Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Het algemene doel van deze procedure is om de remodellering van het endosomale lysosomale systeem door intracellulaire bacteriën te bestuderen met behulp van fluorescerende nanodeeltjes als tracers. Dit wordt bereikt door eerst heela-cellen in een acht-putjeskamer te zaaien en ze een nacht te incuberen. De tweede stap is om de cellen te infecteren met salmonella en tarica.

Vervolgens wordt een pulse-chase-labeling van geïnfecteerde gastheercellen uitgevoerd door incubatie met gouden BSA Rumine-nanodeeltjes. De laatste stap is om veranderingen in het endosomale systeem van de gastheercel te observeren door middel van confocale microscopie. Uiteindelijk wordt kwantificering van de intracellulaire verdeling van nanodeeltjes uitgevoerd met behulp van het MRS-softwarepakket.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunomicroscopie, is dat geïnfecteerde cellen worden geanalyseerd. Met deze methode kan inzicht worden verkregen in de intracellulaire levensstijl van terica. Het kan echter ook worden toegepast op andere intracellulaire pathogenen zoals Gaia-soorten, Ella Prolia of mycobacterium tuberculosis. Het kan ook worden toegepast op andere typen gastheercellen zoals micro feh, cellijnen of primaire cellen.

De synthese van 10 nanometer gouden nanodeeltjes of NPS vereist twee oplossingen, oplossing A en oplossing B. Om oplossing A te bereiden, voegt u twee milliliter 1% aqueuze goudchloride toe aan 160 milliliter milli Q-water. Bereid oplossing B voor door acht milliliter 1% trisodiumcitraatdihydraat en 160 microliter 1% tanninezuur toe te voegen aan 32 milliliter milli Q-water. Verwarm oplossingen A en B tot 60 graden Celsius en meng ze vervolgens roerend.

Er moet onmiddellijk een donkerblauwe kleur worden waargenomen na ongeveer 15 minuten. De oplossing zou op dit moment rood moeten worden. Verwarm de oplossing tot 95 graden Celsius.

Houd het gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius en koel vervolgens de oplossing af tot kamertemperatuur. Bereid het gouden stuk voor op coating en markering door 900 microliter gouden MPS toe te voegen aan een 1,5 milliliter einorbuis en centrifugeren bij 15.000 Gs gedurende 30 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet opnieuw in 900 microliter gesteriliseerd MQ-water.

Voeg 100 microliter A BSA-oplossing toe en meng op een vortex bij 800 RPM gedurende 30 minuten. Verwijder overtollig BSA door de bereiding bij 15.000 Gs gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius te centrifugeren. Gooi het supernatant weg en suspendeer het gouden BSA NPS en 125 microliter PBS opnieuw.

Voeg 12,5 microliter van één molaire bicarbonaat toe. De R domine n hydroxy CIN ester of NHS-oplossing wordt onmiddellijk vóór gebruik in DMSO bereid. Gebruik 15 microliter R DOMINE N-H-S-D-M-S-O-oplossing voor 0,5 milliliter van de gouden BSA NP-suspensie.

Incubeer de reactie gedurende twee uur bij kamertemperatuur terwijl u roert bij 800 RPM en blootstelling aan licht vermijdt. Zuiver vervolgens de gouden BSA rumine NPS door middel van dialyse tegen PBS bij vier graden Celsius met vijf bufferwisselingen gedurende een periode van 36 tot 48 uur. Stabiliseer de NPS door 10 microliter B-S-A-P-B-S toe te voegen aan elke een milliliter gouden BSA RUMINE NPS om de vrije of vrijgekomen BSA Rumine te verwijderen. Centrifugeer bij 15.000 GS gedurende 16 minuten bij vier graden Celsius. Suspendeer het pellet opnieuw in twee milligram per milliliter B-S-A-P-B-S na het meten van de optische dichtheid bij 520 nanometer of OD vijf 20.

Bewaar de gouden BSA Rod Domine NPS bij vier graden Celsius en vermijd blootstelling aan licht. De he a-cellen voor dit experiment tonen permanent een groen fluorescerend eiwit getagd lysosomale glycoproteïne lamp een GFP en worden gekweekt in DMEM met 10% foetaal runderserum bij 37 graden Celsius in een atmosfeer die 5% koolstofdioxide bevat. Zaai de cellen met een dichtheid van 50.000 per putje in een acht-putjeskamer en incubeer een nacht. De bacterie voor het infecteren van de hela-cellen is de humane gastro-intestinale ziekteverwekker, salmonella en tarica. Ter vergelijking worden twee mutante stammen gebruikt.

Alle drie stammen bevatten een plasmide voor constitutieve expressie van versterkt GFP en worden gekweekt in LB-bouillon met de juiste antibiotica om de plasmiden voor elke stam te onderhouden. Inoculeer een enkele bacteriekolonie in drie milliliter LB-bouillon met het juiste antibioticum en laat deze een nacht bij 37 graden Celsius groeien. Onder schudden voor beluchting, verdun op de volgende dag elke cultuur een op 31 in verse LB-bouillon en laat het drie en een half uur groeien.

Om deze procedure te beginnen, meet u de OD 600 van de subcultuurbacteriën en verdunt u tot een OD 600 van 0,2. Voeg in één milliliter PBS de juiste hoeveelheden bacteriën toe aan de hela-cellen in de A 12-kamer om een infectiviteit van 100 te bereiken. Incubeer gedurende 30 minuten in de cellenincubator.

Was de hela-cellen drie keer met PBS om niet-geïnternaliseerde bacteriën te verwijderen. Dit tijdstip wordt ingesteld als nul uur na infectie of nul uur pi. Voeg 300 microliter vers kweekmedium toe met 100 microgram per milliliter gentamicine aan de cellen en bewaar gedurende één uur.

Na een uur. Vervang het medium door beeldvormingsmedium met 10 microgram per milliliter gentamicine. Voeg goud BSA rumine NPS toe aan de hela-cellen om een eindconcentratie van OD vijf 20 van 0,1 te verkrijgen.

Incubeer gedurende één uur na één uur. Verwijder het medium en was drie keer met PBS. Voeg tenslotte 300 microliter vers beeldvormingsmedium toe met 10%FCS en 10 microgram per milliliter gentamicine.

Voor de rest van de incubatietijd wordt hoge resolutie beeldvorming van de cellen op verschillende tijdstippen bereikt met behulp van een confocale beeldvormingssysteem, zoals een confocale