Stereotactische chirurgie bij knaagdieren

Stereotactische chirurgie is een krachtige techniek die wordt gebruikt om het brein van levende dieren te manipuleren. Het targeten van regio's diep in het intacte brein vormt een unieke uitdaging, aangezien het chirurgische doelwit gewoonlijk niet visueel kan worden gelokaliseerd. Stereotaxie, of stereotactische chirurgie, is ontwikkeld om discrete hersenregio's te targeten door hun ruimtelijke relatie tot zichtbare referentiepunten te benutten. Met behulp van een driedimensionaal coördinatensysteem kunnen instrumenten naar specifieke locaties worden geleid om hersenactiviteit te meten, een laesie aan te brengen of genetische manipulaties uit te voeren. Deze video behandelt de principes van stereotactische chirurgie, demonstreert de essentiële stappen van de procedure en bespreekt diverse toepassingen van de techniek.

Voordat we de procedurele details bespreken, gaan we terug naar de basisprincipes en instrumenten van de techniek. Om te beginnen: stereotaxie is afhankelijk van het lokaliseren van het doelhok van de hersenen op een driedimensionale as. Hiervoor wordt een stereotactisch atlas gebruikt. Dit document is een 3D-reconstructie van de hersenen, verkregen uit seriële coupes van gekleurde hersenen.

In dit referentiekader worden ruimtelijke relaties uitgedrukt met behulp van een set van 3 assen: anterieur-posterieur, mediaal-lateraal en dorsaal-ventraal. Om de locatie van een gebied van belang te bepalen, zoekt u het juiste hersengebied in de atlas en gebruikt u het raster om de corresponderende mediolaterale en dorsoventrale coördinaten te berekenen. De anteroposteriore coördinaat wordt onderaan of bovenaan de pagina vermeld. Deze coördinaat wordt gemeten vanaf referentiepunten op de schedel die gevormd worden door de kruisingen van botplaten, ook wel naden genoemd. Het meest prominente referentiepunt, het bregma, is gedefinieerd als het snijpunt van de sagittale naad met de coronale naad. Het punt dat bekend staat als lambda ligt meer posterieur; daar waar de sagittale naad de lambdoïde naad kruist.

Voor een nauwkeurige targeting van de berekende locatie tijdens de operatie wordt een apparaat gebruikt dat bekend staat als het stereotactisch frame. Het frame bestaat uit het hoofdframe, de micromanipulator en de probehouder, die is bevestigd aan de montageklem. Incisivo- en oorbalken maken contact met het dier om de kop in een vaste positie te houden. De micromanipulator wordt gebruikt voor de precieze beweging van chirurgische probes naar vooraf bepaalde coördinaten in de hersenen en is uitgerust met schuivende nonius-schalen voor exacte afstandmetingen in alle drie de dimensies.

Om een nonius-schaal af te lezen, identificeert u eerst de positie van de 0-lijn ten opzichte van de streepjes aan de rechterkant van de schaal. Deze kant van de schaal is gemarkeerd in stappen van 10 millimeter, zodat 1 staat voor 10 en 2 voor 20. De positie van de 0-markering hier laat zien dat de aflezing tussen 10 en 11 mm ligt. Om het eerste cijfer rechts van de komma te bepalen, zoekt u de lijn op de linker-schaal die het beste uitlijnt met een markering aan de rechterkant. Gebruik de linker-schaal om de waarde van deze markering te bepalen, wat in dit geval 9 is, waardoor de uiteindelijke aflezing 10,9 mm is.

Nu u bekend bent met de basisprincipes van stereotaxie, zullen we bekijken hoe de chirurgische procedure wordt uitgevoerd. Voorafgaand aan de operatie wordt de hoofdhuid van het geanestheseerde dier geschoren en gedesinfecteerd. Om het dier op het stereotaxische frame te fixeren, worden de oorstaven voorzichtig in de oren geplaatst en de voortanden in de snijtandstaven. Er wordt oogzalf aangebracht om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen.

Om de schedel bloot te leggen, maakt u met een scalpel een kleine incisie. Scheid het spierweefsel voorzichtig en reinig het schedeloppervlak. Gebruik vervolgens de micromanipulator om een probe naar bregma te laten zakken en noteer de dorsoventrale coördinaat. Til de probe vervolgens op en herhaal deze procedure bij lambda. Als de lambda-meting minder dan 0,1 mm afwijkt van de dorsoventrale coördinaat bij bregma, wordt de schedel als waterpas beschouwd en kunt u verdergaan. Zo niet, verhoog of verlaag dan de snijtandstaf en herhaal de metingen.

Nu de hersenen waterpas liggen, keert u terug naar bregma en registreert u de medio-laterale en antero-posterieure coördinaten. Bereken op basis van de doelcoördinaten uit de hersenatlas de benodigde bewegingen om die locatie te bereiken en verplaats de probe naar de doelpositie. Markeer deze positie op de schedel en gebruik een boor om voorzichtig een gat in het bot te maken.

Direct onder de schedel vindt u de dura, een dik duurzaam membraan dat voorzichtig kan worden ingesneden met de punt van een kleine naald.

Vervolgens wordt de arm van de micromanipulator in positie gebracht om de probe naar de beoogde dorsoventrale coördinaat te laten zakken, waarna de gewenste manipulatie kan worden uitgevoerd.

Nu u de basisstappen van de procedure begrijpt, bekijken we enkele van de vele manieren waarop neurowetenschappers stereotaxische chirurgie gebruiken om vragen in het laboratorium te beantwoorden.

Ten eerste is stereotaxie uiterst nuttig voor het toedienen van experimentele middelen in precieze hersenregio's. Deze middelen kunnen tracerkleurstoffen omvatten die worden gebruikt om neuronale projecties en connectiviteit te visualiseren, chemische verbindingen of reagentia voor genetische manipulatie van neuronen. Bijvoorbeeld, de injectie van genetisch gemodificeerde virussen zal leiden tot de aflevering van een gen van belang in de geïnfecteerde cellen. Hier werd een virus in de hippocampus geïnjecteerd, wat resulteerde in GFP-expressie in een kleine populatie neuronen.

Aan de andere kant kan virale aflevering van small interfering RNA de expressie van gewenste eiwitten voorkomen. In dit voorbeeld werd de expressie van het eiwit SOD1 onderdrukt in verschillende hersenregio's na stereotaxische injectie in het laterale ventrikel.

Als alternatief kan stereotaxische chirurgie worden gebruikt om elektroden in de hersenen te plaatsen voor het registreren van de elektrische signalen die gepaard gaan met neurale activiteit. Nadat het dier is hersteld van de chirurgische procedure, kunnen de elektroden worden verbonden met elektrofysiologische registratiesystemen om neuronale vuring te observeren terwijl de muis vrij beweegt.

Naast het meten van neuronale activiteit is stereotaxische chirurgie essentieel voor microdialyse. Deze techniek maakt continue monitoring van concentraties van geneesmiddelen, neurotransmitters of metabolieten in het hersenweefsel van wakkeren dieren mogelijk. Hiervoor wordt een kleine, met vloeistof gevulde probe met een semipermeabel membraan aan de punt geïmplanteerd in een specifieke hersenregio. Kleine opgeloste stoffen, waaronder neurotransmitters, hormonen en geneesmiddelen, diffunderen in de probe, waar ze kunnen worden verzameld voor analyse. In dit experiment werd de glucoseconcentratie in de hippocampus gemeten als een maat voor lokale neurale activiteit terwijl ratten een taak uitvoerden die het gebruik van het ruimtelijk werkgeheugen vereiste.

U heeft zojuist de video van JoVE over stereotaxische chirurgie bekeken. In deze video hebben we de principes en methoden van de procedure behandeld, evenals de vele toepassingen ervan in neurowetenschappelijke laboratoria.

Bedankt voor het kijken!