles gambiae). </li><li> 2 uur voorafgaand aan het bloed te voeden, verwijder de katoenen ballen om ervoor te zorgen vrouwtjes hebben honger. </li><li> Monteer twee kunstmatig bloed feeders die bestaan ​​uit een omgekeerde brede onderzijde glazen trechter (diameter = 50 mm, lengte = 70 mm) en een omringende kunststof verzegeld met industriële lijm. Bevestig plastic buizen (diameter = 7 mm) tot twee uitgangen feeders &#39;(diameter = 10 mm) via aansluitingen voor in- en uitstroom van water. Label de twee feeders als &quot;Control&quot; en &quot;5 uM DZNep.&quot; </li><li> Met behulp van een in de handel verkrijgbaar verwarmingselement, het opzetten van het programma voor het voeden. In &quot;Menu&quot; ga naar &quot;Instellingen&quot;en selecteer &quot;streefwaarden&quot;; voorgeladen programma&#39;s zal verschijnen. Selecteer &quot;SP1&quot; en stel de temperatuur voor 37 ° C. OPMERKING: Het verwarmingselement zorgt ervoor dat het bloed toegediend wordt op een constante temperatuur. Aanvullend programma instellingen kunnen worden gebruikt voor verschillende muggen of insecten. </li><li> Vul een emmer met water en dompel het verwarmingselement in het water. </li><li> Knip een vierkant stuk Parafilm (50 mm x 50 mm) en rek het om een ​​dunne vliezige film te maken. Bedek de bodem van de kunstmatige feeders met Parafilm. Snijd een ander stuk van Parafilm (50 mm x 10 mm), strek het en sluit de randen van de feeders. </li><li> Monteer het systeem, waarop de feeders en verwarmingselement door de buizen. Eenmaal voltooid, schakelt het systeem in en selecteer &quot;SP1&quot;. Druk op &quot;Enter&quot; om het systeem te starten. OPMERKING: Het water wordt verwarmd naar 37 ° C en op die temperatuur gehouden. </li><li> Monitor the temperatuur van het water met behulp van een thermometer in het water emmer. OPMERKING: De aansluitingen en buizen helpen handhaven van een constante circulatie van het water door het systeem, zodat de temperatuur van het bloed bij 37 blijft ° C. </li><li> Vul een vlakke bodem dienblad met 10% bleekwater oplossing die zal worden gebruikt om geen bloed morsen te ontsmetten. </li><li> Voeg 2 ml bloed gedefibrilleerd schapen om een ​​microcentrifugebuis. Bestempelen dit als &quot;Control&quot;. Herhaal dit proces voor de experimentele buis gelabeld als &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 pi DZNep stockoplossing (zie stap 1.5) naar de experimentele buis met het label &quot;5 uM DZNep&quot; voorzichtig het bloed en drugs meng door het meerdere malen. Incubeer het buisje 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van een pipet, voeg 2 ml van de controle en testen van bloed naar de top van navenant gelabeld feeders. Gooi de pipet in de bleekwater oplossing. Bedek de kooi met een donkere zak en ademen lucht op kooi regelmatig om f te moedigenemales voor het voeden. </li><li> Laat de muggen voeden gedurende ongeveer 30 minuten. Zodra voeding is voltooid, schakelt het verwarmingselement, neem de feeders buiten en strip de Parafilm. Week de feeder in bleekwater oplossing voor ongeveer 5 minuten en spoel het goed in gedemineraliseerd water. </li><li> Verwijder de feeders en zet katoenen ballen met suiker water op de kooien voor 48 uur. Een ei schaaltje met water en filter papier in de kooi &#39;s nachts naar de eileg te vergemakkelijken. Label elke ei gerecht met de betreffende toets of de controle concentratie. </li><li> Verwijder het ei gerecht volgende dag en onderzoeken het aantal en de structuur van de eieren onder een stereo-microscoop. Verkrijgen van beelden met behulp van de Q-colors5 software. Tel het aantal eieren. Analyseer verschil in het aantal eieren verkregen uit testen en controle kooien. Opmerking: Een ongepaarde t-test kan worden gebruikt om te bepalen of het aantal eieren zijn significant verschillend (p ≤0.05). </li></ol> 3. Biochemische Assay van Mosquito enzymremmingdoor Drug OPMERKING: In dit gedeelte wordt enzymactiviteitsanalyse behulp DTNB als een indicator voor het effect van DZNep op SAH hydrolase remming bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muggen te bepalen. <ol><li> Bereid een 0,1 M Na 2 HPO 4 (dibasisch natriumfosfaat) door toevoeging van 14,19 g Na 2 HPO 4 tot 1 liter dH 2 O. Bereid vervolgens een 0,1 M NaH 2PO 4 (monobasisch natriumfosfaat) door toevoeging van 13,79 g NaH 2 PO 4 tot 1 liter dH 2 O. </li><li> Titreer 0,1 M Na 2 HPO 4 oplossing van 0,1 M NaH 2PO 4 tot pH 8,5. LET OP: Dit zal de werkvoorraad oplossing van 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) zijn. </li><li> Bereid een homogenisering oplossing van 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) door toevoeging van 0,3% Triton X-100. OPMERKING: De homogenisering oplossing kan bij 4 ° C worden bewaard </li><li> Prepare 1,6 mM SAH (MW = 384,4) oplossing door het oplossen van 6,15 mg SAB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Bereid een 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) oplossing door het oplossen van 6,3 mg DTNB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Houd de verse DTNB oplossing op ijs tot gebruik. </li><li> Bereid een 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) oplossing door het oplossen van 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Vervolgens verdunnen 1 mM DZNep oplossing in een reeks concentraties van 1,000 uM tot 0,002 uM in dH 2 O. </li><li> Om de SAH hydrolase remming door DZNep meten, bereiden een ruwe enzym extract van muggen: Meng 10 niet-bloed-gevoede volwassen muggen in 1 ml ijskoude 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), die 0,3% Triton X- 100, met een glazen weefselhomogenisator. Breng de homogenaat om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer het homogenaat gedurende 5 min bij 10.000 xg bij 4 ° C. Breng het supernatans een schone1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik de supernatant als enzymbron voor de SAH biochemische assay. </li><li> Voor de blanco behandelingen (dwz zonder DZNep, geen enzym), voeg 50 ul 1,6 mM SAH, 50 gl 1.6 mM DTNB en 100 gl 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aan de afzonderlijke putjes van een 96-well, vlakke bodem microplate. </li><li> Voor de controle (dat wil zeggen, geen DZNep), voeg 50 ul 1,6 mM SAH, 50 gl 1.6 mM DTNB, 50 pl 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) en 50 pi enzym (SAH hydrolase verkregen uit ruw extract) de persoon putten. </li><li> Voor DZNep behandelingen, voeg 50 ul 1,6 mM SAH, 50 gl 1.6 mM DTNB, 50 pi enzym en 50 gl geselecteerde DZNep concentratie afzonderlijke putjes. Bereid 4 herhalingen per behandeling en controle. </li><li> Lees de optische dichtheid (OD) van de SAB enzym monsters bij 405 nm gedurende 5 min bij 20 seconden interval met een 96 putjes microplaat reader. </li><li> Trek de lege OD van controle eennd behandeling OD verkregen van elk putje. Bereken het percentage resterende SAH hydrolaseactiviteit met behulp van de volgende vergelijking:% Resterend Activity = (Behandeling OD / Controle OD) x 100. </li></ol>

<ol><li>CDC Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/malaria">http://www.cdc.gov/malaria</a> (2010).</li>
<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+International+Journal+of+Organic+Evolution%22%5BJournal%5D)">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li>
<li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li>
<li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147(2009).</li>
<li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li>
<li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Direct%22%5BJournal%5D)">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless%2FdSetDB1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li>
<li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster%3A+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li>
<li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMA-1%2C+a+Mutant+p53+Reactivator%2C+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962(2014).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%2C+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase%2C+promotes+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li>
<li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40(2011).</li>
<li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).</li>
<li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li>
<li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+%28PRC2%29+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende stappen van vitaal belang voor de succesvolle toepassing van dit protocol. Voor het larvale assay, moet ervoor worden gezorgd dat de juiste labels en repliceren elke testconcentratie. Randomizing testmonsters en toevoegen van de aangegeven hoeveelheid geneesmiddel respectieve proefputjes is een belangrijk onderdeel van deze experimentele opstelling. Voor het toevoegen 2e mug instar larven een 96-well microplaat, kan elke larve op keukenpapier worden gezet gedurende 2-3 seconden om overto...

Malaria is verantwoordelijk voor het hoogste aantal insecten sterfgevallen in de wereld. Naar schatting 219 miljoen gevallen per jaar wereldwijd, resulterend in ongeveer 660.000 doden, voornamelijk in Afrika 1. Ondanks de gezamenlijke inspanningen, malaria programma&#39;s voor tal van uitdagingen. Terwijl insecticide behandelde muskietennetten en spuiten van insecticiden binnenshuis vorm belangrijke onderdelen van het programma, weerstand tegen insecticiden in de lokale bevolking belemmeren deze inspanningen 2. De snelle toename insecticide resistente muggen populaties is grotendeels toegeschreven aan het vermogen van de malariamuggen snel aanpassen aan veranderingen in hun omgeving en exploiteren verschillende niches 3,4,5. Om de bestaande mechanismen van resistentie tegen insecticiden te overwinnen, is de exploratie van nieuwe insecticide targets en de volgende generatie verbindingen gerechtvaardigd. Een eenvoudige stap-voor-stap protocol voor het bepalen van de werkzaamheid van experimentele insecticiden op de verschillende levensstadia van malaria mosquitoes aanzienlijk zou verbeteren deze inspanningen. Farmacologisch onderzoek van de effecten van geneesmiddelen op cellijnen en diermodellen hebben het gebruik van epigenetische drugs als een nuttig instrument voor het moduleren van de genetica en fysiologie van cellen en organismen vastgesteld. DNA-methylatie en histon-eiwitten zijn twee epigenetische mechanismen die genexpressie in meercellige organismen beïnvloeden zonder dat de onderliggende DNA-sequentie 6. Posttranslationele modificaties zoals methylering speelt een cruciale rol bij het ​​handhaven van cellulaire integriteit en genexpressie en invloed kunnen verscheidene fundamentele processen 7,8,9. Onderzoek in een aantal insectensoorten hebben het belang van epigenetica gemarkeerd in processen waarbij oögenese en stamcel onderhoud 10, evenals de dosering compensatie 11. Dergelijke aspecten ziektevectoren nog worden onderzocht. Met behulp van een verbinding om dit systeem in muggen moduleren kan ons voorzien inbezienswaardigheden in de roman insecticide doel paden. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) is een bekend histon-methylatie-remmer, die van invloed zijn op de verschillende vormen van kanker zijn bestudeerd 12,13,14,15,16. DZNep is een stabiele in water oplosbare epigenetische geneesmiddel dat indirect remt histon lysine N-methyltransferase (EZH2), een component van de Polycomb repressieve complex 2 (PRC2) in zoogdiercellen. PRC2 speelt een belangrijke rol in het reguleren van de groei van stamcellen in meercellige organismen en histon methylatie is een belangrijk aspect van de PRC2 gemedieerde silencing. Bij immuungecompromitteerde muizen werden cellen voorbehandeld met DZNep aangetoond minder tumorigene 17 zijn. Dit geneesmiddel wordt steeds gebruikt voor het bestuderen van andere ziekten, zoals niet-alcoholische vette leverziekte, waarin EZH2 betrokken is 18. DZNep is een gevestigde S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) hydrolase remmer 19, 20. De remming van SAH hydrolase resulteert in eenaccumulatie van SAH en op zijn beurt leidt tot de inhibitie van methyltransferase activiteit door beperking beschikbaar methyldonor groepen. SAH een aminozuurderivaat gebruikt door vele organismen, waaronder insecten in hun metabole routes. Een recente studie heeft aangetoond dat DZNep in lage doses kunnen diapause beïnvloeden en vertragen de ontwikkeling van insecten 21. Hier, een robuust protocol om de effecten van een in water oplosbare verbinding van verschillende levensstadia muggen onderzoeken ontwikkeld. De drie delen van dit protocol instructies omvatten voor het onderzoeken van de effecten van een in water oplosbare verbinding onvolwassen muggen, volwassen bloed voedende vrouwen en enzymactiviteit van volwassen mannelijke en vrouwelijke muggen. Eerste, DZNep wordt opgelost in water om onvolwassen mosquito ontwikkeling en overleving te bestuderen. Dit wordt uitgevoerd bij twee concentraties eventuele verschillen door 10-voudige toename in drug blootstelling vergelijken. Om het effect van het geneesmiddel op volwassen vrouwelijke muggen, DZNep verkennenwordt toegevoegd aan gedefibrilleerd schapen bloed en gevoed het bloed kunstmatig om vrouwtjes. Vervolgens wordt de uitkomst van het geneesmiddel op vruchtbaarheid onderzocht. Tenslotte wordt een enzymactiviteitsanalyse uitgevoerd met 5,5&#39;-dithiobis- (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) als een indicator van het effect van DZNep op SAH hydrolase inhibitoren op volwassen mannelijke en vrouwelijke muggen bepalen. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met een malariamug, Anopheles gambiae kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van de effecten van verbindingen van belang op een soort van muggen of andere insecten. De technieken die in dit protocol kan niet doeltreffend worden toegepast op een geneesmiddel met weinig of geen oplosbaarheid in water of waterige media.

<table><tbody><tr><td>96-well microplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>Een andere centrifuge kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Colored tape rolls</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Egg dish cups</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter papers</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Glass feeders</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating element</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>Een andere incubator kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 2&nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5&nbsp;ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH meter&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>bewaar bij -20 &#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

toxicologische testen voor testing effecten van een epigenetische drug ontwikkelingssamenwerking, vruchtbaarheid en survivorship van malariamuggen

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticide resistentie vormt een groot probleem voor malaria controleprogramma&#39;s. Muggen aan te passen aan een breed scala van veranderingen in de omgeving snel, waardoor malaria controle een alomtegenwoordig probleem in tropische landen. De opkomst van insecticide resistente populatie staat in voor de exploratie van nieuwe drug target paden en verbindingen voor vector mugcontrole. Epigenetische drugs zijn goed ingeburgerd in het onderzoek naar kanker, echter niet veel bekend is over de effecten ervan op insecten. Deze studie geeft een eenvoudig protocol voor de behandeling van de toxicologische effecten van 3-Deazaneplanocin A (DZNep), een experimentele epigenetische medicijn voor de behandeling van kanker, op de malaria vector, Anopheles gambiae. Een concentratie-afhankelijke toename in mortaliteit en afname in grootte werd waargenomen bij onvolwassen muggen blootgesteld DZNep, terwijl de verbinding verminderde de vruchtbaarheid van volwassen muskieten opzichte behandelingen controleren. Daarnaast was er een drug-afhankelijke afname in S -adenosylhomocysteïne (SAH) hydrolase activiteit muggen na blootstelling aan DZNep opzichte behandelingen controleren. Deze protocollen bieden de onderzoeker een eenvoudige stap-voor-stap procedure om meerdere toxicologische eindpunten beoordelen met een experimenteel geneesmiddel en, op zijn beurt, tonen een unieke multi-prong benadering voor het verkennen van de toxicologische effecten van in water oplosbare epigenetische geneesmiddelen of verbindingen van rente tegen vector muggen en andere insecten.

Figuur 1 is een schematische weergave van de assays; het beschrijft de verschillende stappen van de in dit artikel genoemde procedure. Aangezien het protocol is gebaseerd op verschillende levensstadia van muggen, is er geen bepaalde volgorde te volgen voor de experimenten die hier worden beschreven. De gebruiker kan voor een of meerdere assays voeren tegelijk, afhankelijk van beschikbaarheid monster. Figuur 2 toont de set-up voor de onrijpe mug ontwik...

Een protocol wordt ontwikkeld om de effecten van een epigenetisch medicijn DZNep op de ontwikkeling, vruchtbaarheid en overlevingskansen van muggen te onderzoeken. Hier beschrijven we procedures voor de aqueuze blootstelling van DZNep aan onvolwassen muggen en een op bloed gebaseerde blootstelling van DZNep aan volwassen muggen, naast het meten van SAH hydrolase remming.

Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van een epigenetisch medicijn op verschillende levensfasen van malariamuggen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door het medicijn op te lossen in het habitat van onvolgroeide muggen om de effecten ervan op larven, overlevingskans en lichaamsgrootte te bepalen. Het medicijn wordt ook toegevoegd aan zoogdierbloed en gevoerd aan volwassen vrouwelijke muggen, die de effect van het medicijn op reproductie zullen testen.Ten slotte wordt een enzymassai uitgevoerd om de remming van het muggenenzym door het medicijn te testen. De resultaten tonen de effecten van epigenetische veranderingen op de overlevingskans van malariamuggen en voor Conti gebaseerd op bioassayanalyse, we hadden eerst het idee voor dit protocol. Toen we leerden dat dine werd ontwikkeld als een veelbelovend anti-kanker epigenetisch medicijn, induceert dit medicijn apoptotische dood in humane kankercellen als een mechanisme voor histo-modificatie, worden hormone dieren bewaard, we sorteerden als een effectief app op de malariamug.Om te beginnen, selecteer de Novelis Gambi-muggenlarven op tweede ster en leg ze twee tot drie seconden op een papieren handdoek om overtollig water te verwijderen. Voeg vervolgens voorzichtig 15 larven per putje van een zes-putjes celkweekplaat zonder nuclease en bevat 10 villa-liters gedestilleerd water per putje toe. Label de putjes met kleurgecodeerde tapes om het experiment te randomiseren.Label vervolgens twee putjes per testconcentratie op elke plaat. Bereid vervolgens een een millimolair deasy NEP-hydrochloride stockoplossing voor door 0,3 milligram deasy nep op te lossen. Voeg in één milliliter gedestilleerd water de stockoplossing van Z NEP-hydrochloride toe aan de gelabelde putjes om een ​​uiteindelijke concentratie van 0,5 micromolair en 5,0 micromolair te bereiken.Toevoeging van de stockoplossing voor bovengenoemde concentraties zal het volume van het water in de putjes niet significant veranderen. Echter, in het geval van veel hogere concentraties, is het raadzaam om de verbinding in het larvenmedium op te lossen om onnodige verdunning van de verbinding te voorkomen. Na toevoeging van de verbinding voed en incubeer de larven gedurende 24 uur bij 28 graden Celsius.Noteer vervolgens de sterfte van de DZ NEP-behandelde en onbehandelde larvale muggen. Herhaal dit noteren elke dag tot alle larven sterven of poppen en uitkomen. Als volwassenen, verwijder en gooi elke dag dode larven weg.Noteer ook de grootte van de larven elke tweede dag totdat ze pate om de vruchtbaarheidstest uit te voeren. Verzamel eerst het kunstmatige voederstelsel door de voeders en verwarmingselement door de buizen aan te sluiten. Eenmaal voltooid, zet het systeem aan en selecteer SP één.Druk op enter om het systeem te starten. Controleer de temperatuur van het water met een digitale thermometer in het verwarmingssysteem. De connectoren en buizen helpen een constante circulatie van water door het systeem te handhaven, zodat de temperatuur van het bloed blijft.Bij 37 graden Celsius. Vul een platte bodembak met 10% bleekmiddeloplossing die zal worden gebruikt om eventuele bloedvlekken te ontsmetten. Voeg vervolgens twee milliliter gedefibrilleerd schapenbloed toe aan een microcentrifugebuisje en label als controle.Herhaal het proces voor het experimentele buisje gelabeld als vijf micromolair DZ nep. Voeg vervolgens zes microliters DZ NEP stockoplossing toe aan het experimentele buisje gelabeld vijf micromolair DZ nep. Meng het bloed en het medicijn voorzichtig door het meerdere keren om te draaien voordat u het buisje gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incubeert.Voeg met een pipette twee milliliter controle en testbloed toe aan de bovenkant van de overeenkomstig gelabelde voeders. Gooi de pipet in de bleekmiddeloplossing weg. Blaas periodiek lucht op de kooi om vrouwtjes aan te moedigen om te voeden.Dek de kooi af met een donkere zak. Laat de muggen ongeveer 30 minuten voeren. Zodra het voeren voltooid is, zet u het verwarmingselement uit.Haal de voeders eruit en verwijder de parafilm nadat de voeder en bleekmiddeloplossing vijf minuten geweekt hebben. Spoel goed af met gedeïoniseerd water. Plaats vervolgens katoenbollen met suikerwater op de kooien voor 48 uur.Plaats eierschalen gelabeld met de respectieve test- of controleconcentratie die water en filterpapier bevatten in de kooien overnacht. Om het leggen van eieren te vergemakkelijken, verwijdert u de eierschaal de volgende dag en onderzoekt u het aantal en de structuur van de eieren onder een stereomicroscoop. Verkrijg afbeeldingen, tel het aantal eieren en analyseer het verschil in het aantal eieren verkregen uit test- en controlekooien.Dit deel van de video toont een enzymactiviteitsassay met behulp van DTNB als indicator om het effect van dz NEP op SAH Hydro Lace-remming in volwassen muggen te bepalen. Om de SAH Hydro Lace-remming door DZ nep te meten, bereid accruë enzymextract van muggen gehomogeniseerd 10 niet-bloedgevoede volwassen muggen in één milliliter ijskoud 0,1 molair monobasisch natriumfosfaat bevattend 0,3% tritton X 100. Gebruik een glazen weefselhomogenisator om het homogenaat over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje.Na centrifugeren van het homogenaat gedurende vijf minuten bij 10.000 G en vier graden Celsius, brengt u het supernatant over naar een schone 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Gebruik het supernatant als enzymbron voor de SAH biochemische assay. Voor de blank, voegt u 50 microliter SAH toe, 50 microliter DTNB en 100 microliter diba natriumfosfaat om een mastermix te maken en voegt u deze toe aan de individuele putjes van een 96-wellige vlakbodem microplaat.Voeg vervolgens voor de controle 50 microliter SAH toe, 50 microliter DTNB, 50 microliter diba natriumfosfaat en 50 microliter SAH hydro lace enzym toe aan de individuele putjes. Tot slot, voor DZ NEP-behandel

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit interview, George Dimopoulos richt zich op de fysiologische mechanismen die door muggen om Plasmodium falciparum en dengue virus infecties te bestrijden. Uitleg wordt gegeven voor de manier waarop de belangrijkste vuurvaste genen, zijn deze genen die resistentie tegen pathogenen vector, die in de mug, en hoe deze kennis kan worden gebruikt om transgene muggen die niet in staat zijn om de malaria parasiet of dengue virus dragen genereren.

Bouwen aan een betere Mosquito: Het identificeren van de genen Enabling malaria en knokkelkoorts verzet in A. gambiae en A. aegypti muggen

In this video, we demonstrate the topical testing assay to determine the toxicity of a potential insecticide on adult female mosquitoes. Using a dopamine receptor antagonist that causes lethal inhibition of neurotransmission in mosquitoes, this method describes a way to evaluate the toxic effects of insecticides upon topical application.

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

This video demonstrates a blood-feeding assay to evaluate the mortality and fecundity of test compounds with novel modes of action on female mosquitoes. This technique helps in screening new classes of insecticides to kill the resistant population of mosquitoes and control disease spread.

Mosquito Feeding Assay: A Method to Evaluate Test Compound Effects on Mortality and Fecundity of Adult Female Mosquitoes

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Protocollen worden voor de beoordeling van de toxiciteit van chemicaliën te onvolwassen en volwassen muggen voor ontwikkeling als nieuwe klassen van larvicides, adulticides en endectocides beschreven. De protocollen inschakelen high-throughput testen van meerdere oplossingen op single-point dosis en evaluatie achteraf via dosis reactie assay om toxiciteit op contact te bepalen of via ingestie.

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

We beschrijven de methodologie en het belang van de actuele toepassing bioassay om de gevoeligheid voor insecticiden bij muggen en fruitvliegen te meten. De gepresenteerde test is high-throughput, maakt gebruik van insectenmassa - waardoor een massa-gerelativeerde letale dosis in plaats van concentratie kan worden berekend - en heeft waarschijnlijk een lagere variabiliteit dan andere vergelijkbare methoden.

Topische toepassing Bioassay om insecticide toxiciteit voor muggen en fruitvliegen te kwantificeren

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

De seksuele ontwikkeling van Plasmodium vindt plaats in de middendarm van de mug. Het richten op de seksuele stadia van de parasiet is een veelbelovende strategie om de overdracht te blokkeren. We ontwikkelden Ookluc, een transgene P. berghei die nanoluciferase tot expressie brengt na de vorming van zygoten, waardoor high-throughput screening van transmissieblokkerende verbindingen mogelijk is. In dit artikel worden de methoden voor screening met Ookluc beschreven.

Ookluc: een Plasmodium berghei-lijn voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen

Leer toxicologische testen voor het evalueren van epigenetische drug DZNep op ontwikkeling, vruchtbaarheid en overleving van malariamuggen. Deze methode helpt onderzoekers bij populatiebeheersing.

Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen (Video) | JoVE Journal

Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen

Meer video's verkennen