Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System
4 november 2014
Plaque-assays zijn de gouden standaard voor virale kwantificering, waarbij overdekken met gevangenisoverlagen op hostcellulaire monolagen worden gebruikt om virale titers te bepalen. Hoewel traditioneel verschillende semi-solide overlagen zijn gebruikt, tonen we hier plaque-technieken die semi-solide overlagen vergelijken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose onder verschillende families van virussen.
Het algemene doel van deze procedure is om de virale concentratie te bepalen door de kwantificering van infectieuze varion door het tellen van discrete plaques in celcultuur. Dit wordt bereikt door eerst cellen te plateren om een confluente monolaag te vormen voor infectie. De tweede stap is het uitvoeren van seriële verdunning van het onbekende virale monster dat moet worden gekwantificeerd.
Vervolgens worden de confluente monolagen geïnfecteerd met behulp van de seriële verdunning van het virale stam, gevolgd door het aanbrengen van een immobiliserende overlay. De laatste stap is het fixeren en kleuren van de plaques na de juiste incubatietijd voor het virus in kwestie om de discrete plaques te tellen. Uiteindelijk kunnen plaque-assays op verschillende manieren worden gebruikt en aangepast om de virale titers van een onbekend virusmonster te bepalen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals de semi-solide overlay, is dat toepassing en verwijdering veel eenvoudiger zijn in zowel high throughput als traditionele toepassingen. Bovendien is het verwarmen van de reagentia niet vereist. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het onderzoek van veel verschillende lytische virussen door het gebruik van een vloeibare overlay.
In een 96-well formaat zorgt dit voor de snelle screening van nieuwe therapeutische verbindingen, wat de lange uren die in het lab worden besteed aan het uitvoeren van traditionele plaque-assays aanzienlijk kan verminderen. Op de dag voorafgaand aan de assay plate, zijn de juiste cellen voor het virus in kwestie nodig om 90 tot 100% cofluëntie op de dag van infectie te bereiken. De stockoplossingen kunnen ook de dag voor de assay worden voorbereid. Bereid eerst een fixeeroplossing van 10% formaldehyde in gedistilleerd water door 5,56 milliliter van 36% stock formaldehyde te mengen met 14,44 milliliter gedistilleerd water. Bereid vervolgens de kristalviolet kleurstof voor, bestaande uit 1% kristalviolet in 20% ethanol, verdund met gedistilleerd water.
Vervolgens, terwijl gewerkt wordt onder steriele omstandigheden, bereidt u de juiste twee x plaque media voor voor het type cellen dat wordt gebruikt. Filter de oplossing door een 0,2 micron filter als een van de reagentia niet sterieel is. Om een vloeibare overlay voor gebruik in de plaque-assay te bereiden, mengt u 2,4 gram avy cel in een kolf met 97,6 milliliter gedistilleerd water dat snel wordt gemengd met een roerstaaf.
Meng de oplossing op kamertemperatuur tot het te stroperig wordt voor de roerstaaf. Op dit punt, breng de kolf over naar een kolvenschudder en agiteer krachtig gedurende 30 minuten om een gelijkmatige homogenisatie te garanderen. Autoclaveer vervolgens de oplossing bij 121 graden Celsius bij 14 PSI gedurende 30 minuten.
En wanneer het programma is voltooid, bewaar geseald op kamertemperatuur voor een aros overlay. Bereid een 0,6% agro stamoplossing in gedistilleerd water. Meng met een roerstaaf en autoclaveer om in oplossing te brengen of een carboxy methylcellulose overlay.
Bereid een 2% carboxy methylcellulose oplossing in gedistilleerd water en meng deze vervolgens, autoclaveer zoals eerder de dag na het plateren. Gebruik een omgekeerd microscoop om de cofluëntie en levensvatbaarheid van de cellen te controleren voordat u met de assay begint. Zorg ervoor dat de cellen standaard cellulaire morfologie vertonen en ongeveer 90% cofluëntie.
Voer een tienvoudige seriële verdunning uit van de infectieuze monsters in cellulair groeimedium, waarbij het aantal verdunning dat nodig is, varieert op basis van de verwachte titer van het virus in kwestie. Bereid ook een niet-geïnfecteerd controlemonster voor om onafhankelijk de cellulaire levensvatbaarheid te garanderen en om de plaque-identificatie te vergemakkelijken. Pipetteer het niet-geïnfecteerde controlemonster en de seriële verdunning in de putjes van de plaat, waarbij u voorzichtig moet zijn om de monolaag niet te verstoren.
Gebruik een voldoende volume inoculum om de cellen te bedekken terwijl het volume zo laag mogelijk wordt gehouden om maximale virale contact met de monolaag te maximaliseren. Plaats de platen in de weefselkweekincubator en infecteer de cellen gedurende 45 minuten tot een uur om de 20 minuten. Wieg de platen zachtjes om een gelijkmatige dekking te garanderen en om te voorkomen dat de cellulaire monolaag tijdens de infectie uitdroogt.
Bereid de overlay werkoplossing voor voor vloeibare overlays. Meng verwarmd plaque medium en 1,2 tot 2,4% kamertemperatuur Stock avy cel in een een-op-een verhouding om een werkoplossing van 0,6 tot 1,2% avy cel overlay medium of AROS of CMC overlays gemengd verwarmd plaque medium en een stockoplossing van ofwel verwarmde 0,6% AROS of 2% CMC in een een-op-een verhouding te verkrijgen. Plaats vervolgens in een 56 graden Celsius waterbad gedurende 30 minuten voor temperatuurequilibratie.
Zorg ervoor dat de oplossing warm is, maar niet heet om aanraking om celdood en verminderde virale titers te voorkomen. Na de infectie, brengt u de overlays aan op de geïnfecteerde monolagen na toevoeging van de overlay. Incubeer platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee tot 14 dagen, afhankelijk van het te analyseren virus, om cellen met een vloeibare overlay te fixeren, giet of aspireer de e cel overlay, pipet vervolgens 10% formaldehyde oplossing in de putjes en fixeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot een nacht of aros of CMC direct. Voeg de formaldehydeoplossing toe aan de overlay gedurende één uur tot een nacht bij kamertemperatuur na fixatie, gooi de formaldehyde weg en verwijder vervolgens handmatig de semi-solide pluggen waar de aros met de spatel.
Spoel de aby cel plaques met water om resterende overlay fixatief te verwijderen voorafgaand aan het kleuren. Om te kleuren, bedekt u de cellen met een minimale hoeveelheid kristalviolet oplossing gedurende ongeveer 15 minuten. Wieg de platen indien nodig om een gelijkmatige dekking te garanderen.
Was de kristalviolet kleurstof voorzichtig af met water eenmaal gefixeerd, gekleurd en gedroogd. Bewaar plex voor onbepaalde tijd voor toekomstige
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van plaque-assays voor virale kwantificering, waarbij traditionele semisolide overlays worden vergeleken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose. De studie benadrukt de voordelen van de vloeibare overlay in het vereenvoudigen van de toepassings- en verwijderingsprocessen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Celcultuurtechnieken
- Virale kwantificering
Achtergrond
- Plaque-assays zijn essentieel voor het bepalen van virale titers.
- Traditionele methoden omvatten vaak complexe procedures met semisolide overlays.
- De introductie van vloeibare overlays kan de efficiëntie verbeteren.
- Het begrijpen van virale concentratie is cruciaal voor therapeutisch onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om de effectiviteit van semisolide overlays te vergelijken met een vloeibare microkristallijne cellulose overlay.
- Om het plaque-assayproces te vereenvoudigen voor high-throughput toepassingen.
- Om snelle screening van therapeutische verbindingen tegen verschillende virussen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van confluente celmonolagen voor virale infectie.
- Seriele verdunning van virale monsters voor kwantificering.
- Toepassing van immobiliserende overlays na infectie.
- Fixatie en kleuring van plaques voor telling.
Belangrijkste resultaten
- De vloeibare overlay toonde gemakkelijker toepassing en verwijdering in vergelijking met semisolide overlays.
- High-throughput capaciteiten werden verbeterd door de vloeibare overlay methode te gebruiken.
- Virale titers werden succesvol gekwantificeerd met behulp van de nieuwe techniek.
- Resultaten gaven aan dat er potentieel is voor bredere toepassingen in virologie onderzoek.
Conclusies
- De vloeibare microkristallijne cellulose overlay is een haalbaar alternatief voor traditionele methoden.
- Deze techniek kan het proces van virale kwantificering stroomlijnen.
- Toekomstig onderzoek kan profiteren van de snelle screeningcapaciteiten die deze methode biedt.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Plaque assays provide a direct, quantitative measure of infectious viral particles, supporting robust target validation and antiviral screening in early discovery. The adoption of novel liquid overlays streamlines assay workflows, enabling higher throughput and operational efficiency for portfolio-scale compound evaluation. This methodological advance enhances predictive confidence in viral quantification, directly impacting decision points in antiviral R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of infectious virions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing antiviral effects from cytotoxicity.
- Facilitates comparative evaluation of overlay systems for optimal assay performance.
- Improves predictive confidence in viral titer measurements for downstream studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for reliable antiviral compound screening.
- Standardizes plaque formation and counting for reproducible quantitative outputs.
- Enables high-throughput screening formats using liquid overlays in microplates.
- Reduces manual handling and reagent heating, increasing operational safety and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viral quantification with translational biomarker requirements for infectious disease models.
- Ensures continuity from discovery-stage screening to preclinical efficacy studies.
- Supports risk-adjusted advancement of antiviral candidates based on robust titer data.
Pipeline & Workflow Integration
This plaque assay workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both mechanistic studies and high-throughput antiviral screening.
- Discovery Biology: Provides direct measurement of viral infectivity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers standardized, reproducible plaque counts for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Generates quantitative viral titers and comparative overlay performance data for informed decision-making.
- Translational Research: Maintains assay continuity for preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform adaptable to various viruses and screening formats.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral quantification.
- Operational Value: Streamlines workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid, reliable data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, virology, and quantitative assay analysis.
- Needs access to standard tissue culture facilities and plate readers for high-throughput formats.
- Demands cross-team standardization of overlay preparation and plaque counting protocols.
- May require optimization for different virus-cell system combinations.
- Overlay selection and incubation parameters must be tailored to virus-specific characteristics.
