Name: Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer een snelle FISH- en immunofluorescentieprotocol voor Xist RNA-dynamiek en histonmodificaties tijdens X-chromosoom inactivatie in differentiërende embryonale stamcellen. Deze methode biedt inzicht in epigenetische regulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Hongjae Sunwoo voor het nuttige advies voor oligonucleotide-ontwerp in RNA FISH. We danken ook Serenity Curtis voor het redigeren van het manuscript. N.Y. werd ondersteund door een postdoctorale beurs voor onderzoek in het buitenland van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). Dit werk werd ondersteund door de NIH (RO1-GM102184), de March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), en de Ontwikkelingsfonds en Trustee Grant bij Cincinnati Children's Hospital Medical Center aan Y.O.

1. Probe Voorbereiding <ol><li> Het verkrijgen van meerdere unieke oligonucleotiden in Xist (20-30 nucleotide-lengte oligonucleotiden, 63-65 ºC smelttemperatuur, tabel 1) met een 5&#39;-amino modificatie en te schorten in het water. </li><li> Pool equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden met 5&#39;-amino modificatie (totaal 4,5 ug) en label met amine-reactieve fluorescerende kleurstof volgende instructies van de fabrikant. <ol><li> Los de samengevoegde oligonucleotiden in finale 5 pl nuclease-vrij water en voeg 3 ul van 1 M natriumbicarbonaat de oligonucleotide oplossing. </li><li> Voeg 2 pl DMSO aan de flacon van amine-reactieve kleurstof en vortex kort. </li><li> Meng de oligonucleotide oplossing met de reactieve kleurstof in DMSO en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. </li></ol></li><li> Zuiver het fluorescent gelabelde oligonucleotide probes door G-25 kolom, gevolgd door ethanolprecipitatie. <ol><li&gt; Centrifuge G-25 kolom bij 750 xg gedurende 1 min tot overmaat opslagbuffer verwijderen. </li><li> Voeg 40 ul nuclease-vrij water aan de etikettering mengsel verkregen in stap 1.2.3 en gelden voor de G-25 kolom. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 2 min. </li><li> Voeg 50 ul nuclease-vrij water, 10 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 250 gl ethanol de gezuiverde probe uit stap 1.3.2. Bewaren bij -80 ° C gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Was de neergeslagen oligonucleotiden eenmaal met 1 ml 70% ethanol. </li><li> Resuspendeer in 50 ul nuclease-vrij water of TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) voor een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 uM. </li></ol></li><li> Verdun de fluorescent gelabelde oligonucleotide probes tot een eindconcentratie van 250 nM met hybridisatiebuffer (10% formamide, 2x SSC [300 mM NaCl, 30 mM natriumcitraat]; 2 mg / ml BSA, 10% dextransulfaat). OPMERKING: Met deze snelle FISH protocol, oligonucleotide probes in Xist werden ontworpen en gebruikt in een hogere concentratie dan normaal FISH protocol oligonucleotideprobes te gebruiken om de incubatietijd voor hybridisatie verkorten. </li></ol> 2. Schuif Voorbereiding OPMERKING: Dia&#39;s kunnen worden voorbereid voor immuno-FISH gebruik van muis embryonale stamcellen (ES) of embryoid lichaam (EB) differentiëren cellen 20, 21 door rechtstreeks ofwel groeien ze op een poly-lysine-behandelde dia of met behulp van cytospin met celsuspensie. Hier wordt de voorbereiding dia door cytospin getoond. <ol><li> Zuig het kweekmedium in een 6-putjes. Wassen met PBS (kamertemperatuur), en zuig grondig. </li><li> Voeg 0,5 ml van trypsine aan de 6-putjes, geïncubeerd gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 5 ml medium en verspreiden cellen door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Overdracht cellen om een ​​15 ml buis centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Gooi het medium eend voorzichtig schorsen de cellen in 2 ml PBS. </li><li> Tellen cellen met hemocytometer en verdund celsuspensie bij 4 x 10 5 cellen / ml PBS. </li><li> Monteer een glijbaan, een filter-kaart en een kamer met een clip en plaats ze in de juiste sleuven in de rotor van de cytospin. Voeg 250 ul van elk bereid in stap 2.6 in elke kamer van de gemonteerde eenheden in de cytospin monster. Centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Vul 3 Coplin potten op ijs met 40 ml van ijskoude PBS, CSK buffer (10 mM PIPES, pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2), en CSKT buffer (CSK buffer met 0,5% Triton X-100), respectievelijk. </li><li> Nadat de cytospin klaar snel de schuif over in ijskoude PBS en incubeer gedurende 5 min. </li><li> Breng de dia in ijskoud CSK buffer en incubeer gedurende 1 min. </li><li> Breng de dia in ijskoud CSKT buffer en incubeer gedurende 5 min. </li><li> Breng de schuif terug in ijskoude CSK buffer en incubeer gedurende 1 min. </li><li> Breng de schuif in 4% paraformaldehyde in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Immuunfluorescentie <ol><li> Plaats de objectglaasjes in een Coplin jar met PBST (1x PBS met 0,1% Tween-20) gedurende enkele seconden. </li><li> Plaats de dia&#39;s schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof uit de dia en plaats het in een lege pipet-tip doos met water. Overlay de dia met 40 ul van blokkeeroplossing (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), plaats voorzichtig een dekglaasje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het dekglaasje, verwijder de blokkerende oplossing en voeg 40 ul van het histon H3K27me3 primaire antilichaam verdund tot een concentratie van 1: 500 in blokkeeroplossing. Plaats het dekglaasje terug op de glijbaan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Een RNase-remmer in de blokkerende oplossing zou nuttig zijn om RNA in dit RNA FIS behoudenH-protocol wanneer polyklonale antilichamen worden gebruikt. </li><li> Was schuif 2 keer Coplin potten gevuld met PBST gedurende 5 minuten elk, voorzichtig schudden tijdens het wassen. </li><li> Plaats de dia&#39;s schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof en plaats de schuif terug in de doos tip. Overlay met 40 pl van het secundaire antilichaam (1: 500) verdund in blokkerende oplossing, plaats een dekglaasje en incubeer gedurende 15 minuten in het donker. Voor de volgende stappen, blijven de glijbaan in het donker te allen tijde. </li><li> Was 2 keer Coplin potten met PBST zoals in stap 3.4. </li></ol> 4. RNA FISH met oligonucleotidenprobes <ol><li> Voorverwarmen lege pipet-tip box met water op de bodem om dia voorkomen drogen bij 37 ° C voor RNA FISH in stap 4.3. </li><li> Plaats de dia&#39;s schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof uit de dia uit stap 3.6 en plaats de dia in de pipet-tip doos met water onderaan. Voeg 500 ul van FISH wasbuffer (10% formamide in 2x SSC) op het objectglaasje en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder FISH wasoplossing, voeg 8 pi oligonucleotide probes op de dia, plaats een dekglas en breng de dia naar een voorverwarmde pipet-tip box met water op de bodem; incuberen bij 37 ° C gedurende 1-2 uur. </li><li> Plaats 3 voorverwarmde Coplin potten in een waterbad bij 37 ° C met FISH wasbuffer, FISH wasbuffer met DAPI, en 2x SSC. </li><li> Na 1-2 uur incubatie voor RNA FISH, zet de schuif in de voorverwarmde FISH wasbuffer. </li><li> Incubeer de glijbaan voor een paar minuten totdat het dekglaasje valt van de schuif. </li><li> Plaats de schuif weer in de wasbuffer, en verder incuberen gedurende 5 min. </li><li> Breng de dia naar een andere Coplin pot met voorverwarmd FISH wasbuffer met 0,5 ng / ml DAPI en incubeer gedurende 5 min. </li><li> Breng de dia naar een andere Coplin pot met voorverwarmde 2x SSC en incubeer gedurende 5 kmn. </li><li> Plaats de dia&#39;s schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof en plaats de schuif terug in een droge tip doos. Voeg 4 ul van antifade met DAPI op de dia en plaats een dekglaasje. </li><li> Dicht de dekglaasje met nagellak en observeren onder een microscoop. De slede is bij 4 ° C worden bewaard in het donker gedurende enkele maanden. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gracefully+ageing+at+50%2C+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li>
<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
<li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+by+RNAs%3A+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li>
<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
<li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li>
<li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase%3A+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear%2Fchromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li>
<li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Xist.+Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li>
<li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li>
<li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+inactivation+in+mouse+ES+cells%3A+histone+modifications+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li>
<li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li>
<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
<li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171(2004).</li>
<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

In dit artikel hebben we een snelle immuno-FISH protocol dat minder dan 5 uur duurt om dia voorbereiding, Xist RNA FISH, en immunofluorescentie voor H3K27me3 voltooien gepresenteerd. In vergelijking met de algemene immuno-FISH aanpak Xist RNA detectie, die meestal nodig overnacht incuberen RNA FISH dit protocol niet alleen aanzienlijk minder tijd, maar verbetert ook de gevoeligheid van immuun-FISH gebruik van oligonucleotide probes. Aangezien Xist wordt sterk getranscribeerd in X-chromosoom ...

Zoogdier X-chromosoom inactivatie (XCI) een strategie ter compensatie van de onbalans in X-gebonden gen doseringen XX en XY, waarbij één van de twee X-chromosomen bij vrouwen transcriptioneel geïnactiveerd 1. X-chromosoom inactivatie is een geweldige modelsysteem voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) onderzoek. X-chromosoom inactivatie wordt geregeld op verschillende lncRNAs, en is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia om de overspraak mechanismen tussen lncRNAs, transcriptie, chromatine structuur en nucleaire organisatie 2, 3 ontdekken. De X inactivatie centrum (XIC) op het X-chromosoom is een complexe genetische locus bestaat uit een aantal genen die niet-coderende RNA&#39;s 4. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA in eutherian zoogdieren is een dergelijke lncRNA die een cruciale rol in X-chromosoom inactivatie 5,6 speelt. Xist transcripties rondom de locatie van de futuur Xi aan X-chromosoom inactivatie initiëren, en verschijnen als een wolk bij gevisualiseerd met behulp van RNA FISH; Deze informatie is aangeduid als de &quot;Xist Wolk&quot; 7. Sinds Xist RNA interageert met verschillende chromatine-modificerende enzymen, is co-lokalisatie van de Xist wolken met verschillende epigenetische modificaties voor een stille chromatine en repressieve transcriptie waargenomen tijdens X-chromosoom inactivatie 8. Bijvoorbeeld, Xist RNA wisselwerking met polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) die verantwoordelijk is voor H3K27me3 en induceert een repressieve chromatine staat 9. Het optreden van de Xist wolk op de Xi en zijn co-lokalisatie met de intensieve H3K27me3 wijziging een facultatieve heterochromatine landschap van de Xi 10,11. Cytogenetische technieken, zoals DNA / RNA FISH hebben een lange weg van de traditionele methode met behulp speurstoffen 12 tot recente en geavanceerde technieken met verbeterde gevoeligheid enfluorescente beeldvorming met meerdere oligonucleotideprobes 13,14. DNA / RNA FISH combinatie met immunofluorescentie werd routinematig gebruikt als een instrument om cytologische spatiotemporele nucleaire organisatie, RNA lokalisatie, chromatinestructuur en modificaties begrijpen. De meeste standaard probe voorbereiding voor RNA FISH omvat het gebruik van plasmide of bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) klonen en hun verdere kenmerken hetzij nick-translatie of willekeurige priming 15. Echter, bijna 70% van de genen in muizen en 40% van genen bij de mens een overlap vertonen van sense en antisense transcripten 16, waardoor het met een strengs specifieke FISH methode om sense en antisense transcripten onderscheiden. In vitro getranscribeerde RNA probes (riboprobe ) worden vaak gebruikt voor strengs specifieke RNA FISH 17,18; echter, gaat het bereiden van een plasmide kloon of PCR product met T7, SP6 of T3-promotor en synthetiseren riboprobes. Bovendien riboprobes ontleend genomic DNA of cDNA bevatten vaak aspecifiek gebieden en repetitieve elementen, die resulteren in hoge achtergrondruis. Een ander probleem is dat riboprobes, die enkele honderden nucleotiden lang en bevatten meerdere fluoroforen, niet efficiënt kunnen doordringen in de kern. Om dit te omzeilen, hebben meerdere kortere oligonucleotide probes gelabeld met een fluorofoor aan het einde ontwikkeld die goede gevoeligheid, uniform signaalsterkte en gemak van zuivering en behandeling 14 hebben. Daarnaast DNA oligonucleotiden algemeen stabieler dan RNA. We pasten een soortgelijke strategie waarbij oligonucleotiden Xist RNA FISH 19 met immunofluorescentie de epigenetische dynamiek van de Xi geïnduceerd door Xist lncRNA tijdens het X-chromosoom inactivatie begrijpen. Dit protocol wordt het maken van oligonucleotideprobes en goede voorbereiding van cellen, alsook het gebruik van immunofluorescentie en RNA FISH. Xist RNA FISH gebruik van meerdere oligonucleotides is goedkopere wijze op de lange termijn als Xist RNA FISH routinematig uitgevoerd in een laboratorium. Deze techniek kan worden gebruikt om cellen te identificeren lncRNAs in kaart brengen en tegelijkertijd de co-lokalisatie met epigenetische veranderingen of factoren. Een groot voordeel van het protocol is de mogelijkheid om gemakkelijk passen een onderzoek interesses.

<table><tbody><tr><td>oligonucleotides met 5&rsquo;-amino modificatie</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reactieve Kleurstof</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine, Moleculaire Biologie Kwaliteit (voor hybridisatie buffer)</td><td>Roche</td><td>10715859103</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3K27me3 antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Geit Anti-Muis, sterk gekruist-geadsorbeerd</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagens</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

snel fluorescent in situ hybridisatie protocol voor xist rna gecombineerd met immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het x-chromosoom inactivatie

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combineren RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met immunofluorescentie (immuno-FISH) maakt een techniek die kan worden toegepast bij de enkele cel niveau om de ruimtelijke dynamiek van RNA lokalisatie met gelijktijdige inzicht detecteren in de lokalisatie van eiwitten, epigenetische veranderingen en andere details die kan worden benadrukt door immunofluorescentie. X-chromosoom inactivatie is een paradigma voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) gemedieerde silencing. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA accumulatie (genoemd Xist cloud) op één van de twee X-chromosomen in zoogdiercellen vrouwen is een kritieke stap voor X-chromosoom inactivatie initiëren. Xist RNA direct of indirect in wisselwerking met diverse chromatine-modificerende enzymen en introduceert verschillende epigenetische landschappen tot het inactieve X-chromosoom (Xi). Een bekende epigenetische kenmerk van de Xi is de histon H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) wijziging. Hier wordt een eenvoudige en snelle immuno-FISH beschrijven weprotocol voor het opsporen Xist RNA met behulp van RNA FISH met meerdere oligonucleotidenprobes combinatie met immunofluorescentie van H3K27me3 om de lokalisatie van Xist RNA en bijbehorende epigenetische veranderingen te onderzoeken. Met oligonucleotide probes resulteert in een kortere incubatietijd en gevoeligere detectie van Xist RNA vergeleken met in vitro getranscribeerd RNA probes (riboprobes). Dit protocol biedt een krachtige tool voor het begrijpen van de dynamiek van lncRNAs en de bijbehorende epigenetische modificatie, chromatine structuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie.

Representatieve beelden van snelle immuno-FISH zijn weergegeven in figuur 1A. Co-lokalisatie van de Xist RNA wolk en H3K27me3 signaal op de Xi werd ontdekt in het onderscheiden vrouwelijke cellen. Op dag 12 na differentiatie, meer dan 90% EB-cellen hadden een Xist wolk (Figuur 1B). Korte oligonucleotideprobes efficiënt doorgedrongen in de kernen, wat leidt tot een visualisatie van bijna alle H3K27me3 signalen gecolokaliseerd met Xist RNA (figuur 1C, 97%, n = 150). <...

We ontwikkelden een eenvoudig aan te passen streng-specifieke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) protocol gecombineerd met immunofluorescentie. Dit maakt een gedetailleerde onderzoek mogelijk van RNA-dynamica met gelijktijdige inzicht in de chromatinestructuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie op enkelcellig niveau.

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamica van lang bestaand non-coderend RNA en de bijbehorende epigenetische modificatie tijdens inactivering van het X-chromosoom te onderzoeken door gebruik te maken van een snelle fluorescerende in situ hybridisatie gecombineerd met immunofluorescentie. Dit protocol vereist cytosine voorbereiding van slides met differentiërende embryo-bodycellen, die gepermeeerd en vervolgens gefixeerd worden voor kleuring. Vervolgens accumuleert de fluorescente marker, gelokaliseerd door een antilichaam tegen histon H drie trimethyl lysine 27, op het inactieve X-chromosoom.De laatste stap gebruikt oligonucleotide proben die een vijf prime amino modificatie bevatten en gelabeld zijn met een AM-gemiddelde reactieve fluorofoor om de bestaande RNA vis uit te voeren. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van bestaande RNA-wolk en histonmodificatie tijdens E Es-celdifferentiatie te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat we meerdere unieke oligonucleotiden gebruiken, die gelabeld zijn met een enkele fluoro vier. Dit biedt ons een transspecifieke detectie, die de achtergrond vermindert, en dit verhoogt ook de penetratie naar de kern en verhoogt of verbetert de intensiteit van de signalen. Bovendien, wanneer we de concentratie van de proben verhogen, kunnen we de tijd die nodig is om dit immunovis experiment te voltooien aanzienlijk verkorten.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de lokalisatie van bestaand RA op het inactieve ex-chromosoom en de bijbehorende chromo-modificatie. Het kan ook worden toegepast op andere biologische systemen voor de detectie van RA's en de bijbehorende epigenetische modificatie, nucleaire lokalisatie en transgenerationele regulatie. Om de proben voor te bereiden, verkrijgt u eerst meerdere oligo's van 20 tot 30 nucleotidelengte met een smelttemperatuur van 63 tot 65 graden Celsius, en die een unieke antisensesequentie bevatten voor een bestaand RNA en een vijf prime amino modificatie.Suspendeer deze oligo's in puur water pool gelijke hoeveelheden van de verschillende oligo's voor een totaal van 4,5 microgram DNA. Volg vervolgens de instructies van de fabrikant en label de oligo's met een am-gemiddelde reactieve fluorescerende kleurstof volgens de labelinstructies van de oligo's. Laat ze door een G 25-kolom passeren.Gebruik vervolgens ethanol en natriumacetaat om de oligo's te bezinken. Dit vereist een halve uur periode bij minuus 80 graden Celsius voordat een 21.000 G spin bij vier graden Celsius wordt uitgevoerd. Was vervolgens de pellet eenmaal met 70% ethanol na de was.Suspendeer de oligo's opnieuw in 50 microliter nuclease-vrij water of tris EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar DNA. Dit maakt de sondevloeistof om de sonde te reconcentreren tot 250 nanomolar in hybridisatiebuffer. Om te beginnen, laat ES of EB differentiërende cellen groeien in zes welborden, aspireer het kweekmedium uit de welborden en was de cellen vervolgens met kamertemperatuur PBS.Aspireer de PBS grondig. Voeg vervolgens 0,5 milliliter trypsinoplossing toe aan elk welbord en incubeer de plaat gedurende vijf tot tien minuten. Stop de tripsinreactie door vijf milliliter media toe te voegen aan elk welbord en ze voorzichtig te pipetteren.Breng vervolgens de cellen over naar een 15 milliliter buis. Spin nu de cellen gedurende vijf minuten bij 200 G's bij kamertemperatuur, verwijder al het supernatant en suspendeer de pallet van cellen in twee milliliter PBS. Tel vervolgens de cellen en verdun de suspensie tot 400.000 cellen per milliliter in PBS.Assembleer nu elke slide met een filterkaart, een kamer en een klem. Maak er zoveel als nodig is en plaats ze in de rotor van een cyto spin. Voeg 250 microliter celsuspensie toe aan elke slide en draai de slides bij 1500 RPM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Perme en fixeer vervolgens. Ten eerste, breng de slides snel over naar ijskoud PBS gedurende vijf minuten als spoelstapstap. Ten tweede, breng de slides over naar ijskoud CSK-buffer gedurende één minuut om te zwellen, en ten derde, verplaats de slides naar CSKT-buffer gedurende vijf minuten om de cellen te permeabiliseren.Ten vierde, was de cellen gedurende één minuut in ijskoud CSK-buffer. En tenslotte, fixeer ze in kamertemperatuur 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Verwijder eerst de slides uit de PFA-oplossing.Breng ze vervolgens over naar een coplan-pot met PBST gedurende enkele seconden, gevolgd door het op een schuine hoek plaatsen om af te lopen. Laad vervolgens een lege pipettipbox met water onder de tiphouder in. Veeg vervolgens de achterkant van de slides af en breng ze over naar deze box.Leg nu 40 microliter blokkeringsoplossing op elke slide en bedek de slides voorzichtig met dekglasjes. Laat ze 10 minuten op de werktafel incuberen in de box. Verwijder vervolgens de dekglasjes en plaats de slides op een schuine hoek.Voeg nu 40 microliter primaire antilichaamoplossing toe. Plaats de dekglasjes terug en laat de slides 30 minuten op de werktafel incuberen na een half uur. Verwijder de ongebonden antilichamen door de slides tweemaal in PBST in coplan-potjes te wassen.Gebruik voorzichtig schudden en laat elke wasbeurt vijf minuten duren. Breng de slides vervolgens terug in een schuine hoek en laat de PBST afvloeien. Veeg vervolgens de overtollige oplossing van de achterkant van de slides af en plaats de slides terug in de box.Breng nu 40 microliter van een 1 op 500 secundaire antilichaamoplossing aan op elke slide. Bedek de slides met dekglasjes en laat ze 15 minuten op de werktafel incuberen, beschermd tegen licht. De slides moeten altijd tegen licht worden beschermd.Verwijder de antilichamen met PBST zoals eerder, en plaats vervolgens de slides schuin om af te lopen. Wanneer u immunofluorescentie uitvoert, verwarm een box met water voor tot 37 graden Celsius. Nadat u het wasbuffer van de achterkant van de slides hebt weggeveegd, plaatst u ze in een pipettipbox met temperatuurwater en brengt u 500 microliter viswasbuffer aan op elke slide.La

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Dit artikel presenteert twee methoden op basis van fluorescentie in situ hybridisatie om het X-chromosomale gehalte van eierstokcellen te bepalen in niet-geënt en geënt ovariumschorsweefsel van vrouwen met X-chromosomale afwijkingen.

Onderzoek naar X-chromosomale afwijkingen in eierstokcellen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Leer een snelle FISH- en immunofluorescentieprotocol voor Xist RNA-dynamiek en histonmodificaties tijdens X-chromosoom inactivatie in differentiërende embryonale stamcellen. Deze methode biedt inzicht in epigenetische regulatie.

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie (Video) | JoVE Journal

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie

Meer video's verkennen