A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo's

Het algemene doel van het volgende experiment is om een chemische screening uit te voeren in zebravis-embryo's met behulp van handmatige monsterverwerking. Dit wordt bereikt door volwassen zebravissen 's nachts in paringskamers met een scheidingswand te plaatsen en de volgende ochtend de scheidingswand te verwijderen om embryo's te verzamelen. Vervolgens worden groepen zebravis-embryo's gerangschikt in 96-wells platen, en vervolgens behandeld met een medicijn in het gewenste ontwikkelingsstadium.

Vervolgens worden embryo's toegelaten om zich te ontwikkelen, gefixeerd met 4% paraldehyde en getest om de effecten van kleine moleculen op het ontwikkelingsproces van belang te meten. De resultaten tonen ontwikkelingsveranderingen zoals het verkrijgen of verliezen van genexpressiedomeinen die wijzen op veranderingen in sulfaat of weefselmorfogenese veroorzaakt door de kleine moleculen die werden onderzocht. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de klinische behandeling van een verscheidenheid aan ziekten vanwege het vermogen om potentieel therapeutische verbindingen te identificeren.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze techniek worstelen omdat ze de nodige behendigheid moeten verwerven om met embryo's te werken, zoals het overbrengen ervan tussen multi-well platen zonder schade. Het demonstreren van de procedure zal door mij en Eric Donahue worden gedaan, een onderzoeker aan de universiteit in het lab. Om zebravis-paringen op te zetten. Gebruik paringskamers met scheidingswanden, plaats volwassen mannelijke zebravissen aan de ene kant van de scheidingswand en volwassen vrouwelijke zebravissen aan de andere kant.

Voor elke 96-well plaat met kleine moleculen die getest moeten worden. Zet 25 paringstanks op en laat ze een nacht staan. De volgende dag, verwijder de kamer die elk vissenpaar scheidt en gebruik na een uur een fijne gaaszeef om embryo's te verzamelen voordat ze in petrischalen met E drie medium met een transferpijpje worden geplaatst.

Verwijder puin van de platen en observeer onder een stereoscoop. Observeer elke worp embryo's en verwijder onbevruchte eieren. Giet het E drie medium af en vervang het door vers E drie.

Plaats vervolgens elke schaal met embryo's in een 28,5 graden Celsius incubator gedurende twee uur. Controleer de platen opnieuw en gooi eventuele extra onbevruchte eieren weg. Blijf de embryo's incuberen tot het 40%eely-stadium.

Verwijder de chemische bibliotheekplaat uit minus 80 graden Celsius. Gebruik aluminiumfolie om het te bedekken en laat het op kamertemperatuur ontdooien met een achtkanaals pijpje. Voeg 99 microliters E drie toe aan kolommen twee tot 12 van een 96-well plaat.

Voeg vervolgens één microliter van de juiste verbindingen toe aan de putjes in kolommen twee tot 11 hier, aangeduid als de experimentele steekproeven. Pipetteer één microliter DMSO in de controlekolom hier ontworpen om kolom 12 te zijn. Gebruik aluminiumfolie om de verdunningsplaat te bedekken en breng de voorraad chemische bibliotheek terug naar de vriezer. Selecteer vervolgens een petrischaal met embryo's in het 40%epi-stadium en gebruik een transferpijpje om voorzichtig ongeveer 10 embryo's per putje in kolommen twee tot 12 van een 96 te plaatsen.

Well plaat. Gebruik een glazen transferpijp om overtollig E drie uit elk putje te verwijderen en weg te gooien in een vloeistofcontainer. Om de embryo's chemisch te behandelen, breng 100 microliters van elke chemische verdunning van de 96-well plaat over naar het respectieve embryoputje om een vochtige kamer te maken met een papieren handdoek en plaats deze in een lichtgevoelige container.

Groot genoeg om een 96-well plaat te houden. Gebruik vervolgens een plafondmat om de plaat te verzegelen. Plaats het in de lichtgevoelige container en incubeer het gedurende de gewenste tijdsduur bij 28,5 graden Celsius.

Om de chemicaliën te verwijderen, voeg 300 microliters E drie toe aan elke rij van de met geneesmiddelen behandelde putjes. Trek vervolgens het medium af voordat je E drie gebruikt om de embryo's drie keer te wassen om embryo's te fixeren, breng ze over in vier gelabelde 24-well platen en plaats de pijp voor een donkere achtergrond. Na elke overdracht naar het identificeren van embryo's die in de pijp achterblijven en om kruisbesmetting te voorkomen, verwijder alle dode embryo's.

Trek de E drie af zodat de embryo's nauwelijks in de vloeistof zijn ondergedompeld. Gebruik vervolgens een glazen pijp om twee druppels van 50 milligram per milliliter pronase aan elk toe te voegen. Incubeer de embryo's vijf minuten voordat u de putjes agiteert om de Corian te laten uiteenvallen.

Nadat u E drie hebt gebruikt om de embryo's twee keer te wassen, trek af en gooi de resterende E drie weg. Voeg 4%P-F-A-P-B-S toe aan elk putje en incubeer de embryo's een nacht bij vier graden Celsius. Voer vervolgens een screening uit die van belang is, zoals hole mount in situ hybridisatie, of wens zoals beschreven in het tekstprotocol om de embryo's van de chemische screening te scoren.

Breng ze over naar gelabelde 12-well platen voordat u een stereomicroscoop gebruikt om ze te observeren zoals beschreven in dit diagram. Het is praktisch voor een enkele persoon om een chemische genetische screening uit te voeren op ongeveer 600 verbindingen in de loop van negen weken van toegewijde inspanning, en die tijd kan worden teruggebracht tot drie weken als het door drie personen wordt uitgevoerd. Dus, de tijd van één of een paar mensen kan de behoefte aan apparatuur met hoge middelenvereisten zoals geautomatiseerde systemen omzeilen.

Zoals hier getoond, werden zebravis-embryo's onderworpen aan individuele verbindingen uit een bioactieve bibliotheek van 50%of mensen tot 24 HPF, en vervolgens getest door wens, met behulp van een cocktail van drie ribo proben om nephron-segmenten te detecteren. Als voorbeeld van een beoordelingssysteem, zal een verbinding die resulteerde in een dramatisch vergrote proximale convoluute tubulus of PCT, worden gecategor