Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging

De hier gepresenteerde procedure toont een eenvoudige methode voor het bereiden van door MICA ondersteunde vetlaagjes geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie, zoals tur-onderzoek naar het volgen van enkele moleculen. Het MICA-oppervlak wordt bereid door een sandwich van een enkele laag MICA, die tussen de glazen microscoopglasplaat en de dekglas is gelijmd met optisch lijmmiddel, te scheiden waardoor een platte en extreem dunne verse mica-oppervlak wordt blootgelegd. Door een kleine kunststof kamer te monteren die is gemaakt van een kopje van een en een halve milliliter, kan het volume van vetblaasjes dat nodig is voor de vorming van dubbellagen zo laag zijn als 30 microliter.

Neem als eerste stap het meerlagige blad van MICA zoals het uit de leverancier komt en snijd het met een schaar in kleinere stukken. Snijd elke laag in twee of drie dunnere vellen met een nieuw messenblad. Reinig nu de dekslaapjes grondig.

Dit omvat het plaatsen van 0,17 millimeter dekslaapjes in een glazen trainingsvat met elke dekslaap in een aparte sleuf en soniceren in detergent gedurende 30 minuten bij 60 Celsius graden.

Was de dekslaapjes 10 tot 20 keer met mini-sleutelwater en droog ze af met een straal lucht of stikstof. Neem een microscoopglasplaat en maak deze schoon met plek.

Plaats een kleine druppel van ongeveer 15 microliter laagstroperige optische lijm op de microscoopblaas en de eerder gesneden laag op een UV-lichtbox gedurende enkele minuten. Gebruik scotchtape om enkele lagen mica af te pellen.

De eerste paar lagen zullen gefragmenteerd zijn, dus doe het totdat je ziet dat de lagen die aan het scotch. Tape zijn gehecht uniform en volledig zijn. Bedek de tape.

Plaats een druppel hoogstroperige optische lijm op Micah-oppervlak. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn. Plaats voorzichtig het schone dekslaapje op de agressieve druppel.

Gebruik pincetten om het glas voorzichtig naar beneden te tikken om de lijm te verspreiden. Genees de lijm opnieuw met UV-licht gedurende enkele minuten. Gebruik een mes om de sandwich bestaande uit glas te splitsen.

Schuif MICA en dekslaapje. In de meeste gevallen blijft er slechts een zeer dunne laag MICA aan het dekslaapje gehecht. Gebruik een dissectiemicroscoop om je MICA-oppervlak te inspecteren door kleine krassen te maken met de punt van een naald of pincetten.

Je kunt gemakkelijk zeggen of het oppervlak daadwerkelijk mica is, waar het oppervlak uniform is gekrast, zoals hier of op de optische lijm, zoals hier waar het oppervlak gloeiend is. Neem een kopje van een en een halve milliliter glazen vial, verwijder gas cant, en lijm het deksel op het MICA-oppervlak met nagellak. Laat het een paar minuten drogen.

Nu kun je een vetlaagje repareren met een standaardprotocol hier. Een druppel van 30 microliter vetblaasjes wordt in de vialdekselkamer geplaatst en zal gedurende 60 minuten worden geïncubeerd voordat je je buffer wast. Na het wassen is het monster klaar voor beeldvorming.

In dit geval wordt het gemonteerd in een op maat gemaakte steekhouder. Enkele moleculen kunnen gemakkelijk worden waargenomen op een dergelijk voorbereide MICA-oppervlak. Hier vergelijken we A-D-O-P-C per laag ondersteund op glas en mica.

Merk op dat het type beweging substantieel verschilt tussen deze twee oppervlakken. Het pad van enkele moleculen dat in kleuren in de rechterpanelen is getraceerd, toont duidelijk dat het diffusiegedrag op MICA verschilt van dat op glas. Er is echter geen significant verschil in beeldkwaliteit.

De gemiddelde weef van de rechte functie bij halve maximale intensiteit voor 20 vlekken is bijna hetzelfde voor beide substraten, wat aangeeft dat het MICA-oppervlak volledig doordringbaar is voor licht zonder het introduceren van merkbare optische aberraties. Over het algemeen toont MSDS een duidelijk verschil in diffusiegedrag. Voor elke geval kunnen echter twee populaties deeltjes worden waargenomen die met verschillende snelheden diffunderen.

Twee verschillende diffusiecoefficienten, snel en langzaam, werden geëxtraheerd uit dubbel exponentieel voedsel naar cumulatieve waarschijnlijkheid van vierkant verplaatsing. Voor dit DOPC-dubbellaagje zijn beide diffusiecomponenten sneller op MICA-oppervlak, de langzaam bewegende deeltjes op MICA zijn ongeveer 10 tot 20 keer langzamer dan de snelle. De trage populatie op glas is echter bijna immobiel.

We hebben aangetoond dat het type oppervlak een verschil kan maken in het diffusiegedrag van vetlaagjes. Daarom moet men voorzichtig zijn bij het vergelijken van resultaten tussen studies over dubbellagen die worden ondersteund op verschillende substraten zoals MICA en glas. Het beeldvormen van dubbellagen op MICA is meestal vrij moeilijk vanwege de gecompliceerde voorbereiding. We hebben echter een eenvoudige maar effectieve manier getoond om dergelijke hoogwaardige oppervlakken te bereiden.