Name: Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer cardiale stamcellen afleiden uit embryonale stamcellen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemarkers. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartontwikkeling en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Leonid Gnatovskiy voor zijn zorgvuldige en kritische lezing van het artikel. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL109054) en het Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) aan WZ en door de Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine aan BL.

1. Afleiding van muis embryonale CPC&#39;s van Mouse SER <ol><li> Bereid je muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder laag. <ol><li> Warm MEF medium (10% FBS in DMEM) tot 37 ° C. </li><li> Bereid gelatine beklede platen. <ol><li> Voeg 1 ml van 0.1% gelatine in water in een putje van 6-well plaat of 5 ml in een 10 cm schaal. </li><li> Laat platen of schotels bij 37 ° C of kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min. Aspire gelatine voor gebruik. </li></ol></li><li> Dooi bestraald MEF snel in een 37 ° C waterbad, onder voorzichtig schudden. </li><li> Breng de cellen zachtjes 15 ml of 50 ml conische buis. Voeg 5 ml voorverwarmde MEF medium. Schud de cellen langzaam en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen in MEF medium en tel levensvatbare cellen. Gebruik de volgende hoeveelheden MEF medium: 2 ml voor cellen per putje van een 6-well plaat en 10 ml voor cellen van een 10 cm schaal. </li><li> Plaat cellen in 6-well platen of 10 cm schalen 1-2x 10 6 per plaat / schotel. </li><li> Incubeer de MEF platen / schotels bij 37 ° C, 5% CO2 ten minste 24 uur vóór gebruik. OPMERKING: Gooi MEF platen / borden ouder dan een week. </li></ol></li><li> Bereid muis SER <ol><li> Cultuur de Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP muis SER op MEF tot 90% samenvloeiing. Gebruik ES-celmedium bestaande uit 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM pyruvaat, 100 E Pen / Strep, en 0,1 mM β-mercaptoethanol. </li><li> Bereid gelatine beklede platen met 6 putjes zoals beschreven in 1.1.2. </li><li> Zuig medium uit platen en spoel cellen met DPBS. <ol><li> Zuig DPBS en voeg 0,4 ml 0,25% trypsine in een putje van 6-wells plaat. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 min. Voeg 1 ml voorverwarmde ES medium tot trypsine reactie te staken. </li></ol></li><li> Oogst cellen en centrifuge cellen bij 200 xg en zuig medium. Resuspendeer cellen in 1 ml ES-cel medium en tel de cellen. &lt;/ Li&gt; <li> Plaat SER op met gelatine beklede platen met dichtheid van 3 x 10 4 / cm2. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ongeveer 2 dagen bij SER bereiken ongeveer 90% confluent. Verander het medium elke dag. </li><li> Wanneer SER zijn 90% samenvloeiing, herhaalt u stap 1.2.2-1.2.5 om volledig te verwijderen van de MEF feeders. </li></ol></li><li> Induceren CPC differentiatie door EB vorming <ol><li> Bereid differentiatiemedium als volgt: 36 ml IMDM, 12 ml Ham&#39;s F12, 2 mM L-glutamine, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 ug / ml AA, en 0,45 mM 1-thioglycerol. </li><li> Zuig medium van de cellen en spoel af met DPBS. Zuig DPBS en voeg 0,4 ml 0,25% trypsine in een putje van 6-wells plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. </li><li> Voeg 1 ml differentiatie medium om de reactie en pipet omhoog staken en neer naar cel clusters verspreiden in enkele cellen. </li><li> Centrifuge SER bij 200 xg gedurende 5 minuten en het medium te verwijderen. <ol><li> Resuspendeer 1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; SER in 1 ml differentiatie medium. Tel de cellen en de cellen te kweken in lage onthechting petrischaal in een concentratie van 1 x 10 5 cellen / ml in differentiatie medium bij 37 ° C eerst EB aggregatie. </li></ol></li><li> Twee dagen na EB vorming, overdragen EBS van gerechten tot 50 ml buizen. Draaien op 200 xg gedurende 1 min. Verwijder medium en spoel EVSA met 10 ml DPBS zonder Ca 2+ en Mg 2+. </li><li> Aspireren DPBS en voeg 1 ml 0,25% trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 4,5 ml differentiatiemedium om de reactie te stoppen. Pipet op en neer om EBS distantiëren in enkele cellen. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig middelgrote en resuspendeer cellen in 1 ml differentiatie medium. </li><li> Tel de cellen en verdun 2 x 10 6 cellen tot 1 x 10 5 cellen / ml in differentiatiemedium. Voeg VEGF, Bmp4 en activine A aan het medium eindconcentratie van 5 ng / ml, 0,8 ng / ml, en 5 ng / ml. Culture cellen petrischaal voor de tweede EB formatie bij 37 ° C. </li><li> 40 uur na de tweede EB vorming, transfer EBS tot 50 ml buizen. Spoelen met DPBS eenmaal dissociëren EBS met 1 ml 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min. Pipet op en neer om EBS distantiëren in enkele cellen. </li><li> Resuspendeer de cellen in StemPro-34-medium met 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF en 12,5 ng / ml FGF10. Plaat de cellen bij 2 x 10 5 / cm2 gelatine beklede platen. Cultuur in 37 ° C incubator voor ongeveer 32 uur voordat CPC isolement. </li></ol></li><li> Isoleer mCPCs <ol><li> Zuig medium en spoel af met DPBS. Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine cultuur platen bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 4,5 ml differentiatiemedium om de reactie te stoppen. Pipet op en neer om EBS distantiëren in enkele cellen. Verzamel de cellen door centrifugeren en hersuspenderen cellen in 2% FBS / PBS voor FACS-zuivering. </li><li> Run ongedifferentieerde SER op sorteerder als de negatieve controle. Verandering spanning naar voren scat passenter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) om de gewenste populatie te selecteren. Gebruik voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing en voorwaartse verstrooiing hoogte versus breedte aan puin en wambuis uit te sluiten. In de geselecteerde sub-populatie, volgens de verdeling van de ESC controles, trek je een poort van YFP- positief op histogram naar cel autofluorescence elimineren. Verzamel YFP + CPC&#39;s van YFP- + gating. </li><li> Plate het gezuiverde CPC (YFP + cellen) in 6-well platen met differentiatie medium (1.3.1). Cultuur extra 3-5 dagen bij 37 ° C gedurende differentiatie van CPC in hartspiercellen en gladde spiercellen. </li></ol></li></ol> 2. Afleiding van menselijke embryonale CPC&#39;s van Human SER <ol><li> Bereid Voeders <ol><li> Bereid muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-laag zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 2 x 10 4 / cm2. </li></ol></li><li> Handhaaf de menselijke SER <ol><li> Handhaaf de menselijke ISL1: cre; pCAG-Flox-STOP-Flox-GFP of RFP SER routinematig op MEF met behulp van reguliere hESC medium (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, 10 ng / ml basis FGF). Voorafgaand aan cardiale differentiatie, overdragen menselijke SER in feeder gratis voorwaarde voor ten minste 2 passages. </li></ol></li><li> Bereid de menselijke SER in feeder vrije toestand <ol><li> Bereid beklede platen voor menselijke SER cultuur. <ol><li> Dooi matrigel bij 4 ° C gedurende de nacht. Zet een 50 ml buis op ijs en voeg 30 ml koud DMEM / F12-medium in de buis. </li><li> Voeg 1 ml matrigel in het koude medium en meng goed. Voeg 1 ml koude Matrigel-DMEM / 12 medium in een putje van 6-well plaat of 5 ml in een 10 cm schaal. </li><li> Laat platen / schotels bij 4 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Zuig medium vóór gebruik. </li></ol></li><li> Gesplitst menselijk SER op de platen: Aspireren media uit MEF plaat en spoel de menselijke SER met DPBS. Voeg vervolgens 1 ml dispase (1 mg / ml) om een ​​putje van 6-wells plaat. Incubeer cellen bij 37 ° Cincubator tot randen van kolonies gaan los. </li><li> Verwijder dispase oplossing. Spoelen met DPBS tweemaal, voeg dan 2,5 ml / per putje mTeSR medium of MEF-geconditioneerd medium aan de plaat. </li><li> Schraap cellen met behulp van een cel schraper en zorgvuldig pipet op en neer om de menselijke ESC kolonies breken in kleine groepjes. </li><li> Breng de ESC bosjes en verdun 1: 3 in de beklede platen. </li><li> Voeg 2 ml / putje mTeSR medium of MEF-geconditioneerd medium en dagelijks veranderen medium. </li><li> Cultuur menselijke SER in mTeSR middelgrote of MEF-geconditioneerd medium op gecoate platen gedurende minstens 2 passages. </li></ol></li><li> Induceren CPC differentiatie van menselijke SER <ol><li> Wanneer cellen zijn ~ 90% confluent, zuig het medium en spoel af met DPBS. Incubeer daarna de hESCs in 0,5 mg / ml Dispase bij 37 ° C gedurende 20 min. </li><li> Spoel de hESCs met DPBS twee keer, verwijder cellen van platen met een mobiele tillift, vervolgens opnieuw in suspensie cel klemmen in differentiatie medium (DMEM / F12 met 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mML-glutamine, 0,1 mM β-mercaptoethanol en 50 ug / ml ascorbinezuur). </li><li> Transfer cellen in 6-well ultralage bevestigingsplaten voor EB vorming. </li><li> Veranderen volgende dag differentiatie medium. </li><li> Vervang medium om de 3 dagen en EBS te behouden in suspensie cultuur. </li></ol></li><li> Isoleer HCPCS <ol><li> Verzamel EBS uiterlijk dag 9 van differentiatie voor menselijke CPC isolement. </li><li> Zuig medium en spoel EVSA met DPBS tweemaal. Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine aan elk putje van 6-putjes platen bij 37 ° C gedurende 5 min. </li><li> Voeg gelijke volume differentiatiemedium om de reactie te stoppen. Pipet op en neer om EBS distantiëren in enkele cellen. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer cellen in 2% FBS / DPBS. Filter cellen met 40 micrometer cel zeef en FACS-gezuiverde de RFP + CPC-cellen zoals beschreven in 1.4.3. </li><li> Plaat naargelang HCPCS op-geltin gecoate platen. Cultuur HCPCS in differentiatie medium voor 7-9 Dagen te differentiëren in cardiomyocyten en gladde spiercellen. 7 dagen na plating, cultuur gedifferentieerde cellen met 5% Knockout SR in DMEM / F12-medium. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li>
<li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1%3A+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li>
<li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li>
<li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li>
<li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li>
<li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3A+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li>
<li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dit protocol combineert een methode met behulp van groeifactoren om mESCs-differentiatie en spontane differentiatie van humane ESCs in CPCs te begeleiden. CPC-lijn gemarkeerd met een fluorescerende reporter wordt gebruikt om CPCs efficiënt te identificeren en te isoleren door FACS. De door FACS gezuiverde CPCs behouden het vermogen om te differentiëren in cardiomyocyten, gladde spier en endotheelcellen en hebben een vergelijkbaar expressieprofiel als de in vivo cellen. Daarom kunnen deze CPCs dienen als een geweldige bro...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Hart-en vaatziekten nog steeds de belangrijkste oorzaak in de wereld van vandaag en de sterftecijfers hebben vrijwel onveranderd gebleven in de afgelopen twee decennia (American Heart Association). Er is dringend behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën om effectief te voorkomen of om te keren hartfalen. Een veelbelovende strategie-celtherapie na de snelle ontwikkeling van stamcelbiologie 1. In dit opzicht zou multipotente CPC een uitstekende bron cel voor de therapie vanwege hun vermogen tot prolifereren doch slechts gehouden cardiale lineage differentiatie. Daarom efficiënte en robuuste methode te genereren en te isoleren CPC is van groot belang voor hart celtherapie. Dit protocol is gericht op embryonale CPC&#39;s die tijdens de vroege embryogenese en hoe hun generatie van de SER. Verschillende getuigschriften zijn geïsoleerd uit embryonale en volwassen harten, zelfs uit beenmerg 2. Tijdens de ontwikkeling van het embryo, bot morphogesche eiwitten (BMP&#39;s), vleugelloze-type MMTV integratieplaats familieleden (Wnt) en Nodal signalen van de inzet van de Mesp1 + multipotente mesoderm 3 induceren. Mesp1 + cellen vervolgens differentiëren in de embryonale CPC 4. Deze CPC&#39;s worden doorgaans gekenmerkt door HCN4, NK2- homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-doos 5 (Tbx5), en myocyte enhancer factor 2C (MEF2C), vormen de primaire en tweede hart velden, en bijdragen aan het grote delen van het hart tijdens cardiogenese 5-10. Zowel Nkx2-5 + en Isl1 + / MEF2C + CPC&#39;s zijn in staat om te differentiëren in hartspiercellen, gladde spiercellen (SMC) en endotheelcellen 5-8. Dus deze CPC&#39;s zullen leiden tot cardiale bloedvaten evenals hartweefsels geven en zijn een ideale bron van cellen voor cel-gebaseerde hart therapie. Bijgevolg is het genereren van CPC&#39;s in vitro heeft een groot onderzoeksproject focus op cardiovasculaire studies geweest. Sinds SER hebben onbeperkt capaciteitsuitbreiding eennd vertegenwoordigen de ICM cellen in het blastocyststadium, is de differentiatie van de SER in embryonale CPC&#39;s als gevolg van de natuurlijke embryogenese beschouwd als een logische en effectieve aanpak van CPC&#39;s te verkrijgen. Een grote schaal toegepast aanpak van CPC&#39;s te verkrijgen van de SER is het SER aggregeren tot EBS 11. Om de differentiatie efficiëntie, gedefinieerde chemische en groeifactoren gebaseerd op de kennis van hartontwikkeling gebruikt 12-14. Er zijn echter geen definitieve CPC markers, met name niet celoppervlak markers, die wijd geaccepteerd in het veld. Om dit probleem aan te pakken, SER&#39;s zijn ontworpen om Isl1 + of MEF2C + CPC&#39;s en hun derivaten met TL-verslaggevers met behulp van Cre / loxP systeem te markeren. Het cre recombinase stoot in onder besturing van Isl1 / MEF2C promoter / enhancer. Gemodificeerde fluorescerend eiwit RFP of YFP-gen aangedreven door een constitutieve promoter kan worden geactiveerd door excisie van flox stopcodon met cre-recombinase(ISL1: cre; pCAG-Flox-STOP-Flox-GFP of RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) 5,6. Zodra de SER worden gedifferentieerd in tweede hart veld CPC&#39;s, zal Isl1 / MEF2C promotor / enhancer gedreven cre de tl-reporters activeren en CPC&#39;s kunnen worden verrijkt door FACS-zuivering. In het kort wordt EB aggregatie gebruikt ESC differentiatie initiëren. Om differentiatie efficiëntie, worden de gedifferentieerde cellen behandeld met ascorbinezuur (AA) en groeifactoren zoals Bmp4, activine A en VEGF 13,15. Dit protocol maakt robuuste en efficiënte CPC differentiatie met behulp van zowel muis en mens SER.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo scentific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Knockout SR</td><td>Life technology</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life technology</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technology</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life technology</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life technology</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life technology</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life technology</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12</td><td>Life technology</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technology</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life technology</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Life technology</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life technology</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34</td><td>Life technology</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technology</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Life technology</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>Life technology</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Ascobic Acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Bmp4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>ActivinA</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fgf10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>Stemcell technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

afleiding van cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cellen (CPCs) hebben de capaciteit om te differentiëren in cardiomyocyten, gladde spiercellen (SMC) en endotheelcellen en beloven veel in celtherapie tegen hartziekten. Van de verschillende methoden om CPCs te isoleren, trekt differentiatie van embryonale stamcellen (ESC) in CPCs veel aandacht in het veld omdat ESC's een onbeperkte celbron kunnen bieden. Als gevolg hiervan zijn er talrijke strategieën ontwikkeld om CPCs van ESC's af te leiden. In dit protocol wordt de differentiatie en zuivering van embryonale CPCs van zowel muis als menselijke ESC's beschreven. Vanwege de moeilijkheid om celoppervlaktemarkers te gebruiken om embryonale CPCs te isoleren, worden ESC's gemodificeerd met fluorescente reporters die worden geactiveerd door CPC-specifieke cre recombinase-expressie. Hierdoor kunnen CPC's worden verrijkt door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Dit protocol illustreert procedures om embryoïde lichamen (EB's) te vormen van ESC's voor CPC-specificatie en verrijking. De geïsoleerde CPCs kunnen vervolgens worden gekweekt voor differentiatie van de hartlijn en andere biologische analyses. Dit protocol is geoptimaliseerd voor robuuste en efficiënte afleiding van CPC's van zowel muis als menselijke ESC's.

Het protocol geeft afleiding van CPC&#39;s uit verschillende ES cellijnen. SER&#39;s worden samengevoegd om te vormen EBS te differentiëren in CPC&#39;s. SER&#39;s worden routinematig bijgehouden op MEF feeders (Figuur 1A, F) en feeders worden verwijderd voordat de differentiatie. Na aggregatie SER in EBS in differentiatiemedium (Figuur 1B, G), worden de tweede gevormd EBS behandeld met Bmp4 en activine A het mesoderm differentiatie in muizen cellijnen (figuur 1C) verst...

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane of muishart-voorlopercellen te genereren uit embryonale stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst te kweken in hoogwaardige embryonale stamcellen of e ESC's of muis-embryonale feedercellen of mythen. In de tweede stap worden de cellen overgebracht naar gelatine-gecoate petrischalen om de vorming van de eerste embryolichamen te vergemakkelijken.Vervolgens worden de cellen geassocieerd en worden groeifactoren toegevoegd aan de culturen om de tweede vorm van embryolichamen te induceren. In de laatste stap worden de embryolichamen opnieuw gedissocieerd en worden de resulterende cellen behandeld met aanvullende groeifactoren. Uiteindelijk kunnen de hart-nageslachtcellen verder worden gekweekt voor cardiomyocyte- en gladde spierceldifferentiatie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de differentiatie-efficiëntie van elke cellijn te testen om de selectie van de cellen met het beste cardiogene potentieel mogelijk te maken. Nu zal Dr.Inland Lamb, een postdoc-fellow in het laboratorium, de procedure demonstreren Om differentiatie van hart-voorlopercellen te induceren van muis-embryolichamen Begin met het kweken van muis e E

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Het algemene doel van dit artikel is op de standaardisering van het protocol voor de isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen (CSCs) vanuit het hart van de volwassen muis. Hier beschrijven we een dichtheid kleurovergang centrifugeren methode om te isoleren lymfkliertest CSCs en uitgewerkte methoden voor CSC cultuur, proliferatie en differentiatie in cardiomyocytes.

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Leer cardiale stamcellen afleiden uit embryonale stamcellen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemarkers. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartontwikkeling en regeneratieve geneeskunde.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Meer video's verkennen