Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Het algemene doel van deze procedure is om mRNA, dat codeert voor een fluorescerende eiwit, in bronchos stoma lancia latam oöcyten te introduceren om in vivo fluorescerend beeldvorming van zich ontwikkelende embryo's mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst het afleggen van rijp amfi ais, mannetjes en vrouwtjes te induceren door een temperatuurshock van 24 uur. Na de temperatuurshock worden vrouwtjes en mannetjes in individuele afzetbekers geplaatst, waardoor de verzameling van respectievelijk oöcyten en sperma mogelijk wordt.

Zodra de cellen in een polylysine gecoate schaal zijn gerangschikt, wordt een speciaal voorbereid micro-injectienaald gebruikt om de oplossing in de kern van de cel te injecteren. De laatste stap is de bevruchting van de cel met een tot vijf druppels sperma. Uiteindelijk twee foton laser scanning.

Microscopie wordt gebruikt om de alomtegenwoordigheid van de fluorescerende eiwitten die worden geproduceerd uit het micro-geïnjecteerde mRNA te tonen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat micro-injectiestappen moeilijk te leren zijn omdat de vereiste technische vaardigheden onmogelijk zijn om te detailleren en in druk te behandelen. Om te beginnen, bereid de polylysine gecoate schalen voor die worden gebruikt om de cellen tijdens de injectie te immobiliseren.

Voor elke 35 millimeter celkweek Petri-schaal, bedek de bodem met polylysine oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng vervolgens de polylysine oplossing over in een andere schaal en incubeer opnieuw bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de oplossing weg en laat de Petri-schalen twee uur ondersteboven drogen bij kamertemperatuur.

Wanneer droog, bewaar de gecoate schalen verpakt in plasticfolie bij vier graden Celsius gedurende maximaal één week. Om de aros gecoate schalen voor te bereiden die worden gebruikt om geïnjecteerde embryo's te kweken, maak kunstmatig zeewater en omgekeerd osmosewater. Los vervolgens aros op tot een 1% concentratie in gefilterd a SW. Giet snel de warme aros oplossing van de ene Petri-schaal in een andere om een zeer dunne aros coating van de schaal te garanderen.

Wickel de gecoate schalen in Saran wrap en bewaar ze bij vier graden Celsius gedurende maximaal één week. Bereid eerst het injectiemengsel in RNA's en DNA-vrije waterfenol voor. Rood kleurt de oplossing en maakt het mogelijk om met succes geïnjecteerde embryo's te identificeren.

Centrifugeer vervolgens het mengsel om de kristallen te bezinken en bewaar het op ijs tot het klaar is voor gebruik. Wanneer klaar, laad een 10 microliter pipette met 0,5 microliter van het injectiemengsel, vermijd de bodem van de buis waar de kristallen zijn bezonken. Vul de injectienaald terug door de 0,5 microliter druppel van het injectiemiddel te pipetten.

Meng in de grote opening van de naald. Bereid twee naalden voor voor het geval er een breekt tijdens de injectie. Bewaar de naalden in een pot met water op de bodem om verdamping van de injectie te voorkomen.

Meng en plaats bij vier graden Celsius. Laat het injectiemengsel gedurende ten minste een uur langzaam naar de punt van de injectienaald reizen om het ontstaan van bellen te minimaliseren. Om te beginnen met het verzamelen van oöcyten en sperma, worden mannetjes en vrouwtjes geschokt in een SW gedurende 24 uur en vervolgens een tot twee uur voor het afleggen in individuele bekers overgebracht.

Bij het afleggen, verzamel onmiddellijk sperma en cellen. Zorg ervoor dat u de volwassenen niet verschrikt tijdens het verzamelen. Extra beweging kan verdampen en dus zowel sperma als cellen verdunnen na het verzamelen.

Bewaar sperma op ijs in een buisje van 1,5 milliliter en breng de cellen in gefilterd a SW over in voorgespoelde Petri-schalen. Breng 100 tot 500 cellen over in een andere 35 millimeter petrischaal om de injecties uit te voeren. Ten slotte bevrucht u de rest van de celkoppeling als controle voor sperma- en celkwaliteit of voor andere experimenten.

Om de injectieprocedure te beginnen, installeert u de naald op de micro manipulator onder een hoek van 50 graden ten opzichte van het horizontale vlak onder een fluorescerend dissectiescoop met 25 ex oculaire lenzen, breng 30 cellen over naar een polylysine gecoate schaal en gefilterd a SW om de geïnjecteerde cellen bij te houden. Leg ze op een geordende manier langs een lijn neer. Injecteer altijd kleine aantallen om de blootstelling te minimaliseren.

Geef tijd aan polylysine, die de neiging heeft om zich ontwikkelende embryo's te vervormen. Gebruik de donkerveldverlichting om de cellen zo doorschijnend mogelijk te maken. Breng vervolgens met de grove bewegingsknop de injectienaald dicht bij een cel met fijne pincetten. Snijd af.

Open de naald op het niveau waar de punt begint te buigen door te pulseren met de injector. Controleer of de rode injectiemix uit de naald stroomt bij 200 x vergroting. En met de fijne bewegingsknop, beweeg voorzichtig de injectienaald in de kern van de cel.

Als ingebracht te oppervlakkig, zal de geïnjecteerde oplossing niet binnen de UO-plaats blijven. Als te ver ingebracht, zal de UO-plaats worden vernietigd. Injecteer met één tot drie pulsen.

Als de naald fijn genoeg is, injecteer met continue stroom bij constante druk. Zorg ervoor dat het injectievolume overeenkomt met een vijfde tot een derde van het volume van een enkele oöcyt na injectie. Trek de naald snel uit om lekkage te voorkomen.

Controleer of de geïnjecteerde oplossing binnen de cel blijft en dat na een paar seconden de geïnjecteerde oplossing zich door de cel verspreidt. Ga naar de volgende cel in de rij. Bewaar enkele ongeïnjecteerde embryo's van elke reeks als negatieve controles om de achtergrondfluorescentie te schatten bij het scannen op geïnjecteerde embryo's. Bevrucht de oöcyten zodra de reeks is geïnjecteerd.

Omdat de kwaliteit van de oöcyten met de tijd afneemt, injecteer en bevrucht u cellen binnen een uur. Na het afleggen. Af