Name: Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer virale concentratiebepaling door plaque-testen met traditionele en nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose overlay-methoden. Deze techniek vereenvoudigt toepassing en verwijdering voor hoogdoorvoeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen FMC BioPolymer USA bedanken voor productmonsters van Avicel. Dit werk werd ondersteund door de Defense Threat Reduction Agency-subsidie HDTRA1-13-1-0005 aan KK en de NIH-onderzoekssubsidie 1R15AI100001-01A1 aan KK.

1. Bereiding van Cellen en reagentia <ol><li> De dag voor de test plaat geschikte gastheercellen voor het virus betrokken (tabel 1 en 2) bij 90-100% confluentie. </li><li> Bereid bevestiging oplossing van 10% formaldehyde in dH 2 O. Bij voorbeeld, meng 5,56 ml van 36% voorraad formaldehyde met 14,44 ml gedestilleerd H2 O (dH 2 O). OPMERKING: Gebruik de juiste veilige werkmethoden en ventilatie bij het gebruik van formaldehyde. </li><li> Bereid crystal violet vlek: 1% Crystal Violet (CV) in 20% ethanol en dH 2 O. </li><li> Bereid 2x plaque media (celtype afhankelijk 2x concentratie; zie tabel 2). Filteren met behulp van een 0,2 um filter eventuele reagentia zijn niet steriel. </li><li> Bereiding van geïmmobiliseerd overlays (tabel 3) <ol><li> Voor vloeibare overlays, maak een steriele 2,4% oplossing van Avicel in dH 2 O. Om klonteren te voorkomen, het poeder toevoegen aan een kolf die water thbij wordt snel mengen met een roerstaafje, giet Avicel in langzaam en roer snel bij kamertemperatuur (RT). Wanneer de oplossing blijkt te stroperig voor een roerstaafje te homogeniseren, schakelen naar een fles shaker voor&gt; 30 min met zware agitatie om nog homogenisering verzekeren. Opmerking: De oplossingen kunnen worden bij lagere concentraties, maar de oplossing kan gescheiden en moet opnieuw worden gemengd tot homogenisatie garanderen. Werkoplossingen Avicel kunnen worden gaande 0,6-3%. </li><li> Na homogenisatie autoclaaf de oplossing en bewaar afgedicht bij KT. </li><li> Voor agarose en carboxymethylcellulose (CMC) overlays, bereiden een stockoplossing in dH 2 O 2% CMC of 0,6% agarose. Meng met een roerstaafje en autoclaaf of magnetron in oplossing te brengen. </li></ol></li></ol> 2. Verdunningen en Infecties <ol><li> De dag na plating, visueel de confluentie en levensvatbaarheid van de cellen voorafgaand aan het starten van de test. Zorgen voor standaard cellulaire morfologie eennd een ~ 90% confluent monolaag is aanwezig. </li><li> Voer een tienvoudige seriële verdunning van de besmettelijke monsters. Gebruik de cellulaire groeimedia voor virale propagatie als verdunningsmiddel (Tabel 2). Varieert het aantal benodigde verdunningen op basis van de verwachte titer van het virus betrokken, en altijd een geïnfecteerde controlemonster om zelfstandig waarborgen cellulaire levensvatbaarheid en steun plaque identificatie. </li><li> Van de seriële verdunningen, infecteren de cellen gedurende 45 min tot 1 uur (Tabel 1). Gebruik een voldoende hoeveelheid inoculum dekking van de cellen, terwijl het volume zo laag mogelijk virale contact met de monolaag (tabel 4) te maximaliseren. Zachtjes rots platen om de 20 min om te verzekeren gelijkmatige dekking en het voorkomen van de cellulaire monolaag uitdroogt. </li><li> Na de infectie, overlay een geschikt volume immobiliseren medium direct naar inocula in de put (tabel 2) met een 1: 1 mengsel van 2 x plaque media en de immobilizing overlay keuze (CMC, agarose of Avicel). Schud om te mengen. <ol><li> Voor vloeibare overlays, meng 1: 1 met verwarmd 2x plaque media en 1,2-2,4% RT voorraad Avicel om een ​​werkende oplossing van 0,6-1,2% Avicel overlay medium te verkrijgen. </li><li> Voor een agarose overlay gebruikt een 1: 1 mengsel van verwarmd 2x plaque media en een voorraadoplossing van verwarmde 0.6% agarose af in een 56 ° C waterbad gedurende 30 minuten om de temperatuur verkrijgen van een uiteindelijke agarose / overlay concentratie van 0,3 equilibreren %. </li><li> Voor CMC Bereid een 2% voorraadoplossing en behandeld zoals beschreven voor de agarose overlay. </li><li> Bij toepassing van de overlay de monolaag, altijd in evenwicht hete agarose of CMC in een 56 ° C water om schade aan de monolaag te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing is warm, maar niet heet om aan te raken tot celdood en verminderde virale titers voorkomen. Meest agarose overlays zal beginnen te stollen onder 42 ° C, snel te werken en / of te bereiden kleine partijen om stolling te voorkomen tijdens het hanteren. </li></ol></li><li> Na toevoeging van de overlay, incubeer platen afzonderlijke plaques die duidelijk telbare produceren. Plakvorming kunnen nemen 2-14 dagen afhankelijk van de virus geanalyseerd, tabel 1. OPMERKING: Zodra vloeistof bedekt platen in de incubator worden geplaatst, mag u ze niet bewegen. Beweging van de vloeistof overlays gedurende de incubatieperiode zal resulteren in vlekkerig plaques. Agarose en CMC overlays zijn halfvaste en kan worden verplaatst of periodiek gecontroleerd onder een lichtmicroscoop te plaque ontwikkeling te monitoren. </li></ol> 3. Vaststelling en kleurende cellen <ol><li> Om de cellen te repareren, giet af of zuig het Avicel overlay, en zet de cellen met behulp van de 10% formaldehyde-oplossing gedurende 30 minuten tot de volgende ochtend (&lt;1 ml per putje voor een 6 wells plaat). <ol><li> Voor agarose of CMC, direct de formaldehyde oplossing voor de overlay toevoegen 1 uur overnacht. OPMERKING: Monsters kunnen gedurende langere tijd worden bewaard in het fixeermiddel verschaft doetniet verdampen en uitdrogen, omdat dit de monolaag kan vervormen. </li></ol></li><li> Voorafgaand aan kleuring na fixatie, gooi de formaldehyde en verwijder de halfvaste pluggen voor de agarose en CMC met ofwel stromend water of handmatig met een spatel. Spoel Avicel plaques met water om de resterende overlay / fixatief voorafgaand aan vlekken te verwijderen. </li><li> Voor kleuring, bedekken de cellen met een minimale hoeveelheid kristalvioletoplossing ~ 15 min. Rock platen indien nodig zelfs dekking te garanderen. </li><li> Wassen zachtjes het kristal violet vlek met water. Eenmaal gefixeerd, gekleurd en gedroogd, winkel plaques voor onbepaalde tijd voor toekomstige analyse. </li></ol> 4. Bepalen Virale titers <ol><li> Tel de plaques in elk putje, waarbij het gemiddelde voor elk technisch herhalingen van dezelfde verdunning. Voor grote plaat formaten, korting putten met minder dan 5 of groter dan 100 plaques. Kennis te nemen van plaque grootte en morfologie. De negatieve controle moet uniform monolaag hebben enkan worden gebruikt als een referentie controle. </li><li> Bepaal de virale titer van de voorraad monster door het gemiddelde aantal plaques voor verdunning en de inverse van de totale verdunningsfactor. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> Opmerking: Als voorbeeld, 30 en 32 plaques geteld herhalingen van de 1 x 10 -7 verdunning [31 (gemiddeld) / 10 -7 (verdunning) x 0,4 ml (inoculum)] zou een titer van 7,75 verkregen x 10 8 pfu / ml.

<ol><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+N.+Y%22%5BJournal%5D)">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li>
<li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li>
<li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).</li>
<li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63(2006).</li>
<li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technically+simple+%E2%80%98non-lethal%E2%80%99+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata%2C+Japan%2C+in+2004+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li>
<li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li>
<li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li>
<li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li>
<li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+%28MDCK%29+in+the+presence+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol.+%28Berl.%29%22%5BJournal%5D)">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen concurrerende of financiële belangen in het protocol of de beschreven producten.

De belangrijkste factor voor een succesvolle plaque assay ligt in het optimaliseren van het protocol voor de betreffende virale cultuur vraag omstandigheden sterk kunnen verschillen. Belangrijke punten rekening zijn: gastheer cellulaire verenigbaarheid met het virus betrokken geschikte virale groei omstandigheden voldoende verdunningsgebieden om duidelijk onderscheid plaques en correct overlay selectie en kleuring van de cellen en virus in kwestie. Terwijl VEEV en RVFV beide groeien onder zeer vergelijkbare omstandigheden gebruikmaking veel van dezelfde gastheercel soorten verschillen in morfologie plaque en groeikinetiek variëren aanzienlijk. Bij het ​​gebruik van Vero-cellen voor plaque assays, die traditioneel worden gebruikt als een vermeerdering en indicator cellijn voor hemorragische koorts virussen en alfavirussen, VEEV groeit meestal tot hogere titers dan RVFV en demonstreert verhoogde replicatie kinetiek, het ontwikkelen van grote uniforme plaques op 48 hpi 4, 10-12. In tegenstelling tot VEEV, RVFV vereist 72 HPI en toont plaques die kenmerkend veel kleiner en variabele grootte. Tegenover RVFV en VEEV, het influenzavirus zeer specifieke gastheercel en kan moeilijk te verspreiden via weefselkweek. Voor het influenza virus, is virale binnenkomst en fusie gewoonlijk geïnitieerd door de binding van het celoppervlak receptor met het virale glycoproteïne hamagglutinin (HA), welke men de doelcel via binding medieert de gastheercel α-siaalzuur oppervlak receptor. HA is een trimeer glycoproteïne die in de membraanenvelop alle Influenza virussen en vereist splitsing in de subeenheden HA1 en HA2 door een specifieke gastheercel protease. Om de kwestie verder te compliceren, kan deze klievingsplaatsen vaak variëren tussen virusstammen 13. Aangezien de expressie van proteasen kunnen splitsen HA is beperkt tot specifieke weefsels, proteasen are vaak toegevoegd aan celkweek media om virale fusie en de toegang tot de geselecteerde gastheercel 13 te vergemakkelijken. TPCK-trypsine is een voorbeeld van een algemeen gebruikte protease die wordt gebruikt in celkweek met zowel MDCK en Vero-cellen: multicyclische replicatie (in de afwezigheid van trypsine te inactiveren serum) vergemakkelijkt door de proteolytische activatie van virale HA 14,15. Zoals aangetoond in deze studie en anderen, kunnen verschillen in virale levenscycli overlay selecties, plaat formaten en collectie tijden, met aanzienlijke verschillen invloed onder verschillende klassen en soorten van virussen. In onze studie, agarose overlay aangetoond duidelijker plaques hogere titers dan zowel CMC of vloeibaar overlays voor zowel RVFV en Influenza B virus, versterkt het nut onder diverse virussen en celtypen. Met behulp van een lage uiteindelijke concentratie van agarose enorm geholpen bij het verwijderen van de vaste stekkers en vereenvoudigde vlekken. CMC algemeen toonde de poorest werkzaamheid als een overlay voor alle drie virussen getest en geproduceerd zeer klein en onduidelijk plaques voor Influenza B-virus. Hoewel de totale CMC toonde de minst gewenste eigenschappen, het gebruik ervan in snel groeiende en zeer virulente virussen kan voordelig blijken, zoals zij lijken plaque verkleinen met slechts een minimale afname in titer. De vloeistof overlay bleek de meest veelzijdige doordat zijn het zeer eenvoudig te bereiden, toegenomen gebruiksgemak, en was vergelijkbaar met agarose in alle geselecteerde virussen. In een hogere doorvoer 96-well plaat formaat, toepassing en verwijdering niet geremd door stollen als traditionele overlays en ontvangen accurate en consistente resultaten. Een overweging bij het gebruik van vloeibare overlays ligt in de ondoorzichtige kleur en onvermogen om plaquevorming te monitoren als de platen niet kan worden verplaatst, totdat de punt van verzameling, het beperken van deze aanpassing aan virussen met eerder gekarakteriseerd replicatie kinetiek. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Kleine aanpassingen in plaque assay omstandigheden kunnen de resultaten aanzienlijk te veranderen, en de evaluatie en de uitvoering van een nieuw systeem of techniek altijd nodig is. Terwijl een geoptimaliseerde en gestandaardiseerde plaquetest protocol bestaat niet voor iedere situatie, ons rapport tonen de veelzijdigheid en gebruiksgemak in zowel traditionele als nieuwe vloeibare overlays voor plaque assays, terwijl het verstrekken van een voldoende achtergrond voor verdere gebruiker wijzigingen.

De accurate isolatie en kwantificering van levensvatbare virale monsters heeft consequent geweest van een lopend onderzoek doel in virologie. Het was niet tot de komst van de plaque-test in 1952, dat een middel om kwantitatief en kwalitatief te berekenen dierlijke virale titers werd voor het eerst ontwikkeld 1,2. Deze techniek werd voor het eerst aangepast en gewijzigd uit faag assays, die eerder was gebruikt om titers voorraad bacteriofagen berekenen in plant biology 1,2. Terwijl alternatieve middelen voor virale kwantificering zijn inmiddels ontwikkeld en aangepast, zoals immunoassays, fluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie, afstembare resistieve puls sensing (TRPS), flowcytometrie, recombinant reportersystemen en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) , deze methoden niet replicatiecompetente vironen 1,3 identificeren en te kwantificeren. Terwijl de vooruitgang in technologieën en technieken verder te verfijnen en het landschap te veranderen; plaque assays steeds de gouden standaard vertegenwoordigen bepalen virale lytische concentraties infectieuze vironen 1,4. Tijdens een plaque assay is een confluente monolaag van gastheercellen geïnfecteerd met een lytisch virus van een onbekende concentratie die werd serieel verdund tot een telbare bereik, typisch tussen 5-100 virions. Geïnfecteerde monolagen worden vervolgens bedekt met een overlay immobiliserende medium te voorkomen virale infectie willekeurig verspreid door zowel de mechanische of convectional stroming van het vloeibare medium bij virale propagatie. Hoewel vaste of halfvaste Bekleding zoals agarose, methylcellulose en carboxymethylcellulose (CMC) van oudsher gebruikt, zijn vloeibare bekledingen steeds aantrekkelijk alternatief met de ontwikkeling van nieuwe vloeibare bekledingen worden bijvoorbeeld Avicel 5- 7. Plaque assays met behulp van vloeibare versus traditionele overlays hebben een aantal voordelen zoals de overlay kan applied bij kamertemperatuur en toepassing en verwijdering aanzienlijk eenvoudiger. Als vloeibare overlays geen opwarming vereist, kan delicate en warmte labiel virussen ook blijken makkelijker te plaque. Na de eerste infectie en toepassing van het immobiliserende overlay individuele plaques of zones van celdood, zal beginnen te ontwikkelen virale infectie en replicatie beperkt zijn tot de omringende monolaag. Geïnfecteerde cellen de replicatie-lysis-infectiecyclus voortgezet verder verspreiding van de infectie, resulterend in steeds verschillende en discrete plaques. Afhankelijk van de virale groeikinetiek en gastheercel wordt een zichtbare plaque vormen normaal binnen 2-14 dagen. Cellulaire monolagen kan dan worden geteld met een standaard helderveld microscoop of typischer gefixeerd en tegengekleurd met neutraal rood of kristal gewelddadige om gemakkelijk plaques identificeren met het blote oog. Er is een grote verscheidenheid van plaque tegen vlekken voorzien, elk met their specifieke voor- en nadelen. Kristalviolet wordt kenmerkend toegevoegd op het verzamelpunt en na de fixatie / verwijdering van de bekleding, die een snelle en duidelijke teller vlek die zorgt voor de identificatie van kleine plaques wanneer gemengd morfologie aanwezig is. Neutraal rood heeft het voordeel van vroegtijdige toepassing en voortdurend contact met de overlay, waardoor de levende bewaking ontwikkelen plaquevorming, wat vooral nuttig bij het werken met een onbekend virus of replicatie kinetiek. Wij hebben echter ontdekt dat vlekken is meestal niet als onderscheiden bij het gebruik van neutraal rood. 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) biedt verschillende voordelen, zoals de gele kleurstof vlekken levende cellen donkerblauw en virale plaques te tellen zonder verwijdering van de overlay met neutraal rood. Het hoge contrast tussen levende en dode cellen wordt geboden door MTT maakt ook de detectie van kleine plaques op een eerder tijdstip na infectieHoewel opslag nog verwijdering van de overlay 8 vereist. Als kristal violet eenvoudig worden gemaakt in een oplossing van water en alcohol, en zorgt voor een hoge mate van gevoeligheid voor gemengd plaque morfologie, hebben we gekozen als geprefereerde en vereenvoudigde teller kleuring voor het protocol aangetoond dat we gebruik meerdere families goed gekarakteriseerde virussen. Na de vaststelling van en het kleuren van de geïnfecteerde cel monolaag, worden plaques geteld om virale voorraadmonsters titreren in termen van plaque-vormende eenheden (pve) per milliliter. Een log druppel opgemerkt tussen seriële verdunningen en afhankelijk plaatformaat tussen 5-100 plaques geteld, met een negatieve controle gebruikt als referentie. Statistisch monsters zullen variëren met 10% voor elke 100 plaques geteld bij het ​​vergelijken van sample repliceert 3. Het voordeel van plaque assays voor virale titers vast ligt in hun vermogen om het werkelijke aantal infectieuze virusdeeltjes kwantificeren wedurende het monster. Als meerdere virusdeeltjes zou kunnen infecteren van een enkele cel, wordt de terminologie van eenheden versus vironen gebruikt tijdens plaque titraties 1,2. Plaque morfologie kan variëren sterk onder verschillende groeiomstandigheden en tussen virale soorten. Plaque grootte, helderheid, grens definitie en distributie moet worden opgemerkt zij waardevolle gegevens over de groei en virulentie factoren van het virus in kwestie verschaffen. Basic plaque assay principes kunnen worden aangepast en gemodificeerd op een aantal verschillende manieren, zoals het gebruik focus vormende assays (FFA). FFAs vertrouw niet op cellysis en tegenkleuring om plaquevorming te detecteren, maar eerder in dienst immunokleuren technieken om intracellulaire virale eiwitten direct te detecteren door middel van tag antilichamen. Verhoogde gevoeligheid, verlaagd incubatietijden na infectie, en vooral de mogelijkheid kwantificeerbaar niet-lytische virussen allemaal verschillendvoordelen bij toepassing FFA. Alom gebruikte, de kritische beperkende factoren in FFA versus een traditionele plaque assay ligt in de noodzaak van passende antilichamen en het vermogen om enige probe virale eiwit subeenheden en werkelijke infectieuze vironen 4. Voor het doel van deze studie, zullen we onze discussie beperken tot de klassieke plaque assays en beschrijven het gebruik van traditionele solide en halfvaste overlays (agarose en CMC), samen met nieuwe vloeistof microkristallijne cellulose overlays.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>Voor seriële verdunningen</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Opwarmen tot 37 &#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Voor gebruik gedurende 30 min bij 62 &#176;C verwarmen</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Maak aliquots/Vermijd bevriezen en ontdooien</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Krachtig schudden bij het oplossen&nbsp; gedurende >30 min om te homogeniseren</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

virale concentratie bepaling door plaque testen: met behulp van traditionele en novel overlay system

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays blijven één van de meest accurate methode voor directe kwantificering van infectieuze vironen en antivirale stoffen door het tellen van afzonderlijke plaques (infectieuze eenheden en cellulaire dode zones) in celcultuur. Hier laten we zien hoe een eenvoudige plaque assay uitgevoerd en hoe uiteenlopende overlays en technieken kunnen beïnvloeden plaquevorming en productie. Typisch vaste of halfvaste overlay substraten, zoals agarose of carboxymethylcellulose zijn gebruikt om virale verspreiding te beperken, voorkomen willekeurige besmetting door het vloeibare groeimedium. Geïmmobiliseerd overlays beperken cellulaire infectie aan de direct omliggende monolaag, waardoor de vorming van discrete telbare brandpunten en de daaropvolgende vorming van tandplak. Om de problemen die inherent zijn aan traditionele overlays overwinnen, heeft een nieuw vloeibaar overlay gebruikmaking microkristallijne cellulose en carboxymethylcellulose natrium steeds meer gebruikt als een vervanger in de normplaque assay. Liquid overlay plaque assays kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een van beide standaard 6 of 12 wells plaat formaten per traditionele technieken en vereisen geen speciale apparatuur. Door zijn vloeibare toestand en vervolgens gemakkelijk aanbrengen en verwijderen, kan microkweek plaatformaten ook worden gebruikt als een snelle, accurate en high throughput alternatief voor grootschalige virale titraties. Het gebruik van een niet-verwarmde viskeuze vloeistof polymeer biedt de mogelijkheid om werk te stroomlijnen, conserveert reagentia, incubator ruimte, en verhoogt de operationele veiligheid bij gebruik in traditionele of high containment labs als geen reagensverwarmingssysteem of glaswerk zijn vereist. Liquid overlays kan ook blijken gevoeliger dan traditionele overlays voor bepaalde hitte labiel virussen.

Het vermogen van plaque assays virale titers nauwkeurig te beoordelen steunt op talrijke factoren: geschikte gastheercel selectie, goede media en groeiomstandigheden voor cellulaire en virale levensvatbaarheid geïmmobiliseerd virale propagatie en een nauwkeurige bepaling van de virale incubatieperiode om voldoende verschillende toestaan en telbare plaquevorming. Voor deze studie werden virussen van drie representatieve families gekozen verschillen tonen: overlay selectie, incubatietijd en plaque morfologie in verschillende soorten monsters. Venezolaans Equine Encefalitis (VEEV) werd geselecteerd als (+) ssRNA virale model dat significante ziekte in paarden en mensen kunnen veroorzaken, en vertegenwoordigt de familie Togaviridae. Influenza B Taiwan stam, een gesegmenteerd (-) ssRNA virus voornamelijk infecteert mensen, vertegenwoordigt de familie Orthomyxoviridae. Rift Valley fever virus (RVFV), een (-) ssRNA geleedpotigen geboren virus voornamelijk infecteren geleedpotigen,herkauwers en mensen, werd geselecteerd als een vertegenwoordiger van de familie Bunyaviridae. Voor RVFV (figuur 1), werden titers bepaald uit een voorraadoplossing van een recombinant levend verzwakte stam MP12 van RVFV in een 12 well plaat formaat gebruik CMC, agarose of Avicel bekledingen die zijn geïncubeerd side-by-side voor 72 uur na infectie (HPI). Een representatieve plaat toont verdunningen variërend van 10 -4 tot 10 -7 te zien in paneel A. Plaques met CMC en agarose overlays vertoonden kleine, heldere en duidelijke plaques met een goed gedefinieerde cirkelgrens. Plaques met een vloeistof overlay waren iets meer overvloedig en groter in vergelijking met agarose en CMC plaques, en gaven een minder duidelijke grens. Virale titers werden vergeleken in paneel B met alle overlays uitvoeren vergelijkbaar. Om een ​​duidelijker visuele vergelijking tussen overlays voor MP12 samen met een grotere steekproef te reproduc bepalen verkrijgenbaarheid, een plaat met 6 putjes werd uitgetest in drievoud (figuur 2). In de plaat met 6 putjes format, het gebruik van een CMC overlay toonde plaques kleiner dan hetzij agarose of vloeibare bekledingen, die in omvang vergelijkbaar met elkaar zijn. Hoewel virale titers waren vergelijkbaar tussen de drie overlays (Panel D), plaques gevormd in agarose en vloeibare overlays bleken kan worden gerekend vanwege hun toegenomen omvang. In tegenstelling RVFV, VEEV titers en plaque morfologie tussen de verschillende overlays varieerde sterk (figuur 3A). Gevormde plaques in CMC overlays toonden een heldere en duidelijke morfologie bij gebruik van een 12 well plaat formaat, ten koste van plaque grootte en gevoeligheid (Panel B). In tegenstelling tot CMC, het gebruik van agarose en vloeibare bekledingen in significant grotere plaques, wat aangeeft lagere virale remming en verhoogde gevoeligheid voor VEEV replicatie. Dit werd eerder bevestigd toen alleen het vergelijken van agarose versus CMC in apaper gepubliceerd door Juarez et al. 4. Terwijl agarose en vloeibare overlays geproduceerd grotere plaques dan CMC, had de plaques slecht gedefinieerde grenzen en waren moeilijk te tellen in een 12 well formaat, met vloeibare overlays verstrekken van de grootste grens diffusie. Wanneer plaques werden uitgetest in 6 well platen (figuur 4), de grotere 6 putjes ontkend de afgifte van openlijk grote plaques die moeilijk te onderscheiden in de 12 putjes waren met agarose en vloeibare overlays bewijzen boven de CMC overlays qua plaque definitie en met gevoel (Figuur 4D). In vergelijking met RVFV of VEEV, influenza allerlei unieke uitdagingen bij plaquing, zoals het vereiste van een externe protease. De gevoeligheid van influenzavirus verschillende overlay selecties is ook goed gedocumenteerd in het verleden belangrijke wijzigingen zijn opgemerkt bij wijzigingen zo gering als verschillende merken van agarose te hebbenen gebruikt 9. Interessant voor de Influenza B Taiwan stam, het gebruik van CMC als overlay resulteerde in aanzienlijk kleinere plaques die moeilijk te tellen waren en bleek moeilijk betrouwbaar te scoren (Figuur 5A). Het gebruik van een agarose overlay verschaft de beste plaques (Panel C) en resulteerde in een donkere achtergrond kleuring (waarschijnlijk door verhoogde levensvatbaarheid monolaag) en liet duidelijkere en scherper plaques in directe vergelijking met het gebruik van de vloeibare bekleding (Panel B ). Een duidelijk voordeel van vloeibare polymeren in vaste en halfvaste overlays, zoals agarose en CMC, ligt in het gemak van verwijdering en toepassing. Halfvaste overlays nodig verwarming, en stolling kan problematisch blijken bij het hanteren en het verwijderen. Om te profiteren van deze voordelen en aan de uitvoerbaarheid van het gebruik van Avicel in een high-throughput manier voor RVFV bepalen, werd een 96 well plaat formaat uitgetest op verschillende overlay concentratiuitbreidingen (Figuur 6). Voor RVFV MP-12, werden verdunningen uitgevoerd in viervoud zowel 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel. Overlay aanbrengen en verwijderen bewezen eenvoudige, zonder duidelijke verschillen tussen replicaten of tussen concentraties opgemerkt blijk van een hoge mate van reproduceerbaarheid. Bij het scoren, plaques werden gescheiden en telbare het blote oog laten de haalbaarheid zien van het gebruik van vloeibare bekledingen op een high throughput wijze voor RVFV. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. RVFV plaque overlay vergelijkingen gebruik 12 putjes Veros werden uitgeplaat bij 2,5 x 10 5 cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster MP12. Na infectie 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC (final concentrations), werden toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A. plaques werden geteld en getitreerd in paneel B. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. RVFV plaque overlay vergelijkingen behulp 6 putjes Veros werden met 5 x 10 5 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster MP12. Drie ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A, werden B en C. Afzonderlijke experimenten uitgevoerd identiek zoals beschreven voor Panelen AC, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figuur 3: &lt;strong&gt; VEEV plaque overlay vergelijkingen gebruik 12 putjes. Veros werden uitgeplaat bij 2,5 x 10 5 cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 ul met hetzelfde serieel verdunde monster starten van de VEEV TC-83 vaccinstam. Na infectie van 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A. plaques werden geteld en getitreerd in paneel B. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figuur 4:. V EEV plaque overlay vergelijkingen behulp 6 putjes Veros werden met 5 x 10 5 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster VEEV TC-83. Na infectie, 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays rechtstreeks te vergelijken zoals aangetoondin panelen A, B en C werden aparte experimenten uitgevoerd identiek zoals beschreven voor Panelen A - C, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figuur 5: Influenza plaque overlay vergelijkingen MDCK-cellen werden met 5 x 10 5 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul inoculum met dezelfde serieel verdunde monster starten van Influenza B Taiwan.. Geen foetaal runderserum (FBS) werd gebruikt in de groeimedia of bekledingen, zoals FBS Influenza voortplanting kunnen remmen door remming van bepaalde proteasen die nodig zijn voor virale fusie. TPCK-trypsine om alle overlays voor aanbrengen toegevoegd om virale fusie en toegang met de gastheercellen vergemakkelijken. Na infectie werden 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC om direct vergelijken toegepastde overlays zoals aangetoond in paneel A, B en C. Afzonderlijke experimenten werden uitgevoerd identiek zoals beschreven in Panels A - C, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3). Terwijl een gemiddelde werd genomen voor CMC plaques ze bleken niet betrouwbaar te tellen als ze aangetoond diffuse grenzen en zeer kleine plaquette maten. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figuur 6:. High throughput plaque overlays Een 96 putjes van Veros uitgeplaat bij 3 x 10 4 cellen per putje, werden geïnfecteerd met 50 pi inoculum met dezelfde serieel verdund vanaf monster RVFV MP12 gedurende 1 uur in viervoud. Voor de overlays, 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel uitgetest om de haalbaarheid en de reproduceerbaarheid van het gebruik van vloeibare bekledingen in een high-throughput wijze, Panelen A en B vast. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Celtype </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infectie periode </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Incubatietijd </td><td> 3 dagen </td><td> 2 dagen </td><td> 3 dagen </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Plaque Assay Inenting Voorwaarden en Cell Types <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Cell Type </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Groei Type</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plaque Media </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% L-glutamine, 1% Penicllin / Streptomycine. 2. Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium aangevuld met 1% L-glutamine, 1% Penicllin / streptomycine, 0,2% runderserumalbumine, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml. A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% natriumpyruvaat (5 ml), 1% L-Glutamine (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 0,2% runderserumalbumine, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, trypsine-TPCK * * Net voor de voorbereiding, voeg 1 ui per 25ml van 2 pg / ml voorraad van TPCK-trypsine om de hoeveelheid die u gaat gebruiken om te mengen met agarose voor plaques. Tabel 2: Plaque en Viral / cellulaire groei Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Celtype </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infectie periode </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Incubatietijd </td><td> 3 dagen </td><td> 2 dagen </td><td> 3 dagen </td></tr></tbody></table> Overlay oplossingen zullen niet ophouden te bestaan ​​wanneer zolang steriliteit wordt gehandhaafd gemaakt. Tabel 3: Overlays Stock <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 goed </td><td> 12 goed </td><td> 96 putjes </td></tr><tr><td> # Van cellen / putje </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume van innoculum (pl) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume van de overlay (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Plaat Formats

Plaque-assays zijn de gouden standaard voor virale kwantificering, waarbij overdekken met gevangenisoverlagen op hostcellulaire monolagen worden gebruikt om virale titers te bepalen. Hoewel traditioneel verschillende semi-solide overlagen zijn gebruikt, tonen we hier plaque-technieken die semi-solide overlagen vergelijken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose onder verschillende families van virussen.

Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de virale concentratie te bepalen door de kwantificatie van infectieuze varionen via het tellen van discrete plaques in een celcultuur. Dit wordt bereikt door eerst cellen uit te platen om een confluente monolaag voor infectie te vormen. De tweede stap is het uitvoeren van een seriële verdunning van het onbekende virale monster dat gekwantificeerd moet worden. Vervolgens worden de confluente monolagen geïnfecteerd met de seriële verdunning van de virale voorraad, gevolgd door het aanbrengen van een immobiliserende overlay. De laatste stap is het fixeren en kleuren van de plaques na de juiste incubatietijd voor het betreffende virus, om zo de discrete plaques te kunnen tellen. Uiteindelijk kunnen plaque-assays op verschillende manieren worden gebruikt en aangepast om de virale titers van een onbekend viraal monster te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de semi-solide overlay, is dat het aanbrengen en verwijderen veel eenvoudiger is bij zowel high-throughput als traditionele toepassingen. Daarnaast is er geen verhitting van de reagentia vereist. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het onderzoek naar vele verschillende lytische virussen, aangezien het gebruik van een vloeibare overlay in een 96-well formaat snelle screening van nieuwe therapeutische verbindingen mogelijk maakt, wat de vele uren in het laboratorium voor het uitvoeren van traditionele plaque-assays aanzienlijk kan verminderen.Plate de dag vóór de assay de juiste cellen voor het betreffende virus om op de dag van infectie een confluentie van 90 tot 100% te bereiken. De stockoplossingen kunnen ook de dag vóór de assay worden voorbereid. Bereid eerst een fixeersolution van 10% formaldehyde in gedestilleerd water door 5,56 milliliter van een 36% formaldehyde-stockoplossing te mengen met 14,44 milliliter gedestilleerd water. Bereid vervolgens de kristalvioletkleuring bestaande uit 1% kristalviolet in 20% ethanol, verdund met gedestilleerd water. Bereid daarna, onder steriele omstandigheden, het juiste 2x plaque-medium voor het gebruikte celtype. Filtreer de oplossing door een 0,2 micron filter als een van de reagentia niet steriel is. Om een vloeibare overlay voor gebruik in de plaque-assay voor te bereiden, voegt u 2,4 gram Avicel toe aan een kolf met 97,6 milliliter gedestilleerd water onder snel roeren met een roerstaaf. Meng de oplossing bij kamertemperatuur totdat deze te viskeus wordt voor de roerstaaf. Verplaats de kolf op dit moment naar een schudkolf en schud deze gedurende 30 minuten krachtig om een gelijkmatige homogenisatie te garanderen. Autoclaveer de oplossing tot slot bij 121 °C bij 14 PSI gedurende 30 minuten.Sla het mengsel na voltooiing van het programma verzegeld op bij kamertemperatuur op. Bereid voor een agarose-overlay een 0,6% agarose-stockoplossing in gedestilleerd water, meng dit met een roerstaaf en autoclaveer om de oplossing volledig op te lossen. Bereid voor een carboxymethylcellulose-overlay een 2% carboxymethylcellulose-oplossing in gedestilleerd water en meng deze. Autoclaveer vervolgens zoals eerder beschreven.Gebruik de dag na het uitplaten een omgekeerde microscoop om de confluentie en levensvatbaarheid van de cellen te controleren voordat de assay wordt gestart. Controleer of de cellen een standaard cellulaire morfologie vertonen en een confluentie van ongeveer 90% hebben.Voer een tienvoudige seriële verdunning van de infectieuze monsters uit in celgroeimedium, waarbij het aantal benodigde verdunningen varieert op basis van de verwachte titer van het betreffende virus. Bereid daarnaast een niet-geïnfecteerde controlemonster voor om onafhankelijk de cellevensvatbaarheid te waarborgen en te helpen bij de plaque-identificatie. Pipetteer de niet-geïnfecteerde controle en de seriële verdunningen in de putjes van de plaat, waarbij u er zorg voor draagt dat de monolaag niet wordt verstoord.Gebruik een voldoende volume inoculum om de cellen te bedekken, terwijl het volume zo laag mogelijk wordt gehouden om het virale contact met de monolaag te maximaliseren. Plaats de platen in de weefselkweekincubator en infecteer de cellen gedurende 45 minuten tot één uur. Schud de platen elke 20 minuten voorzichtig heen en weer om een gelijkmatige bedekking te garanderen en te voorkomen dat de cellulaire monolaag uitdroogt.Bereid tijdens de infectie de werkoplossing voor vloeibare overlays voor. Meng verwarmd plaque-medium en 1,2 tot 2,4% Stock Avicel op kamertemperatuur in een verhouding van één-op-één om een werkoplossing van 0,6 tot 1,2% Avicel overlay-medium te verkrijgen. Voor agarose- of CMC-overlays mengt u verwarmd plaque-medium en een voorraadoplossing van ofwel verhit 0,6% agarose of 2% CMC in een verhouding van één-op-één. Plaats dit vervolgens gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 °C voor temperatuurequilibratie. Zorg ervoor dat de oplossing warm is, maar niet heet aanvoelt, om celdood en verminderde virale titers te voorkomen. Breng na de infectie de overlays aan op de geïnfecteerde monolagen. Incubeer de platen na toevoeging van de overlay gedurende twee tot 14 dagen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide, afhankelijk van het geanalyseerde virus.Om cellen met een vloeibare overlay te fixeren, giet u de Avicel-overlay af of aspireert u deze, waarna u een 10% formaldehyde-oplossing in de wells pipetteert en fixeert bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot overnacht. Voor agarose of CMC voegt u de formaldehyde-oplossing direct toe aan de overlay gedurende één uur tot overnacht bij kamertemperatuur. Verwijder na fixatie de formaldehyde en verwijder vervolgens handmatig de semi-solide agarose-pluggen met de spatel.Spoel de Avicel-celplaatjes met water om resterend fixatief van de overlay te verwijderen vóór het kleuren.Dek de cellen voor de kleuring af met een minimale hoeveelheid kristalvioletoplossing gedurende ongeveer 15 minuten. Schud de platen indien nodig om een gelijkmatige dekking te garanderen. Was de kristalvioletkleuring voorzichtig af met water. Bewaar de plaques na fixatie, kleuring en droging onbeperkt voor toekomstige analyse. Tel de plaques in elke put en negeer putten met minder dan vijf of meer dan 100 plaques. Neem het gemiddelde van eventuele technische replica's van dezelfde verdunning. Noteer de grootte en morfologie van de plaques. Bepaal de virale titer van het voorraadmonster door het gemiddelde aantal plaques voor een verdunning en de inverse van de totale verdunningsfactor te nemen.Deze afbeelding toont vergelijkingen van plaque-overlays voor het Rift Valley-koortsvirus met gebruik van 12-wells platen. Vero-cellen werden uitgeplaat in 12-wells platen tegen een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen en geïnfecteerd met 200 µL van hetzelfde serieel verdunde startmonster van MP 12. Na infectie werden overlays van 1,5 mL bestaande uit 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht om de overlays direct te vergelijken. Dit histogram toont de resultaten van de plaque-tellingen en titratie voor alle drie de overlays. Hier worden vergelijkingen van VEEV plaque-overlays met gebruik van 12-wells platen getoond. Vero-cellen werden zoals voorheen uitgeplaat en geïnfecteerd met een volume van 200 µL van hetzelfde serieel verdunde startmonster van de VEEV-TC 83 vaccinstam; na infectie werden overlays van 1,5 mL van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht zoals voorheen.Opnieuw toont het histogram de resultaten van de plaque-tellingen en titrering voor alle drie de overlays. Deze afbeelding toont een voorbeeld van plaque-overlays met een hoge doorvoersnelheid. Een 96-wells plaat met Vero-cellen, uitgeplaat met 3 × 10⁴ cellen per well, werd gedurende één uur in quadruplo geïnfecteerd met 50 µL inoculum, gebruikmakend van hetzelfde serieel verdunde startmonster van Rift Valley fever virus MP 12. Voor de overlays werden finale concentraties van 0,6% en 1,2% Avicel getest om de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van het gebruik van vloeibare overlays in een high-throughput methode te bepalen. Dit histogram toont de titers die zijn bepaald voor elke overlay.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elk virus verschilt en dat optimalisaties, waaronder het gebruik van verschillende celtypen, incubatietijden en/of groeimedia, noodzakelijk kunnen zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van een basis plaque-assay met behulp van zowel vloeibare als semi-solide overlays.

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Bij het werken met media en reagentia die worden gebruikt om cultuur micro-organismen, moet een aseptische techniek worden toegepast om ervoor te zorgen besmetting tot een minimum beperkt. Verschillende platen methoden worden routinematig gebruikt voor het isoleren, propageren of sommen bacteriën en faag, die opgenomen procedures die de steriliteit van experimentele materialen handhaven.

Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

Hier beschrijven we een methode om infectieuze deeltjes van murine norovirus (MNV), de enige norovirus die efficiënt repliceert in celkweek kwantificeren. De plaque assay maakt gebruik van tropisme MNV voor murine macrofagen en kan worden aangepast voor gebruik met biologische of milieumonsters met MNV.

Plaque assay voor Murine Norovirus

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

This video describes the virus plaque assay of the infectious herpes simplex virus or HSV. The diluted viral particles are inoculated to the monolayer of epithelial cells. Upon incubation, the virus forms plaques and is counted visually to determine the infectious virus titer.

Virus Plaque Assay: A Technique to Measure Infectious Herpes Simplex Virus via Quantification of Plaques Formed in Monolayer of Virus-Infected Cells

This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Dit artikel presenteert een methode op basis van luciferase-expressie met hoge doorvoer voor het titreren van verschillende RNA- en DNA-virussen met behulp van geautomatiseerde en handmatige vloeistofbewogen.

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Deze studie beschrijft een   -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.

Plaquing van Herpes Simplex Virussen

Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).

Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

Leer virale concentratiebepaling door plaque-testen met traditionele en nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose overlay-methoden. Deze techniek vereenvoudigt toepassing en verwijdering voor hoogdoorvoeronderzoek.

Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Meer video's verkennen