Name: Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer myogene cellen en fibroblasten isoleren uit menselijk spierweefsel met immunomagnetische sortering op basis van CD56. Deze methode biedt hoge opbrengst en levensvatbaarheid voor kwantitatieve immunocytochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Carl Hobbs en Lindsey Majoram bedanken voor hun technische assistentie, en professor Pat Doherty voor het gebruik van microscopiefaciliteiten. Dr. Agley werd ondersteund door een beurs van King’s College London. Financiering van de Spurrell Trust wordt ook erkend.

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+the+Muscle+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche.</a> Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
<li>Timpl, R., Kvonder Mark, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+fibronectin+in+selecting+myogenic+versus+fibrogenic+cells+from+skeletal+muscle+cells+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in.</a> 117, 628-635 (1986).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Meth. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+O+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+Focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+seeing+is+not+believing%3A+improving+the+visibility+of+your+fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We hebben een immunomagentic sorteren procedure beschreven voor de selectieve verrijking van de menselijke spier-afgeleide voorlopers van kleine monsters van spierbiopsie materiaal. Deze techniek onschatbare waarde in ons laboratorium voor het overwinnen van het verlies van menselijk spier afgeleide culturen fibroblasten, maar ook voor het begrijpen van de unieke gedrag van verschillende populaties van spier afgeleide voorlopercellen. Eenmaal gezuiverd myogene cellen kunnen worden onderzocht op veranderingen in eiwit en...

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen 1, de myogene stamcellen 2,3. In vivo deze cellen bestaan ​​in een reversibel rusttoestand gelegen tussen de sarcolemma en basale lamina van elke myofibre, maar geactiveerd worden om te woekeren, zekering en differentiëren spierweefsel beschadigd, gerepareerd en geregenereerd 3. Satelliet-cellen kunnen worden geïsoleerd uit jonge en oudere humane spierbiopsie monsters middels enzymatische digestie 4 en de myogene eigenschappen kunnen vervolgens worden onderzocht in primaire kweek 5. De efficiëntie van dit isolatieproces met betrekking tot zowel opbrengst en zuiverheid van de celpopulatie afhankelijk van de gebruikte methoden en kunnen verschillen van monster tot monster. De twee belangrijkste aanhanger celtypen verkregen van enzymatische afbraak zijn de satelliet cellen (nu genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), aanvankelijk geïdentificeerd als CD56 + / desmine cellen, en mu-SCLE afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 - en TE7 + cellen 5. Fibroblasten hebben een snelle proliferatieve tarief en geen onomkeerbare groeistop en terminale differentiatie op cel-cel contact achtige myogene cellen niet ondergaan; dus in gemengde populatie, kan fibroblasten myogene cellen overspoeld met de cultuur domineren. Fibroblasten vaak gezien als een irritatie voor spier biologen, maar er is nu een groeiende interesse in fibroblasten als cellen waard studie op zich, vooral omdat zij aangetoond dat een coöperatieve rol myogene cellen tijdens spier herstel 6 . De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide celtypen in kweek te onderzoeken. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode waarbij cellen kan worden gesorteerd voor verdere studie en / of geteld engeanalyseerd. FACS is aangetoond betrouwbaar verrijken menselijke myogene cellen, maar de opbrengst aan cellen voor verdere kweek is vooralsnog niet hoog 7 geweest. Gezien de beperkte replicatie potentieel van somatische cellen, zoals satelliet-cel-afgeleide myogene cellen en de zeer slechte proliferatie en differentiatie in verband met veroudering 4, zijn meer zachte aanpak vereist. Single spiervezels culturen bieden een andere, minder agressief, betekent het verkrijgen van muizen satelliet-cellen nog in hun sublaminal niche en na hun activering in cultuur 8,9 inwoner. Dit is echter vaak niet mogelijk uit menselijke spierbiopsie materiaal (omdat vezels nauwelijks zijn te verkrijgen pees pees) waardoor deze techniek niet toegankelijk voor veel onderzoekslaboratoria geïnteresseerd om menselijke spier afgeleide cellen zijn. Bovendien is de enkele vezel techniek maar korte tijd celaantallen. Hier een sorteersysteem gebaseerd op het gen beschrijven weTLE enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door twee opeenvolgende ronden van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dat zowel een hoge zuiverheid (&gt; 95% myogene cellen) en opbrengst (~ geeft 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel) voor experimenten in de cultuur. CD56 wordt beschouwd als de gouden standaard oppervlak marker voor de identificatie van menselijke satelliet cellen in situ 10 en in vitro 11 en de ideale oppervlaktemerker kandidaat voor kralen bevestiging. In deze benadering CD56 antilichamen geconjugeerd aan ijzeroxide en polysaccharide bevattende superparamagnetische gebonden aan cellen en door een hooggradiënte magnetische celscheidingskolom geplaatst in een sterk magnetisch veld 12,13. De scheiding kolommen zijn gevuld met een matrix van ferromagnetische staalwol of ijzeren bolletjes die dienen om magnetische veldlijnen zich aan hun oppervlak die sterke magnetische veld gradiënten (~ 4tesla) 14. In deze kolommen zelfs licht magnetische cellen worden aangetrokken en geadsorbeerd aan het oppervlak 14. Ongebonden (CD56 -) cellen passeren de kolom terwijl CD56 + cellen gelabeld met magnetische microbolletjes worden behouden tot verwijdering uit het magnetische veld 12,15. Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kan worden geplateerd op de gewenste dichtheid voor verdere experimenten. Naar aanleiding van een bepaalde interventie van de cellulaire bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunocytochemie, afgebeeld met behulp van wide-field of confocale fluorescentie microscopie en kwantitatief geanalyseerd met behulp van een beeldanalyse aanpak die een snelle objectieve meting van alle gelabelde cellen in een bepaalde afbeelding maakt. In ons laboratorium hebben we deze dubbele immunomagnetische sortering benadering gevolgd door beeldanalyse 16 gebruikt om dat CD56 te tonen - de menselijke fibroblasten gemakkelijk transdifferentiëren tot adipocyten, terwijl myogenic cels satelliet oorsprong zijn zeer resistent tegen deze adipogene omzetting 5.

<table><tbody><tr><td>Collagenase&nbsp; D</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>Moet voor gebruik gefilterd worden</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>(Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956;m cel zeef</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Collageen oplossing ( 3 mg/ml in 0.1% azijnzuur)</td><td>Sigma, Dorset, UK</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 spuitfilter (0.2 &#956;m)</td><td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>Polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan</td></tr><tr><td>CD56 humane Microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>Let op de beperkte houdbaarheid van microbeads</td></tr><tr><td>Anti- fibroblast Microbeads, menselijk</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Voorafscheidingsfilters</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Grote celkolommen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>Deze kolommen worden geleverd met een flow resistor. Het gebruik van de flow resistor is niet nodig om de hoge myogene zuiverheden hier beschreven te verkrijgen.</td></tr><tr><td>LS kolommen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>Deze separator past op de grote celkolom, maar niet op de LS kolom.&nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Moet voor gebruik gefilterd worden</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Triethylfosfaat</td><td>Sigma</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papier</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>Nr. 42, Asloos. Om het filter voor te bereiden, vouw het ronde filterpapier om een halve cirkel te maken, vouw vervolgens de halve cirkel nogmaals in het half om een kegelvorm te vormen. Plaats de kegel in een trechter voor het filteren.&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Dit kan worden gekocht met of zonder DAPI en dooft geen initiële fluorescentie.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Contact Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe (gekocht bij Pugh Computers)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en kwantitatieve immunocytochemische karakterisering van primaire myogene cellen en fibroblasten van human skeletal muscle

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen, die de bewoner spierstamcellen zijn. Deze kunnen worden geïsoleerd uit menselijke spier biopten middels enzymatische digestie en hun myogene eigenschappen bestudeerd in kweek. Kwantitatief de twee hechtende celtypen verkregen enzymatische digestie zijn: (i) de satelliet cellen (genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), oorspronkelijk geïdentificeerd als CD56 + en later als CD56 + / desmine + cellen en (ii) spier- afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 - en TE-7 +. Fibroblasten vermenigvuldigen zeer efficiënt in de cultuur en in gemengde celpopulaties deze cellen myogene cellen aan de cultuur domineren kan overlopen. De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide typen cellen in kweek te onderzoeken. Hier descr weIbe een sorteersysteem gebaseerd op de zachte enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door magnetische celsortering (MACS) dat een hoge zuiverheid (&gt; 95% myogene cellen) en goede opbrengst (~ geeft beide 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel na 7 dagen in vitro) voor experimenten in de cultuur. Deze benadering is gebaseerd op het incuberen van het gemengde spier afgeleide celpopulatie met magnetische microbolletjes beads geconjugeerd met een antilichaam tegen CD56 en vervolgens passeren cellen hoewel een magnetisch veld. CD56 + cellen gebonden aan microbolletjes worden bewaard door het veld, terwijl CD56 - cellen passeren ongehinderd door de kolom. Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kunnen worden uitgeplaat en gekweekt. Na een bepaalde ingreep, celmorfologie en de expressie en lokalisatie van eiwitten inclusief nucleaire transcriptiefactoren kan worden gekwantificeerd middels immunofluorescentie labeling met specifieke antilichamen en een afbeelding pEHANDELING en analyse pakket.

Gezuiverde myogene cellen en fibroblasten worden gekweekt in adipogene differentiatie medium gedurende drie dagen, gevolgd door adipogenic voedings- middel van ergens tussen 7-30 dagen op hun vermogen om adipogenese beoordelen. De gezuiverde celpopulaties, Oil Red O kleuring in combinatie met immunokleuring voor adipogene en myogene lineage markers bleek dat alleen de fibroblast fractie staat adipogene differentiatie (figuur 2) was. De massieve ophoping van vet door de fibroblasten is zichtbaar voor het...

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Het algemene doel van deze procedure is om de twee belangrijkste celpopulaties die zijn verkregen uit menselijke spierbiopsiemonsters met een hoge efficiëntie en opbrengst te scheiden om de evaluatie van specifieke fenotypische en transcriptiefactormarkers mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een menselijke spierbiopsiemonster te dissociëren in een enkele celsuspensie. In de tweede stap. Na een zevendaagse cultuur worden de cellen gescheiden door immunomagnetisch parelkettingsortering in CD 56-positieve, wat myogene cellen zijn, en CD 56-negatieve fracties, wat de fibroblasten zijn.De cellen worden vervolgens gekleurd en geïmager voor de gewenste fenotypische en eiwitmarkers van belang. Uiteindelijk kunnen immunofluorescencemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse worden gebruikt om de intensiteit van geselecteerde in het kern gelokaliseerde transcriptiefactoren binnen de gesorteerd cellenpopulaties te meten. De belangrijkste voordelen van deze techniek, die immunomagnetisch celsortering gebruikt in plaats van bestaande methoden zoals fluorescentiegeactiveerde celsortering, zijn dat het voorzichtig is, uitstekende sortering van menselijke primaire spiercellen met hoge opbrengst en levensvatbaarheid mogelijk maakt en snel kan worden uitgevoerd.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het vergroten van ons begrip van de cellulaire basis van de fibrovettige spierregeneratie die wordt waargenomen bij veroudering, evenals bij een aantal spierpathologieën Om de van spier afgeleide voorlopercellen zo snel mogelijk na het verkrijgen van de biopsie te isoleren. Bepaal eerst het gewicht van het weefselmonster en zwel vervolgens de spier in basaal medium meerdere keren op om het monster te wassen van overtollig bloed. Laat de spier gedurende 30 tot 60 seconden bij kamertemperatuur sedimenteren en zuig vervolgens alles behalve de laatste twee tot drie milliliter medium uit de buis.Keer vervolgens de buis om op een steriele petrischaal om het resterende vocht te laten dragen van de spier op de schaal. Reinig nu het monster van eventuele zichtbare stukken duidelijk vet of bindweefsel. Draai vervolgens de schaal om het resterende medium te mobiliseren en zuig vervolgens al het medium op en voeg drie milliliter van een collageen en disbe-enzymoplossing toe per 100 tot 400 milligram weefsel, en snijd het spiermonster in zeer kleine kubusjes van één tot twee millimeter.Wanneer het monster voldoende gesneden is. Gebruik een brede 25 milliliter pipet om de weefselfragmenten en enzymoplossing over te brengen in een steriele 10 tot 20 milliliter conische buis. Was de plaat met nog eens drie milliliter enzymoplossing en gebruik vervolgens een 10 milliliter pipet om eventuele resterende spierfragmenten naar de buis over te brengen.Plaats de buis gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Schud de weefselsuspensie elke 15 minuten met een 10 milliliter pipet. Beëindig vervolgens de enzymatische dissociatie met ten minste een gelijkwaardige hoeveelheid vers opgewarmd groeimedium.Passeer vervolgens de celsuspensie door een 100 micrometer filter om eventuele grote stukken puin te verwijderen en centrifugeer vervolgens de cellen. Suspensie van het pellet in zeven tot acht milliliter groeimedium, en incubeer vervolgens de cellen in een ongecoate T 25 weefselkweekflacon. Bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende zeven dagen.Aan het einde van de week trypsiniseren de celmonolaag gedurende drie minuten. Wanneer de cellen zijn losgekoppeld, voeg vijf tot 10 milliliter skeletspiergroei toe, medium om oververtering te voorkomen en pellet de cellen door centrifugatie. Reserveer vervolgens na het tellen enkele van de cellen voor karakterisering van cellijnmarkers en was de resterende cellen in 15 milliliter PBS centrifuge opnieuw.Resuspendeer ditmaal het pellet in 170 microliters kamertemperatuur max-sorteerbuffer en pipet zachtjes om te resuspenderen. Suspensie van de cellen in 35 microliters van goed gemengde anti CD 56-antilichaam-geconjugeerde magnetische microkralen. Meng de celoplossing een paar keer door pipetteren en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius met zachte vegetatie.Op het halve punt na de incubatie, was de cel- en pareloplossing met 10 milliliter sorteerbuffer centrifuge en hergebruik. Suspensie van het pellet in één milliliter verse sorteerbuffer. Smeer vervolgens de pres-scheidingsfilter en -kolom met 500 microliters sorteringsbuffer.En meng vervolgens onmiddellijk en breng de volledige één milliliter celsuspensie over door de pres-scheidingsfilter en in de kolom, spoel de kolom drie keer met één milliliter sorteringsbuffer power wash, verzamel de niet-gehouden fibroblastfractie, passeer door de kolom in een steriele 50 milliliter conische buis met een kleine hoeveelheid groeimedium. Verwijder vervolgens de kolom van de magneet en drukt de plunjer in de bovenkant van de kolom om de CD 56-positieve celfractie te verzamelen. In een aparte 50 milliliter conische buis met warm groeimedium, wordt groeimedium uitgezonden vanaf deze stap.Als dubbele sorteerwerking moet worden uitgevoerd, overweeg dan de positieve en negatieve verzamelde celfracties. Als dubbele sorteerwerking vereist is voor extra zuiverheid, plaats geen medium in de CD 56-positieve verzamelbuis bij de eerste sorteerwerking, maar herhaal de stappen beginnend bij de filter- en kolomsmering bij het juiste experimentele eindpunt. Bevestig de CD 56-positieve celculturen in hun kweekmedium, met behulp van een gelijkwaardig volume ijskoud, 8% paraformaldehyde.De 10 minuten met zachte vegetatie. Aspibeer vervolgens het fixeermiddel en was de cellen twee keer met PBS om de celoppervlakteantigenen te immunokleuren. Blokkeer de cellen gedurende ten minste een uur in 1% BSA in PBS, en label vervolgens de cellen met de relevante primaire en vervolgens secundaire antilichamen.Optimaliseer de detectorversterking, laservermogen en belichtinstellingen die relevant zijn voor uw microscoop en kleurstof. Voordat u beeldt, neemt u de afbeeldingen van de cellen in het gewenste aantal detectiekanalen en in meer dan zes verschillende gezichtsvelden. Voor analyse opent

isolation-quantitative-immunocytochemical-characterization-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

De myofibro is een invloedrijke stromale cellen van het maagdarmkanaal die belangrijk zijn fysiologische processen reguleert zowel in normale als ziektebeelden. We beschrijven een techniek die voor de isolatie van primaire myofibroblasten van zowel muis als humaan colon weefsel, dat kan worden gebruikt voor in vitro experimenten.

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

We presenteren een protocol om primaire culturen van muis- en menselijke slokdarmstroomacellen met een myofibroblast-fenotype te genereren. De gekweekte cellen hebben een spindelvormige morfologie, drukken α-SMA en vimentin uit en missen epitheliale, hematopoëtische en endotheelcel-oppervlaktemarkers. Gekarakteriseerde stromacellen kunnen worden gebruikt in functionele studies van epitheel-stroma interacties.

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Hier beschrijven we een methodologie om een ​​pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.

Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer myogene cellen en fibroblasten isoleren uit menselijk spierweefsel met immunomagnetische sortering op basis van CD56. Deze methode biedt hoge opbrengst en levensvatbaarheid voor kwantitatieve immunocytochemische analyse.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle (Video) | JoVE Journal

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Meer video's verkennen