Histologische kleuring van neuraal weefsel

Plakjes, of coupes, van hersenweefsel vormen een rijk materiaal voor het bestuderen van de structuur en functie van de hersenen. Onbehandelde hersenen zijn echter een visueel uniform weefsel, vergelijkbaar met een leeg canvas. Kleuring is een manier om de hersenen te "schilderen" om de cellulaire, structurele en moleculaire componenten van het orgaan duidelijk te visualiseren. Hoewel de meeste kleuringen gemeenschappelijke histologische methoden delen, heeft elke aanpak een uniek morfologisch doel. Deze video geeft een overzicht van de algemene principes van de hersenhistologie, demonstreert enkele veelvoorkomende kleuringstechnieken en bespreekt een aantal toepassingen van deze methoden in hedendaagse neurowetenschappelijke laboratoria.

Voordat we bespreken hoe neurologische kleuringsprocedures worden uitgevoerd, gaan we terug naar de doelstellingen van deze technieken.

Histologische kleuringen worden veelvuldig gebruikt om contrast te creëren, waardoor kenmerken zichtbaar worden die in ongekleurd weefsel niet te onderscheiden zijn. Om bijvoorbeeld de neuronale cellichamen, of somata, te visualiseren die de grijze stof van het zenuwstelsel vormen, zijn meerdere kleuringen beschikbaar. De kleurstoffen die bij Nissl-kleuringen worden gebruikt, binden zich aan nucleïnezuren, waardoor de somata paars kleuren en de neuronale organisatie zichtbaar wordt.

Om alternatieve witte stof te bestuderen, kan myeline — de vetzuurschede rondom axonen — worden gekleurd met kleurstoffen zoals Luxol Fast Blue. Daarnaast kan immunohistochemische kleuring moleculaire targets markeren die voorkomen op specifieke celtypen. Deze techniek maakt gebruik van de specificiteit tussen antilichamen en moleculaire targets, bekend als antigenen. Het gebruik van antilichamen die zijn gefuseerd aan enzymen of fluorescerende verbindingen stelt onderzoekers in staat om hun bindingsplaatsen te visualiseren met behulp van enzymatische reacties of fluorescentie.

Nu u bekend bent met het concept van het kleuren van coupes, bekijken we de gangbare histologische stappen die voorafgaan aan het kleuren van hersenweefsel om optimale omstandigheden voor visualisatie te waarborgen.

Om de weefselstructuur te behouden, worden de hersenen eerst geperfuseerd; dit houdt in dat het bloed uit de hersenen wordt gedraineerd en het vasculair systeem van het dier wordt gebruikt om een chemisch fixatief toe te dienen. Na dissectie worden de hersenen volledig ondergedompeld in fixatief om het conserveringsproces te voltooien.

Vervolgens wordt het preparaat ingebed in een medium met mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van hersenweefsel, zoals paraffine. Na het inbedden worden de hersenen in dunne coupes gesneden met een instrument dat een microtoom wordt genoemd. De coupes worden daarna op objectglazen gemonteerd en aan de lucht gedroogd.

Omdat de meeste kleurstoffen op waterbasis zijn, moet het weefsel worden ontparaffineerd en gerehydrateerd voordat het kleuringsproces kan beginnen. Om dit te bereiken, worden de objectglazen gespoeld met xyleen om de was op te lossen, gevolgd door geleidelijke rehydratie via een reeks steeds verder verdunde ethanoloplossingen. Dit proces dient te worden uitgevoerd in een zuurkast met het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

Nu het hersenweefsel is voorbereid, kunt u beginnen met de kleuringsprocedure.

De eerste stap, bekend als blokkeren, vermindert achtergrondkleuring veroorzaakt door aspecifieke antilichaambinding. Door het coupes bloot te stellen aan serum wordt dit bereikt door ongelabelde antilichamen te introduceren die zich binden aan niet-doelsites. Na een blokkeringsperiode van 30 minuten tot overnacht is het weefsel gereed voor incubatie met het primaire antilichaam, dat zich bindt aan specifieke moleculaire targets.

Antilichamen worden gewoonlijk verdund in een blokkeringsoplossing die detergent bevat, wat de celmembranen verstoort en antilichamen in staat stelt het cytoplasma binnen te dringen.

Na een incubatie van overnacht worden overtollige primaire antilichamen verwijderd door korte wasbeurten in buffer. Vervolgens worden de secundaire antilichamen, geconjugeerd aan enzymen of fluoroforen, geïntroduceerd om de primaire antilichamen specifiek te labelen. Enkele uren later worden overtollige antilichamen verwijderd met meerdere bufferwisselingen.

Nu de targets zijn gelabeld, bespreken we hoe deze gedetecteerd kunnen worden. Voor enzym-geconjugeerde secundaire antilichamen gebeurt dit door de toevoeging van een chromogeen substraat. Wanneer het substraat interacteert met het enzym, vindt er een kleurverandering plaats, vandaar de term "chromogeen". Zodra de gewenste kleuring is bereikt, doorgaans na ongeveer 2 minuten, wordt de reactie gestopt door de coupes snel in water onder te dompelen.

Na de antilichaamskleuring kan een tweede stap nodig zijn om de resultaten in een neuroanatomische context te plaatsen. Men kan bijvoorbeeld kiezen voor het verbeteren van het weefselcontrast met een Nissl-kleuring. Deze procedure maakt gebruik van basische kleurstoffen zoals cresylviolet, die interageren met nucleïnezuren.

De eerste stap is het filteren van de kleuringsoplossing om onopgeloste kristallen te verwijderen. De coupes worden vervolgens geïncubeerd in de kleurstof tot het gewenste contrast is bereikt. Daarna worden de coupes gewassen in meerdere opeenvolgende waterbaden om de kleuring te stoppen.

Vervolgens worden de coupes ondergedompeld in een reeks alcoholconcentraties om overtollige kleurstof te verwijderen en de coupes te dehydrateren. Na dehydratie worden de coupes geklaard met xyleen, wat de alcohol verwijdert en de beeldvorming verbetert vanwege lichtbrekingseigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van het weefsel.

Om de gekleurde coupes te bewaren voor latere analyse, worden ze gedekt met een permanent monteermedium en een dekglas, waarna ze een nacht kunnen drogen.

Nu we de procedures en doelen van kleuring hebben geschetst, kijken we naar enkele toepassingen.

Ten eerste wordt histologische kleuring routinematig gebruikt om individuele neuronen te visualiseren. Op hun beurt is visualisatie noodzakelijk voor technieken zoals laser capture microdissectie, waarbij onderzoekers een laser gebruiken om specifieke cellen die op een dunne film zijn gekweekt te isoleren. Genetisch materiaal kan worden geëxtraheerd uit de gekleurde en gedissecteerde cellen, waardoor onderzoekers de neuron-specifieke genexpressie kunnen onderzoeken.

Kleuring kan ook worden ingezet om morfologische kenmerken van individuele neuronen te karakteriseren. In dit experiment wordt immunohistochemie uitgevoerd op cellen die GFP tot expressie brengen om synapsvormende dendrieten te visualiseren. De kleuring wordt vergeleken tussen normale en geactiveerde cellen, waaruit blijkt dat dendrieten meerdere veranderingen ondergaan als reactie op activerende stimuli.

Ten slotte kan, dankzij de specificiteit van IHC, de expressie van individuele eiwitten worden gebruikt om de locatie en identiteit van unieke celpopulaties in het zenuwstelsel te identificeren. Zo onthult kleuring van het cerebellum van de muis met zebrin 2-antilichamen de locatie van gespecialiseerde neuronen die bekendstaan als Purkinje-cellen.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over gerichte kleuring van hersensecties bekeken. In deze video hebben we de algemene methoden en doelen van kleuring gedemonstreerd, naast specifieke procedures voor IHC- en Nissl-kleuring.

Bedankt voor het kijken!