Name: Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer micro-injectie van mRNA in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum voor expressie van fluorescerende eiwitten. Deze methode maakt in vivo beeldvorming van embryonale ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de steun van de &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; te erkennen voor de veehouderij. Dit werk werd ondersteund door fondsen van ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 en ANR-11-JSV2-002-01) aan Michael Schubert, door de Europese Unie KP6 subsidie ​​&quot;Embryomics&quot; en door de ANR subsidie ​​&quot;ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-proces &quot;aan Jean-François Nicolas en Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wordt gefinancierd door een FCT doctoraatsbeurs (SFRH / BD / 86878/2012). Verzoeken om de hier beschreven vectoren kunnen rechtstreeks worden gericht aan de auteurs.

1. Voorbereiding van de instrumenten en reagentia <ol style="margin-left: 40px;"><li> Transfer pasteurpipetten <ol><li> Genereren van een reeks van overdracht pasteurpipetten met verschillende diameters tip door te trekken 230 mm lang pasteurpipetten boven een vlam bij verschillende snelheden. Zorg ervoor dat de tapsheid zo lang mogelijk voor vloeiende en nauwkeurige regeling aspiratie. </li><li> Met een diamant schrijver, krassen pipet langs een lijn loodrecht op de lengterichting van de pipet. Met beide handen, trek de pipet parallel aan de lengte van een stompe snit genereren. Snel vlam-polish de pipet zonder het afdichten van de tip. </li><li> Vary de diameter van de tip met de fase van de eicellen / embryo&#39;s worden gepipetteerd: 300-400 urn voor onbevruchte eicellen (ongeveer 150 urn in diameter), 600 urn voor bevruchte eieren (ongeveer 500 urn in diameter), 200-400 pm voor gearceerde neurulae. Gebruik pipetten met een mond-gecontroleerd afzuigslang aan eicellen / embryo&#39;s van het ene gerechteen andere. </li></ol></li><li> Injectienaalden <ol><li> Manipuleren van de capillairen met handschoenen te zorgen RNase vrije omstandigheden. Gebruik borosilicaatglas met gloeidraad haarvaten met afmetingen van OD 1.20 mm, ID 0,94 mm, lengte 10 mm. </li><li> Als haarvaten worden getrokken van het type verwarming-filament naald puller in de Materials List beschreven, gebruikt u de volgende instellingen: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tijd 60, Pressure 200 of 300. Anders is ervoor te zorgen dat de vorm, dat is cruciaal belang voor injecties, zoals getoond in figuur 2 met de volgende eigenschappen: 4-8 urn buitendiameter tip diameter 2 cm taper lengte. OPMERKING: Naalden kan voordat de paaitijd worden getrokken en worden gebruikt gedurende het hele seizoen. </li></ol></li><li> 5% Fenolrood stockoplossing (4x) <ol><li> Vers bereid elke paaitijd. </li><li> In een 0,22 pm-filtratie buis, wegen uit 25 mg Fenolrood poeder. </li><li> Voeg 0,5 ml DNase- en RNase-vrij water tede buis met het poeder. </li><li> Spin gedurende 3-5 min bij 18.000 xg bij kamertemperatuur filter steriliseren van de oplossing en verwijderen van kristallen die de injectienaald kunnen verstoppen. </li><li> Bewaar bij 4 ° C en bewaar 250 ul aliquots bij -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing <ol><li> Vers bereid elke paaitijd. </li><li> Los 5 mg poly-L-lysine in 20 ml gedestilleerd water. WINKEL 5 ml porties bij -20 ° C. </li><li> Gebruik een ontdooide monster onmiddellijk en éénmalig reproduceerbaar en robuust hechting van de oöcyten de poly-lysine-gecoate schaal verzekeren. </li></ol></li><li> mRNA-synthese <ol><li> Vers bereid elke paaitijd. </li><li> Lineariseren 5 ug DNA van belang met het geschikte enzym (gewoonlijk 2 uur bij 37 ° C). Om de volledigheid van de spijsvertering te controleren, lopen 2% in volume van de spijsvertering mix op een 1% agarose-TBE gel in TBE buffer bij 150 W gedurende 20 minuten. </li><li> Pak de lineatoriseerde DNA met 25: 24: 1 fenol (pH 8,0): chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 sec, centrifuge 10 min bij 18.000 xg en het verzamelen van de waterige (bovenste) fase. </li><li> Extract de waterfase opnieuw met 24: 1 chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 seconden, centrifugeer 10 minuten bij 18000 xg en het verzamelen van de waterige fase. </li><li> Neerslag gelineariseerde DNA met 100: 10: 300 gelineariseerd DNA: 3 M natriumacetaat (pH 5,2) 100% ethanol overnacht bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer 20 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Spoel met 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Laten drogen en resuspendeer in RNase-vrij water in een eindconcentratie van 0,5 ug / ul. </li><li> Transcribeer 1 ug gelineariseerd DNA met een mRNA-synthese kit met de juiste polymerase, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Extraheer het mRNA met 5: 1 fenol (pH 4,7): chloroform en ammoniumacetaat stopoplossing die bij de kit. </li><li> Vortex gedurende 20 sec, centrifuge 10 min bij 18.000 xg en verzamel de waterfase. </li><li> Extract de waterfase opnieuw met 24: 1 chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 seconden, centrifugeer 10 minuten bij 18000 xg en het verzamelen van de waterige fase. </li><li> Neerslag het mRNA 100% isopropanol overnacht bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer 20 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Spoel in 80% ethanol. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Laat het pellet droog bij kamertemperatuur niet meer dan 5-10 min als het dan moeilijk te mengen zijn. Resuspendeer in DNase- en RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van ten minste 2 ug / ul een fatsoenlijke uiteindelijke mRNA concentratie injectie mix waarborgen. </li><li> Om de kwaliteit en grootte van het transcriptieproduct controleren, werking 0.5 ul van het mRNA op een RNase-free 1% agarose-TBE gel in TBE buffer bij 150 W gedurende 20 minuten. WINKEL 2 pi aliquots bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-lysine beklede schalen OPMERKING: Poly-lysine coated gerechten gebruikt om de oöcyten immobiliseren gedurende de injectie. <ol><li> Voor elke 35 mm celcultuur petrischaal (5 in totaal), bedek de bodem van de petrischaal met 1 ml van het ontdooide 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voor elke 35 mm celcultuur petrischaal (5 in totaal), breng de 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing in een 35 mm celcultuur petrischaal. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Gooi de 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing. </li><li> Laat de Petrischalen droge, omgekeerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Bewaar de poly-lysine beklede schotels in een plastic omslag bij 4 ° C om verontreiniging gedurende een week maximaal vermijden. </li></ol></li><li> Agarose-beklede schalen OPMERKING: Ze worden gebruikt om de cultuur geïnjecteerde embryo&#39;s. De agarose een buffer voor de geïnjecteerde embryo en stopt plakken aan de bodem van de schaal. <ol><li> Maak kunstmatig zeewater (ASW) met behulp van 37-38 g / l commercial zouten + 0,25 mmol NaHCO3 in omgekeerde osmose water. </li><li> Los agarose tot een concentratie 1% 0,22 urn gefiltreerd ASW door verwarming van de oplossing in een magnetron. </li><li> Snel giet de warme agarose-oplossing van een 35 mm petrischaal in een ander teneinde zeer dunne agarose bekleding van de schaal te waarborgen. </li><li> Bewaar de agarose beklede schalen verpakt in Saran wrap bij 4 ° C om verontreiniging gedurende een week maximaal vermijden. </li></ol></li><li> Injectie mix en laden van de injectienaalden <ol><li> Ongeveer 2 uur voor aanvang van de injecties, maak een 2 pl injectie mix in RNase- en DNase-vrij water met uiteindelijke concentraties van 1-1,8 ug / ul van mRNA, 15% glycerol, 1,25% Fenolrood. OPMERKING: De fenolrood kleuren oplossing, die controle van de injectierendement en identificatie van succesvolle geïnjecteerde embryo mogelijk maakt. Glycerol gunsten mRNA verspreiding binnen de eicel. </li><li> Centrifugeer 4 min bij 18.000 xg tepellet kristallen. Houden op ijs tot gebruik. </li><li> Met een pipet 10 ul, verzamel 0.5 ul van de injectie mengsel, het vermijden van de bodem van de buis, waar de kristallen werden gepelleteerd. </li><li> Backfill tenminste twee injectienaalden (bij een pauze tijdens de injectie) pipetteren 0,5 ul druppel injectie mix in de grote opening van de naald. </li><li> Installeer de naalden in een opslagkruik met vloeistof op de bodem bij 4 ° C om verdamping van de injectie mengsel voorkomen. Laat de injectie mix langzaam te reizen naar de punt van de injectienaald voor ten minste 1 uur tot het ontstaan ​​van luchtbellen te minimaliseren. </li><li> WINKEL extra inbreng mengsel bij -80 ° C gedurende maximaal drie extra toepassingen, waarna het mRNA kwaliteit achteruitgaat (gegevens niet getoond). </li></ol></li></ol> 2. Het verzamelen van biologisch materiaal, micro-injectie en Embryo Cultuur <ol style="margin-left: 40px;"><li> Eicel en sperma collectie OPMERKING: Zie Theodosiouet al. 12 voor een gedetailleerd protocol voor het induceren van paai- en voor gameet collectie. <ol><li> Shock mannen en vrouwen in ASW bij 23 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Een tot twee uur voor zonsondergang, overdracht volwassenen in afzonderlijke bekers in ASW bij 19 ° C omdat de meeste volwassenen 1-2 uur paaien na zonsondergang. </li><li> Spoel 35 mm petrischalen gefiltreerd ASW en laat ze drogen ondersteboven te voorkomen dat de eicellen te plakken aan de bodem van de schaal. </li><li> Bij het paaien, onmiddellijk verzamelen van sperma en eicellen met een 1.000 III pipet. <ol><li> Houd sperma en eicellen scheiden van volwassen amphioxus omdat het contact is schadelijk voor de gezondheid gameet (gegevens niet getoond). </li><li> Vermijd bovendien verrassende volwassenen, waardoor bewegingen die verdwijnen, en dus verdunnen, zowel sperma en eicellen. Om het sperma actief zolang mogelijk te houden en bevruchtingspercentage optimaliseren, verzamel het sperma zo geconcentreerd mogelijk. </li></ol></li><li> Houdensperma op ijs in een 1,5 ml buis. </li><li> Transfer eicellen in gefilterd ASW in de pre-gespoeld 35 mm petrischaaltjes. </li><li> Transfer 100-500 eicellen met een eerder getrokken 300-400 um overdracht Pasteur pipet om nog eens 35 mm petrischaal met de injecties uit te voeren. </li><li> Bemest de rest van de koppeling als controle voor sperma en eicel kwaliteit of andere experimenten. </li></ol></li><li> Eicel injectie <ol><li> Installeer de injectienaald op de micromanipulator bij een 50 ° hoek ten opzichte van het horizontale vlak. OPMERKING: Hoeken van minder dan 50 ° zal de eicellen rond duwen op de schotel, terwijl de hoeken van meer dan 50 ° van een passende controle van de naald positie ten opzichte van de eicel niet zal toestaan. </li><li> Onder een tl-dissectie scope met 25X oculair, overdragen 30 eicellen met de 300-400 micrometer overdracht Pasteur pipet op een poly-lysine-gecoate schotel met gefilterd ASW. </li><li> Stort de eicellen langs een lijn te voerenuit injecties in een geordende manier en te onderscheiden geïnjecteerd uit niet-geïnjecteerde oöcyten. Injecteer kleine aantallen (30 eicellen) de belichtingstijd van eicellen poly-lysine, die de neiging heeft zich ontwikkelende embryo&#39;s vervormen minimaliseren (gegevens niet getoond). </li><li> Gebruik de donkere veld verlichting om de eicellen te maken zo doorzichtig mogelijk te maken. </li><li> Met de grove beweging knop van de micromanipulator, breng de injectienaald in de buurt van een eicel. </li><li> Met fijne tang, opengesneden de naald op het niveau waar de tip begint te worden gebogen. Door het pulseren met de injector, controleer dan of rode injectie mix is ​​eigenlijk stroomt uit de naald. </li><li> Bij 200X vergroting en de fijne beweging knop van de micromanipulator, beweeg de injectienaald in de kern van de eicel. OPMERKING: Als er te oppervlakkig geplaatst, wordt de geïnjecteerde oplossing niet in de eicel te blijven. Als te ver geplaatst, wordt de eicel vernietigd. </li><li> Injecteren met 1-3 pulsen van 120 msec duration en 1-10 psi. Als de naald is fijn genoeg, te injecteren met continue stroom bij constante druk. Zorg ervoor dat het injectievolume overeenkomt met 1/5 tot 1/3 van het volume van een eicel. </li><li> Na injectie, trek de naald uit snel op lekkage van de eicel te voorkomen. </li><li> Controleer of de geïnjecteerde oplossing blijft binnen de eicel en dat na een paar seconden, de geïnjecteerde oplossing verspreidt door de eicel. </li><li> Ga verder met de volgende eicel in de rij. </li><li> Houd een aantal niet-geïnjecteerde embryo&#39;s van elke serie als negatieve controle te schatten de achtergrond fluorescentie bij het scannen voor geïnjecteerde embryo&#39;s. </li></ol></li><li> Bevruchting, selectie van geïnjecteerde embryo&#39;s en embryo cultuur <ol><li> Bevruchten eicellen zodra een serie is geïnjecteerd. Zoals eicelkwaliteit afneemt met de tijd, te injecteren en te bevruchten eicellen binnen 1 uur na de paaitijd 12. </li><li> Afhankelijk van de spermaconcentratie, voeg 1-5 druppels van sperma aan oöcyten enwervelen de schotel. OPMERKING: De bemesting enveloppe dient duidelijk op het embryo worden na ongeveer 1 minuut. </li><li> Laat het embryo los te maken van de poly-lysine-gecoate schaal Injecterend andere reeks oöcyten. </li><li> Breng de embryo&#39;s met de micrometer overdracht Pasteur pipet 600 in een agarose gecoate petrischaal. Verwijder het embryo uit de poly-lysine gecoate schaal zo spoedig mogelijk, indien mogelijk voordat de 2-cellig stadium. OPMERKING: Bij langdurige blootstelling aan polylysine, de embryo meestal opeengepakt blastulae, afgeplat aan de zijde contact met de bodem van de schaal worden. </li><li> Bij de 2-cel 4-cellig stadium, selecteert met een fluorescerende dissectie scope met DSR filter het succes geïnjecteerde embryo&#39;s, dat wil zeggen die met een normale morfologie een fenolrood-afgeleide rood fluorescerend signaal vertonen. </li><li> Houd de embryo&#39;s in de cultuur in gefilterd ASW in-agarose gecoate petrischalen bij 19 ° C tot de gewenste podium voorin vivo beeldvorming. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weber, T., Köster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li>
<li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841(2014).</li>
<li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li>
<li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li>
<li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications%3A+insights+from+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li>
<li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+the+tunicates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li>
<li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalochordates+%28amphioxus+or+lancelets%29%3A+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li>
<li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+%28Branchiostoma+lanceolatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li>
<li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus%2C+Branchiostoma+belcheri%2C+in+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461(2013).</li>
<li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li>
<li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalochordate+%28amphioxus%29+embryos%3A+procurement%2C+culture%2C+and+basic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li>
<li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li>
<li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li>
<li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li>
<li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li>
<li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
<li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases%3A+status+for+the+year+2000%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).</li>
<li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+in+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li>
<li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior%2Fposterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li>
<li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li>
<li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene%3A+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li>
<li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li>
<li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li>
<li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li>
<li>Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599(1371).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel presenteren we voor het eerst een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor de injectie van B. lanceolatum eicellen die na B. Floridae 13,14 en B. belcheri 15, dus de derde amphioxus soorten waarvan dergelijke techniek is beschreven. Belangrijk is het protocol beschreven hier ook de beschrijving van vectorsystemen geschikt voor de productie van proteïnen B. lanceolatum van geïnjecteerde mRNA geproduceerd in vitro (hieronder beschreve...

Tijdens de ontwikkeling van een enkele cel leidt tot een volledig organisme in een zeer complex proces dat zowel celdelingen en bewegingen omvat. Om beter te begrijpen van de biologische principes van de dynamiek van de cel gedrag, hebben ontwikkelingsbiologen begonnen met fluorescentie gebaseerde in vivo imaging technieken te gebruiken. Specifieke compartimenten van cellen, zoals celmembranen, kan hetzij door behandelingen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen, een benadering gehinderd door een gebrek aan specificiteit en weefselpenetratie 1 of de specifieke introductie in het embryo van exogeen mRNA coderend fluorescente proteïnen 2. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt voor de efficiënte afgifte van exogene verbindingen, zoals mRNA. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, micro-injectie, elektroporatie, beschieting met microdeeltjes, lipofectie en transductie 3,4. Hoewel al deze benaderingen kan worden gebruikt om exogene verbindingen in een ingevoerdontwikkeling van het embryo, alleen micro-injectie kan de toepassing van vooraf gedefinieerde en precieze hoeveelheden in elke cel 3. Micro-injectie technieken zijn beschreven voor alle belangrijke ontwikkelings modelsystemen 4 (bijvoorbeeld, fruitvliegen, nematode wormen, zebravis, kikkers, muizen) en voor sommige alternatieve modellen 4, onder andere gebruikt voor vergelijkende studies gericht op het begrijpen van de evolutie van ontwikkelingsmechanismen (bv, zeeanemonen, annelid wormen, zee-egels, ascidian manteldieren, de Schedellozen amphioxus). Cephalochordates, die samen met manteldieren en gewervelden vestigen de chordate phylum, zijn bijzonder goed geschikt modellen om de evolutie van chordadieren en de diversificatie van de gewervelde dieren van een ongewerveld voorouder 5-8 te bestuderen. De Schedellozen lineage afweken zeer vroeg tijdens chordate evolutie; en bestaande cephalochordates, die zijn onderverdeeld in drie geslachten (Branchiostoma, Asymmetron en Epigonichthys), lijken op gewervelde dieren, zowel in termen van algemene anatomie en genoom architectuur 5-8. Van de ongeveer 30 soorten cephalochordates die tot nu toe zijn beschreven, vijf zijn beschikbaar voor embryologische en ontwikkelingsstudies 6,9: Asymmetron lucayanum (de Bahama lancetvisje), Branchiostoma Floridae (de amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (de Europese amphioxus), Branchiostoma belcheri (de Chinese amphioxus) en Branchiostoma japonicum (de Japanse amphioxus). Rijpe volwassenen van drie van deze soorten (B. lanceolatum, B. belcheri en B. japonicum) kan worden geïnduceerd om te paaien on-demand tijdens het broedseizoen 10,11. Bovendien, althans voor B. lanceolatum kan een efficiënt paai ook geïnduceerd worden in kunstmatig zeewater 12, waardoor deze bijzondere Schedellozen soort toegankelijk voor laborator makenies die geen toegang tot natuurlijke zeewater hebben. De combinatie, in B. lanceolatum van een gemakkelijke en betrouwbare toegang tot embryo&#39;s met een efficiënte levering methode, zoals micro-injectie, tot nu toe de enige afgiftetechniek ontwikkeld amphioxus (zowel B. Floridae en B. belcheri) 13-15, zal de ontwikkeling van een mogelijk roman suite van manipulatieve technieken, waaronder lineage opsporings- en dynamische cel-gedrag-gebaseerde benaderingen. Een protocol voor de efficiënte micro-injectie van mRNA naar fluorescerende eiwitten in de B. uitdrukken lanceolatum embryo werd dus ontwikkeld. Bovendien, om een basis toolkit voor live beeldvorming van B. bieden lanceolatum embryo, vector systemen ontwikkeld die membraangebonden en nucleaire expressie van fluorescerende eiwitten mogelijk. Voor membraan targeting, versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) werd gefuseerd met de humane HRAS CAAX box en nucleaire lokalisatie van mCherry en eGFP wasverkregen door fusie aan de zebravis histon 2B (H2B) exon (figuur 1, aanvullend bestand 1). Verder met als doel eiwittranslatie optimaliseren, de Kozak sequenties en codons van de constructen werden aangepast en afgestemd op gebruik in B. lanceolatum. Samen zullen de injectiemethode en expressievectoren hier gepresenteerde dienen als basis voor het genereren van nieuwe experimentele benaderingen voor cephalochordates name analyses met de nieuwste fluorescentie gebaseerde in vivo beeldvorming.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Verbruiksartikelen</td></tr><tr><td>35 mm Petri schotels</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Culture-treated</td></tr><tr><td>Filtratie-eenheid (Stericup 1 L)</td><td>Fisher</td><td>W21719</td><td>0.22 &#956;m</td></tr><tr><td>Spin-X buizen</td><td>Costar</td><td>8160</td><td>0.22 &#956;m</td></tr><tr><td>Naaldopslagpot voor capillairen met een diameter van 1,2 mm</td><td>WPI</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td></td><td></td><td>230 mm lang</td></tr><tr><td>Aspiratiebuis</td><td>Dutscher</td><td>75056</td><td></td></tr><tr><td>Capillairen voor injectienaalden</td><td>Sutter</td><td>BF 120-94-10</td><td>Borosilicaatglas met gloeidraad, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lengte 10 mm</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>Laagsmeltende agarose</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>114537</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>H2O, DNase/RNase-vrij</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Transcriptiekit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>mRNA-synthesekit</td></tr><tr><td>Phenol pH 8</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamylicohol</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>5:1 fenol pH 4,7:chloroform</td><td>Sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Reef Crystal zouten (200 kg)</td><td>Europrix&nbsp;</td><td></td><td>Commerciële zouten</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Fluorescent dissecting scope met 200x vergroting</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>25X oculairen, DSR en GFP2 filters</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marzhauzer</td><td>M-33</td><td></td></tr><tr><td>Injector</td><td>Picospritzer</td><td>model II of III</td><td></td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Verwarmingsgloeidraad naaldtrekker</td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11252-30</td><td>Dumont #5</td></tr></tbody></table>

expressie van fluorescerende eiwitten in branchiostoma lanceolatum door mrna injectie in onbevruchte eicellen

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We rapporteren hier een robuust en efficiënt protocol voor de expressie van fluorescente eiwitten na mRNA-injectie in onbevruchte eicellen van de cephalochordaat amfioxus, Branchiostoma lanceolatum. We gebruiken constructen voor membraan en nucleair gerichte mCherry en eGFP die zijn aangepast om aan te sluiten bij de codon-gebruik van amfioxus en Kozak consensussequenties. We beschrijven het type injectienaalden dat moet worden gebruikt, het immobilisatieprotocol voor de onbevruchte eicellen en de algehele injectie-opstelling. Deze techniek genereert fluorescent gelabelde embryo's, waarin de dynamica van celgedrag tijdens vroege ontwikkeling kan worden geanalyseerd met behulp van de nieuwste in vivo beeldvormingsstrategieën. De ontwikkeling van een micro-injectietechniek in deze amfioxus-soort zal live beeldvormingsanalyses van celgedrag in het embryo toestaan, evenals gen-specifieke manipulaties, inclusief gen-overexpressie en knockdown. Alles bij elkaar zal dit protocol de basale chordaat amfioxus verder consolideren als een diermodel voor het aanpakken van vragen met betrekking tot de mechanismen van embryonale ontwikkeling en, belangrijker nog, hun evolutie.

Het protocol hierboven beschreven verschaft de basis voor de micro-injectie van B. lanceolatum eicellen en dus ook voor het binnenbrengen in het ontwikkelen van B. lanceolatum embryo van mRNA coderend fluorescerende eiwitten in vivo beeldvorming. Hoewel de techniek zeker robuust en betrouwbaar, het percentage succesvolle injecties met dit protocol uiteenloopt (tabel 1). De zeer waarschijnlijke verklaring voor deze intrigerende feite de extreme variabiliteit van eicel koppeling...

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om mRNA, dat codeert voor een fluorescerende eiwit, in bronchos stoma lancia latam oöcyten te introduceren om in vivo fluorescerend beeldvorming van zich ontwikkelende embryo's mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst het afleggen van rijp amfi ais, mannetjes en vrouwtjes te induceren door een temperatuurshock van 24 uur. Na de temperatuurshock worden vrouwtjes en mannetjes in individuele afzetbekers geplaatst, waardoor de verzameling van respectievelijk oöcyten en sperma mogelijk wordt.Zodra de cellen in een polylysine gecoate schaal zijn gerangschikt, wordt een speciaal voorbereid micro-injectienaald gebruikt om de oplossing in de kern van de cel te injecteren. De laatste stap is de bevruchting van de cel met een tot vijf druppels sperma. Uiteindelijk twee foton laser scanning.Microscopie wordt gebruikt om de alomtegenwoordigheid van de fluorescerende eiwitten die worden geproduceerd uit het micro-geïnjecteerde mRNA te tonen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat micro-injectiestappen moeilijk te leren zijn omdat de vereiste technische vaardigheden onmogelijk zijn om te detailleren en in druk te behandelen. Om te be

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Een geoptimaliseerd protocol voor de in vitro rijping van oöcyten zebravis gebruikt voor het manipuleren van moederlijke genproducten wordt hier gepresenteerd.

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer micro-injectie van mRNA in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum voor expressie van fluorescerende eiwitten. Deze methode maakt in vivo beeldvorming van embryonale ontwikkeling mogelijk.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Meer video's verkennen