Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle
January 12th, 2015
De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om de twee belangrijkste celpopulaties die zijn verkregen uit menselijke spierbiopsiemonsters met een hoge efficiëntie en opbrengst te scheiden om de evaluatie van specifieke fenotypische en transcriptiefactormarkers mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een menselijke spierbiopsiemonster te dissociëren in een enkele celsuspensie. In de tweede stap. Na een zevendaagse cultuur worden de cellen gescheiden door immunomagnetisch parelkettingsortering in CD 56-positieve, wat myogene cellen zijn, en CD 56-negatieve fracties, wat de fibroblasten zijn.
De cellen worden vervolgens gekleurd en geïmager voor de gewenste fenotypische en eiwitmarkers van belang. Uiteindelijk kunnen immunofluorescencemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse worden gebruikt om de intensiteit van geselecteerde in het kern gelokaliseerde transcriptiefactoren binnen de gesorteerd cellenpopulaties te meten. De belangrijkste voordelen van deze techniek, die immunomagnetisch celsortering gebruikt in plaats van bestaande methoden zoals fluorescentiegeactiveerde celsortering, zijn dat het voorzichtig is, uitstekende sortering van menselijke primaire spiercellen met hoge opbrengst en levensvatbaarheid mogelijk maakt en snel kan worden uitgevoerd.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het vergroten van ons begrip van de cellulaire basis van de fibrovettige spierregeneratie die wordt waargenomen bij veroudering, evenals bij een aantal spierpathologieën Om de van spier afgeleide voorlopercellen zo snel mogelijk na het verkrijgen van de biopsie te isoleren. Bepaal eerst het gewicht van het weefselmonster en zwel vervolgens de spier in basaal medium meerdere keren op om het monster te wassen van overtollig bloed. Laat de spier gedurende 30 tot 60 seconden bij kamertemperatuur sedimenteren en zuig vervolgens alles behalve de laatste twee tot drie milliliter medium uit de buis.
Keer vervolgens de buis om op een steriele petrischaal om het resterende vocht te laten dragen van de spier op de schaal. Reinig nu het monster van eventuele zichtbare stukken duidelijk vet of bindweefsel. Draai vervolgens de schaal om het resterende medium te mobiliseren en zuig vervolgens al het medium op en voeg drie milliliter van een collageen en disbe-enzymoplossing toe per 100 tot 400 milligram weefsel, en snijd het spiermonster in zeer kleine kubusjes van één tot twee millimeter.
Wanneer het monster voldoende gesneden is. Gebruik een brede 25 milliliter pipet om de weefselfragmenten en enzymoplossing over te brengen in een steriele 10 tot 20 milliliter conische buis. Was de plaat met nog eens drie milliliter enzymoplossing en gebruik vervolgens een 10 milliliter pipet om eventuele resterende spierfragmenten naar de buis over te brengen.
Plaats de buis gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Schud de weefselsuspensie elke 15 minuten met een 10 milliliter pipet. Beëindig vervolgens de enzymatische dissociatie met ten minste een gelijkwaardige hoeveelheid vers opgewarmd groeimedium.
Passeer vervolgens de celsuspensie door een 100 micrometer filter om eventuele grote stukken puin te verwijderen en centrifugeer vervolgens de cellen. Suspensie van het pellet in zeven tot acht milliliter groeimedium, en incubeer vervolgens de cellen in een ongecoate T 25 weefselkweekflacon. Bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende zeven dagen.
Aan het einde van de week trypsiniseren de celmonolaag gedurende drie minuten. Wanneer de cellen zijn losgekoppeld, voeg vijf tot 10 milliliter skeletspiergroei toe, medium om oververtering te voorkomen en pellet de cellen door centrifugatie. Reserveer vervolgens na het tellen enkele van de cellen voor karakterisering van cellijnmarkers en was de resterende cellen in 15 milliliter PBS centrifuge opnieuw.
Resuspendeer ditmaal het pellet in 170 microliters kamertemperatuur max-sorteerbuffer en pipet zachtjes om te resuspenderen. Suspensie van de cellen in 35 microliters van goed gemengde anti CD 56-antilichaam-geconjugeerde magnetische microkralen. Meng de celoplossing een paar keer door pipetteren en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius met zachte vegetatie.
Op het halve punt na de incubatie, was de cel- en pareloplossing met 10 milliliter sorteerbuffer centrifuge en hergebruik. Suspensie van het pellet in één milliliter verse sorteerbuffer. Smeer vervolgens de pres-scheidingsfilter en -kolom met 500 microliters sorteringsbuffer.
En meng vervolgens onmiddellijk en breng de volledige één milliliter celsuspensie over door de pres-scheidingsfilter en in de kolom, spoel de kolom drie keer met één milliliter sorteringsbuffer power wash, verzamel de niet-gehouden fibroblastfractie, passeer door de kolom in een steriele 50 milliliter conische buis met een kleine hoeveelheid groeimedium. Verwijder vervolgens de kolom van de magneet en drukt de plunjer in de bovenkant van de kolom om de CD 56-positieve celfractie te verzamelen. In een aparte 50 milliliter conische buis met warm groeimedium, wordt groeimedium uitgezonden vanaf deze stap.
Als dubbele sorteerwerking moet worden uitgevoerd, overweeg dan de positieve en negatieve verzamelde celfracties. Als dubbele sorteerwerking vereist is voor extra zuiverheid, plaats geen medium in de CD 56-positieve verzamelbuis bij de eerste sorteerwerking, maar herhaal de stappen beginnend bij de filter- en kolomsmering bij het juiste experimentele eindpunt. Bevestig de CD 56-positieve celculturen in hun kweekmedium, met behulp van een gelijkwaardig volume ijskoud, 8% paraformaldehyde.
De 10 minuten met zachte vegetatie. Aspibeer vervolgens het fixeermiddel en was de cellen twee keer met PBS om de celoppervlakteantigenen te immunokleuren. Blokkeer de cellen gedurende ten minste een uur in 1% BSA in PBS, en label vervolgens de cellen met de relevante primaire en vervolgens secundaire antilichamen.
Optimaliseer de detectorversterking, laservermogen en belichtinstellingen die relevant zijn voor uw microscoop en kleurstof. Voordat u beeldt, neemt u de afbeeldingen van de cellen in het gewenste aantal detectiekanalen en in meer dan zes verschillende gezichtsvelden. Voor analyse opent
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de efficiënte scheiding van myogene cellen en fibroblasten uit humane spierbiopsiemonsters. Met behulp van immunomagnetisch celsorteren op basis van het CD56-antigeen, maakt de techniek een hoge opbrengst en levensvatbaarheid van de gesorteerd cellen mogelijk.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Analyse van spierweefsel
- Immunologie
Achtergrond
- Menselijk spierweefsel bevat verschillende celtypen, voornamelijk myogene cellen en fibroblasten.
- Efficiënte scheiding van deze cellen is cruciaal voor het bestuderen van hun specifieke markers.
- Traditionele methoden leveren mogelijk niet de gewenste opbrengst en levensvatbaarheid op.
- Immunomagnetisch sorteren biedt een zachter alternatief voor fluorescentie-geactiveerd celsorteren.
Doel van het onderzoek
- Om myogene cellen en fibroblasten uit humane spiermonsters te scheiden.
- Om specifieke fenotypische en transcriptiefactor-markers in deze celpopulaties te evalueren.
- Om de efficiëntie en opbrengst van celsorteertechnieken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissociatie van spierbiopsiemonsters in enkele celsuspensies.
- Immunomagnetisch sorteren op basis van CD56-antigeen om celpopulaties te isoleren.
- Kleuring en beeldvorming van cellen voor fenotypische en eiwitmarkers.
- Kwantitatieve beeldanalyse om transcriptiefactorintensiteit te meten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle scheiding van CD56-positieve myogene cellen en CD56-negatieve fibroblasten.
- Hoge opbrengst en levensvatbaarheid van gesorteerd cellen in vergelijking met traditionele methoden.
- Effectieve kwantificering van in de kern gelokaliseerde transcriptiefactoren.
- Demonstratie van de voordelen van immunomagnetisch sorteren.
Conclusies
- Immunomagnetisch celsorteren is een haalbare methode voor het isoleren van spiercelpopulaties.
- Deze techniek verbetert de studie van spiercelkenmerken en -functies.
- Toekomstige toepassingen kunnen verdere exploratie van spierbiologie en -pathologie omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and quantitative characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle directly supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in muscle biology research. High-purity cell populations enable robust interrogation of cell fate, transcriptional regulation, and disease-relevant pathways, informing portfolio decisions in regenerative medicine and muscle pathology programs. This workflow enhances predictive confidence for downstream screening and translational studies by providing standardized, reproducible cellular systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise evaluation of phenotypic and transcription factor markers in purified human muscle cell populations.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing myogenic from fibroblast-driven pathways in muscle degeneration and regeneration.
- Facilitates hypothesis-driven studies on cell fate decisions relevant to muscle pathology and aging.
Screening & Assay Development
- Provides validated, high-purity cell systems for quantitative immunocytochemical assays.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing mixed-cell population variability.
- Enables reliable measurement of nuclear transcription factor expression for compound or intervention screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cellular mechanisms observed in human muscle pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct comparison of cell-type specific responses.
- Reduces translational risk by using primary human cells with well-characterized phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized platform for hypothesis testing, quantitative readouts, and mechanistic validation in muscle research.
- Discovery Biology: Enables robust null hypothesis testing and pathway clarification using purified cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible systems for quantitative immunofluorescence and image analysis.
- Analytics: Supports objective measurement of nuclear transcription factor intensity and cell phenotype distribution.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant mechanisms in human muscle samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating and characterizing primary muscle cells across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in muscle cell research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation and analysis workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing high-quality, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle biology and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, immunomagnetic sorting, and quantitative image analysis.
- Needs access to cell culture, magnetic sorting instrumentation, and advanced microscopy platforms.
- Demands cross-team standardization of antibody panels and image analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or disease models.
- Yield and purity depend on biopsy quality and adherence to protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Isolating Muscle-derived Precursor Cells
3:48
Immunomagnetic Bead Sorting of CD56+ Cells
6:17
Image Processing and Analysis of Fluorescently Labeled Nuclear Transcription Factors
8:58
Results: Representative Characterization of Primary Human Skeletal Muscle Myogenic and Fibroblast Cells
10:43
Conclusion
