Name: Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer mitochondriën isoleren uit gekweekte cellen en muizenweefsel om hun membraanpotentiaal te meten met fluorescentiedye. Deze methode helpt onderzoekers cellulaire gezondheid en stressrespons te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NSF-subsidie CHE-1229562 (VDGM), het Office of Undergraduate Research aan de Elon University, de afdeling Scheikunde van Elon en de Elon Lumen Prijs (TL en TAD), het Elon College Fellows Programma (JAC) en het Honors Programma van Elon College (TAD).

Alle dierproeven gelijkvormig aan National Institutes of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door de Wake Forest University Animal Care en gebruik Comite. Broedparen voor SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] muismodel werden verkregen van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Transgene wild-type (WT) vrouwtjes en mannetjes SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] werden gefokt om SOD1G93A muizen en transgene WT nestgenoten die werden gebruikt in de experimenten te genereren. 1. Modellen voor Onderzoek <ol><li> Celcultuur <ol><li> Handhaaf humane embryonale niercellen (HEK-T293) cellen in DMEM aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 1% L-glutamine, bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Groeien cellen in T75 flessen en hen in staat stellen tot 90% samenvloeiing bereiken. </li><li> Voer cel splitsen door behandeling met trypsine (0,25% trypsine-EDTA) gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C in 5% CO2 </sub&gt; Inactivering van trypsine met gelijk volume van celmedium en centrifugeren van de cellen gedurende 5 min bij 700 xg bij 4 ° C. </li><li> Zuigen de media en resuspendeer de cel pellet in cultuur media. </li><li> Zaad cellen in de juiste kolf of de plaat 7 x 10 4 cellen in een T75 kolf 48 uur voorafgaand aan de behandeling cytokine. Dit moet geven ~ 70% dichtheid op het moment van de behandeling. </li><li> Serum verhongeren cellen 24 uur later opzuigen door de media en vervangen door hetzelfde volume van serumvrij medium (DMEM, steriel). </li><li> Bereid TNF-α, IL1-β, en IFN-γ, van gevriesdroogd poeder met ultra-zuiver water bij het werken concentraties van 5 pg / ul, 10 ng / ul, en 10 ng / ul, respectievelijk en voeg ze toe aan de putjes / kolven. </li><li> Behandel serum uitgehongerde cellen door toevoeging van opgeloste cytokinen direct naar celkweekmedium geschikte kolven. Behandelingen bestonden uit individuele cytokinen, een cocktail van 3 (hierna &quot;* 3&quot;), of sterile water als controle (aangeduid als &quot;0&quot;). </li><li> Incubeer behandelde cellen 24, 48 of 72 uur voor de beoordeling en oogsten. </li></ol></li><li> Cellevensvatbaarheid beoordeling <ol><li> Voeg een 5 mg / ml oplossing van 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) in 1x PBS. </li><li> Voor 12-well platen, voeg 100 ul MTT-oplossing aan elk putje en voorzichtig zwenken om een ​​gelijkmatige verdeling te verzekeren. </li><li> Incubeer de platen gedurende 15 minuten-1 uur bij 37 ° C in 5% CO2, en controleer onder een microscoop op de aanwezigheid van paars gekleurd. Als er geen paars aanwezig is, wervelen weer en laat cellen te incuberen in 5 min intervallen tot paars wordt waargenomen. De hoeveelheid tijd die nodig is moet worden bepaald door elke onderzoeker. </li><li> Met een herhaling pipet, voeg 700 ul MTT oplosmiddel (4 mM HCl en 0,1% NP40 in isopropanol) aan elk putje en schud de plaat (platen) bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten of tot al paarse kleur cellen hadden verlaten . Als paarskleur niet uit cellen komen, voegt een extra 200 ul van oplosmiddel en blijven wervelen. </li><li> Voor analyse nemen 100 pl van elk putje en plaats in een 96-well plaat en afgelezen op een plaatlezer met 570 nm en een referentie golflengte van 630 nm, 595 nm echter ook aanvaardbaar zolang metingen uitgevoerd bij constante instelling. </li></ol></li><li> Diermodel voor ALS <ol><li> Alle dierproeven gelijkvormig aan National Institutes of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door de Wake Forest University Animal Care en gebruik Comite. Broedparen voor SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] muismodel werden verkregen van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Transgene wild-type (WT) vrouwtjes en mannetjes SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] werden gefokt om SOD1G93A muizen en transgene WT nestgenoten die werden gebruikt in de experimenten te genereren. </li><li> Voeren genotypering met standaard primers tegen mutant SOD1 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolatie van Mitochondriën OPMERKING: Het is belangrijk om snel te werken en houden alles op het ijs tijdens de gehele procedure. <ol><li> Voorbereiding van mitochondriale isolatie buffer (MIB), ruggenmerg isolatie buffer (SC MIB) en experimentele buffer (EB) <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen voor tijd voor de MIB en EB. </li><li> Voeg 1 M Tris / MOPS door het oplossen van 12,1 g Tris base in 70 ml H2O Voeg droge MOPS om de pH naar 7,4. Stel het volume op 100 ml finale. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Maak 1 M Kphos door het mengen van 80,2 ml van K 2 HPO 4 en 19,8 ml van KH 2 PO 4. Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 0,2 M EGTA / Tris door toevoeging van 3,8 g EGTA 10 ml H2O Voeg 1 M Tris / MOPS totdat het is opgelost, ~ 30-40 ml. Pas op 50 ml, steriel filter en bij kamertemperatuur bewaren. Merk op dat de pH zal ~ 6,7. </li><li> Maak 1 M Glutamaat door het maken van 10 ml1 M oplossing van glutaminezuur. Filter steriliseer en bewaar 4 ° C. </li><li> Voeg 1 M malaat door 10 ml 1 M oplossing van appelzuur. Voeg Tris / 50 mM MOPS. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Maak MIB bij een concentratie van 200 mM sucrose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, en 1 mM EGTA / Tris. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Maak SC MIB in een concentratie van 250 mM sucrose, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, en protease inhibitor cocktail. </li><li> Maak EB bij een concentratie van 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutamaat, 2,5 mM malaat, 1 mM K fosfaat, pH 7,4 en 10 mM EGTA / Tris. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Apparatuur voorbereiding voorafgaand aan het oogsten van de cellen. <ol><li> Spoel een klein glazen vat en homogenisering stamper drie keer met steriel water en plaats op ijs. </li><li> Verzamel nodige items zoals een standaard boormachine, mobiele scrapers, 1.5 ml, 15 ml en 50 ml buisjes en oplossingen. </li></ol></li><li> Mitochondriën Isolatie <ol><li> Gekweekte Cellen <ol><li> Voor elk monster gebruikt twee T175 kolven cellen. </li><li> Zorg ervoor dat cellen -90% confluent en gebruik in controle-experimenten, of platen en behandelen zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Op het werkblad, aspireren media en was de hechtende cellen tweemaal met 15 ml 1x PBS telkens. </li><li> Zuig het buffer en schraap kolven de hechtende cellen van de bodem van de kolf te verwijderen. </li><li> Voeg 15 ml 1x PBS aan elke kolf, werveling, en over te dragen aan de individuele 15 ml conische buizen en plaats op ijs. </li><li> Zodra schrapen gedaan, centrifuge de buizen gedurende 5 min bij 700 xg, 4 ° C met een tafelblad centrifuge met een swinging bucket rotor. </li><li> Aspireren bovenstaande vloeistoffen en resuspendeer elke pellet in 1 ml van MIB. </li><li> Combineer beide schorsingen en over te dragen aan een kleine glazen vat voor homogenisering. </li><li> Voeg MIBom het schip tot de buffer bereikt de eerste lijn. Homogeniseren cellen met de stamper gehecht aan een boor met gemiddelde snelheid voor drie passen. Zorg ervoor dat het schip is op het ijs tijdens deze stap, de stamper boven de vloeistof niet te verwijderen en om een ​​constante snelheid te gebruiken met continue passes. </li><li> Breng de gehomogeniseerde oplossing in een 50 ml conische buis. </li><li> Zuig de oplossing in een spuit van 3 ml met behulp van een 18 gauge 1 ½ inch naald en verdrijven het terug in de conische buis op ijs met een 27 gauge ½ inch naald. Zorg ervoor dat de oplossing tegen de binnenwand van de buis verdrijven om die kracht celmembraan verstoring gebruiken. </li><li> Herhaal de spuit stappen in totaal vijf keer. </li><li> Breng de oplossing in een 15 ml conische buis en centrifugeer 5 min bij 600 xg, 4 ° C in een tafelblad centrifuge met een swinging bucket rotor. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant en verdelen over drie 1,5 ml buizen. OPMERKING: Mitochondria zijn in de supernatant na de eerste, langzame rotatie, terwijl celmembranen en ongebroken cellen worden gepelleteerd. </li><li> Centrifugebuizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Aspireren bovenstaande vloeistoffen en combineer de pellets in 100 pi MIB en direct te plaatsen op het ijs. OPMERKING: Mitochondriën zijn in de pellet na deze snelle draai. Mitochondriën zal doorgaans de membraanpotentiaal voor -2-3 ion ijs na isolatie behouden en zijn het meest stabiel als een geconcentreerde voorraadoplossing in MIB. </li></ol></li><li> Mitochondriën isolatie van de muis weefsel <ol><li> Verdoven de muis volgens IACUC protocol. Stel een verdamper bij 5,0% tot anesthesie. Bevestigd dat het dier wordt verdoofd door een gebrek aan reflex te voet snuifje of knipperreflex wanneer het oog wordt benaderd of getapt met een wattenstaafje. Houd de muis onder verdoving voor de gehele chirurgische procedure houden de verdamper tussen 1,5% en 2,0%. </li><li> Excise de lever en het ruggenmerg van elk dier en plaats afzonderlijk in ijskoud 1x PBS - / - om weg geen bloed te spoelen. </li><li> Voor de lever, de overdracht van het weefsel naar een weeg schaal op ijs en hakken in fijne stukjes met behulp van een frisse scheermesje voor 1 min. </li><li> Weefsel en geschikte buffer (MIB voor lever of SC MIB voor het ruggenmerg) toe te voegen aan het schip, totdat de buffer van de eerste lijn bereikt. Homogeniseren weefsel met de stamper van de hand voor vijf passes. Zorg ervoor dat het schip is op het ijs tijdens deze stap, de stamper boven de vloeistof niet te verwijderen en om een ​​constante snelheid te gebruiken met continue passes. </li><li> Breng de homogenaten 15 ml schone buizen. </li><li> Centrifugebuizen in een vaste hoek rotor bij 750 xg, 4 ° C gedurende 10 min. </li><li> Sla de bovenstaande vloeistoffen in schone buizen en plaats ze op ijs. OPMERKING: Mitochondriën zijn in de supernatant na de eerste, langzame rotatie, terwijl celmembranen en ongebroken cellen worden gepelleteerd. </li><li> Re-schorten het ruggenmerg pellets in 500 ul van SC MIB. </li><li> Re-homogeniseren elk drie keer, alleen het vullen van het schip halverwege met SC MIB deze tijd. </li><li> Breng de nieuwe homogenaat naar een nieuwe buis. </li><li> Centrifugeer de in een vaste hoek rotor bij 750 xg, 4 ° C gedurende 10 min. </li><li> Combineer deze nieuwe supernatanten, die meer mitochondria bevatten, met de eerste supernatant van elk monster. </li><li> Centrifugebuizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Aspireren bovenstaande vloeistoffen en resuspendeer de lever pellets in 500 pi van MIB en het ruggenmerg pellets in 50 pl SC MIB en direct te plaatsen op het ijs. OPMERKING: Mitochondriën zijn in de pellet na deze snelle draai. Mitochondriën zal doorgaans de membraanpotentiaal voor -2-3 ion ijs na isolatie behouden en zijn het meest stabiel als een geconcentreerde voorraadoplossing in MIB. </li><li> Voer een eiwitconcentratie assay schatting van de concentratie van mitochondriën in oplossing. Volg de instructiess voor een handelspraktijk Protein Assay Kit of soortgelijke werkwijze 26. Typische concentraties van mitochondria: 2 T175 flessen levert ~ 2 mg / ml, 1 muizenlever ~ 3-5 mg / ml, en 1 muis ruggenmerg ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> Cytochroom c test met behulp van een R &amp; D-Rat / muis cytochroom c Quantikine ELISA Kit (aangepaste versie van het protocol van de fabrikant). <ol><li> Onmiddellijk voordat de reactie verdund mitochondriën tot 0,5 mg / ml werkconcentratie met EB en distribueren mitochondria verdund in 1,5 ml buisjes voor reacties (typisch 30-50 pl mitochondria per buis). </li><li> Voeg ofwel EB of DMSO, 1% van het totale volume, aan de verdunde mitochondriën en incubeer de reacties op het werkblad 7-10 min. Deze reacties zijn stabiel gedurende 30 min bij kamertemperatuur of een langere termijn nodig. </li><li> Pellet mitochondria door centrifugeren in een vaste hoek rotor bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min en zorgvuldigely scheiden de supernatant en plaats elk in een afzonderlijke 1,5 ml buizen. OPMERKING: buizen kunnen zowel bij -20 ° C ingevroren voor later analyse of direct gebruikt. </li><li> Bepaal afgifte van cytochroom c door een vergelijking van de concentratie van cytochroom c in de pellet en 27 supernatant. <ol><li> Bereid de monsters door oplossen van de pellets in het oorspronkelijke volume van het reactiemengsel met 0,5% Tx-100 in 1x PBS. </li><li> Voor elk monster bereid 2 putten op de ELISA-plaat, een voor de nu opgeloste pellet en een voor de supernatant van de reactie door toevoeging van 100 ui cytochroom c conjugaat (direct uit fles) plus 100 ui 0,5% Tx 100 in 1x PBS, en daarna alle van de pellet of supernatant monster. </li><li> Vortex voorzichtig de plaat een lage stand (niveau 2-4) gedurende 20 seconden om te mengen, deksel en incubeer gedurende 1 uur, 37 ° C. </li><li> Vervolgens was de plaat vier keer met wasbuffer verdund volgens de fabrikanteninstructies er&#39;s. Verwijder eventuele overtollige oplossing door de putten te tikken op keukenpapier. </li><li> Voeg vervolgens 150 ul van 1: 1 A + B ontwikkeloplossing aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 20-30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg tenslotte 50 pl stopoplossing aan elk putje en te absorptiemetingen bij 540 nm met behulp van een microplaat lezer. Bereken de hoeveelheid afgifte van cytochroom c door vergelijking van de hoeveelheid cytochroom c in de pellet versus supernatant per reactie. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Beoordeling van mitochondriale (Dys) functie <ol><li> Onmiddellijk voor reacties opgezet, verdunnen mitochondriën tot 0,5 mg / ml werkconcentratie met EB en geplaatst in 1,5 ml buizen voor reacties (typisch 30-50 gl mitochondriën gebruikt per buis). </li><li> Mitochondriale behandelingen <ol><li> Voeg het juiste behandelingen (EB controle, 1 uM FCCP gemengd met 50 nM Valinomycin, 10 uM rotenone, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN, of 200 uM ADP eindconcentraties) reacties 1/10 scheiden th het totale volume verdund mitochondria. Incubeer de reacties op de bank top voor 7 min. LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van deze stoffen als accidentele inname of opname via de huid schadelijk zou kunnen zijn. </li><li> Verdun TMRE, gereconstitueerd in steriel water bij een werkende concentratie van 100 pM en opgeslagen bij -20 ° C, tot 2 uM en voeg een hoeveelheid equivalent aan het mitochondriale reactievolume. </li><li> Incubeer de reacties op de bank top voor 7 min. </li><li> Pellet mitochondria door centrifugeren in een vaste hoek rotor bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Laad de helft van het volume supernatant van elk monster op een 396-well plaat en lees fluorescentie. OPMERKING: Excitatie en emissie golflengtes van TMRE worden geoptimaliseerd volgens de instructies van de fabrikant met de volume- en plaat die wordt gebruikt voorde assay. Met behulp van een standaard 384-wells zwarte plaat met 25 ul van 1 uM TMRE (laatste reactie concentratie) het sterkste signaal werd verkregen met behulp van excitatie / emissiegolflengtes &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Bereken de vouw-verschil in fluorescentie tussen controle (EB) en elke behandeling door de relatieve fluorescentie-waarde (RFU) verkregen van de plaat-lezer voor de experimentele monster door de RFU van de blanco te verdelen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Madeira, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of mitochondrial bioenergetics.</a> Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).</li>
<li>Sakamuru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+homogenous+membrane+potential+assay+to+assess+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function.</a> Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).</li>
<li>Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial genome.</a> Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).</li>
<li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+import+system+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein import system of mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).</li>
<li>Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import%3A+reversible+binding+of+the+presequence+at+the+trans+side+of+the+outer+membrane+drives+partial+translocation+and+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding.</a> Cell. 80, 127-137 (1995).</li>
<li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+mitochondrial+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of mitochondrial cell death.</a> Science. 305, 626-629 (2004).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Zoratti, M., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).</li>
<li>Wu, C. C., Bratton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+intrinsic+apoptosis+pathway+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).</li>
<li>Kuwana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Joshi, D. C., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+in+live+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons.</a> Journal Of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+I%2C+background+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods.</a> Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).</li>
<li>Vinsant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+pathogenesis+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model+of+ALS%3A+part+II%2C+results+and+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion.</a> Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).</li>
<li>Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intact+mitochondria+from+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain.</a> Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy%3A+targeting+the+mitochondrial+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway.</a> Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+requires+BCL2+to+sequester+prodeath+BIM%2C+explaining+sensitivity+to+BCL2+antagonist+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+dependence+and+ABT-737+sensitivity+in+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 111, 2300-2309 (2008).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibitor+rotenone+induces+apoptosis+through+enhancing+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).</li>
<li>Hynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+drug-induced+mitochondrial+toxicity+using+fluorescence-based+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences+%3A+An+Official+Journal+Of+The+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes.</a> Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).</li>
<li>Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+optical+oxygen+sensing%3A+protocols+and+critical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses.</a> Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+permeabilization+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+An+International+Journal+On+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis.</a> Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li>
<li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death & Disease. 4, e493(2013).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity%3A+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li>
<li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture%3A+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li>
<li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li>
<li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li>
<li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Behandeling van HEK-293T cellen met recombinant cytokinen veroorzaakt matige hoeveelheden van celdood na 48 uur (figuur 1). De hoeveelheid celdood geïnduceerd door TNF-alfa behandeling vergelijkbaar met eerder gerapporteerde studies 30 en cellevensvatbaarheid verlaagt na gelijktijdige toediening van meerdere cytokinen die groter zijn dan samenvattende bedragen bij elk cytokine alleen is ook consistent met de literatuur 31,32. De mogelijkheid om de bedragen en soorten cytokine behan...

Levende cellen bank metabolische energie in de vorm van vetten en koolhydraten en deze energie voor biosynthese membraantransport en beweging. Sommige energie wordt verkregen in de cytosol door omzetting van voeding suikers direct naar ATP tijdens glycolyse. Echter, de belangrijkste bron van ATP productie in een cel benut binnen de mitochondria via de mitochondriale ademhalingsketen 1. De architectuur van mitochondria bepaalt de vereiste ruimtelijke oriëntatie voor een effectieve en efficiënte ATP productie. Mitochondriën hebben een dubbele membraan gescheiden door een intermembrane ruimte en met de matrix, de binnenste mitochondriale compartiment huis de componenten en coördineert de betrokken chemische reacties ATP generatie. De binnenste membraan bevat een reeks membraangebonden eiwit complexen die de ademhalingsketen en het ATP synthase, het eiwitcomplex dat ADP en Pi brengt voor de vorming van ATP omvatten. De herbergER membraan wordt gevouwen in cristae en elektronen worden doorgegeven aan de ademhalingsketen complexen via cytochroom c, een oplosbare elektron drager die zich beweegt tussen complexen binnen de intermembrane ruimte. Als elektronen, oxidatie van reducerende equivalenten optreedt en waterstofionen worden gepompt uit de matrix naar de intermembrane ruimte. Als gevolg van de hoge ionenconcentratie in de intermembrane ruimte, een elektrochemische gradiënt bouwt resulteert in een membraan potentiaal over het binnenste mitochondriale membraan (Δψ) 2. Zuurstof is de uiteindelijke elektronen acceptor van het elektron transport keten en waterstofionen stromen door de ATP synthase van het intermembrane ruimte terug naar de matrix, en in zo direct doen veroorzaken ATP vorming. Deze werkwijze zoals beschreven in zijn geheel heet oxidatieve fosforylering. De plooien van de cristae Vergroot het oppervlak van het binnenste membraan, waardoor maximale elektronentransport en ATP productie inelk mitochondrion. De eiwitten, enzymen en andere moleculen betrokken bij oxidatieve fosforylering zijn afgeleid van nucleair en mitochondriale genen. Mitochondriën bevatten hun eigen circulaire DNA, dat codeert voor 13 eiwitten en tRNA en mRNA noodzakelijk ATP productie 3. Er zijn echter veel meer eiwitten nodig en dus nucleair gecodeerd. De meeste van deze kern gecodeerde eiwitten zijn gericht op de mitochondriale matrix door het gebruik van pre-sequenties aan de N-terminus van de precursor eiwit, en de invoer wordt aangedreven deel door Δψ 4,5. Voorbij bijdragen aan de bio-energetica van een cel mitochondriën beïnvloeden ook belangrijke metabole processen zoals TCA en beta-oxidatie, cellulaire signalering door reguleren calcium, evenals een belangrijke rol in apoptose 6. Specifiek tijden van cellulaire stress, BCL-2 familie eiwitten die zich bevinden op of interactie op de mitochondriale buitenste mitochondriale membraan kan leidenbuitenste membraan permeabiliteit (MOMP) 7,8. Tijdens MOMP, cytochroom c en andere eiwitten vrij in het cytosol, en samen met een aantal cytosolische eiwitten vormen een complex genaamd de Apoptosoom 9,10. De Apoptosoom activeert caspasen die gaan cellulaire proteïnen en DNA klieven in de uitvoeringsfase van apoptose. Zodra MOMP optreedt, ΔΨ ingeklapt en ATP productie stopgezet. Aldus apoptose geïnitieerd mitochondriale functie in gevaar en veranderingen in ΔΨ kunnen worden gecorreleerd aan mitochondriale gezondheid en cellen 12. Terwijl apoptose is een eindpunt in veel ziekte-modellen, de mitochondriale functie en veranderingen aan ΔΨ kan ook waardevolle informatie over de ziekte van herkomst en / of progressie opleveren. Zo hebben mitochondriale structurele en functionele veranderingen gedocumenteerd tijdens neurodegeneratieve ziekten 13,14. In het eerste deel van het protocol, isoning van intacte mitochondriën dat hun ΔΨ behouden wordt beschreven. HEK-293T-cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties en combinaties van recombinant TNF-α, IL1-β en IFN-γ om apoptose te induceren. Deze cytokinen zijn gekozen omdat zij vaak melding hoog in primaire menselijke septische monsters 15 en de extrinsieke apoptose kan worden veroorzaakt door de interactie van TNF-α binding aan zijn receptor 6 zijn. Aangezien er subtiele variaties noodzakelijk functionele mitochondriën geïsoleerd uit primair weefsel in vergelijking met gekweekte cellen en omdat veel onderzoek gebruikt dieren, het protocol beschrijft ook hoe mitochondriën geïsoleerd uit lever en ruggenmerg van anterieure laterale sclerose (ALS) muismodel. Het tweede deel van het protocol ontwikkeld om verstoringen op de mitochondriale membraanpotentiaal te volgen met behulp van een potentiaal gevoelige fluorescente kleurstof met een fluorescente plaatlezer. Verschils cellulaire toestand (dwz gezonde versus ongezonde) worden onderscheiden door het kwantificeren van de sterkte van ΔΨ van geïsoleerde mitochondria in samenhang met ontkoppeling middelen, ademhalingsketen remmers, remmers complex en ionoforen, die alle leiden dissipatie van de mitochondriale membraanpotentiaal. De gezonder de mitochondria, hoe groter de verandering in ΔΨ na behandeling met mitochondriale remmers, dus de reactie van mitochondriën kan worden gebruikt als indicator van mitochondriale (dys) functie. Het gebruik van geïsoleerde mitochondriën plaats in situ evaluatie functie biedt definitieve bewijs dat een pathologie of behandeling direct wijzigingen van de organel 16-18 moduleert. Hoewel er werkwijzen die in de literatuur mitochondriën uit gekweekte cellen te isoleren, die vaag 17 en / of gebruik gespecialiseerde apparatuur 16. Dit protocol beschrijft in detail de isolatiemethode engemakkelijk aan te passen aan andere cellijnen, waaronder primaire weefsel en culturen 13,14,19,20. Veel geïsoleerd mitochondriën studies maken gebruik van dezelfde mitochondriale ontkoppelaars en remmers gebruikt in dit protocol, maar met een Zuurstofelektrode (21 is een representatief voorbeeld van veel kranten in de literatuur), die weer is een zeer specifieke en gespecialiseerde stuk van de apparatuur. Verder heeft deze traditionele werkwijze heeft beperkingen zoals lage capaciteit en hoge complexiteit 22,23 en vereist een aanzienlijke hoeveelheid mitochondria (-500 ug / reactie). In dit protocol wordt het fluorescente membraan sensing potentiële probe TMRE gebruikt in combinatie met een fluorescente plaatlezer, welke een standaard machine in vele laboratoria. TMRE algemeen beschouwd omdat het snel binnenkomt cellen en geïsoleerde mitochondria en kan worden gebruikt bij lage concentraties 24. Meerdere reacties kunnen snel worden opgezet in tandem en batch geanalyseerd met behulp van dit protocol. Verder is de reacties vereisen een veel kleine hoeveelheid geïsoleerde mitochondria (~ 10 ug / reactie). Door te eisen dat minder materiaal, kunnen kleinere weefsel of celkweek monsters worden gebruikt als uitgangspunt voor mitochondriën isolatie, kunnen meer herhalingen of reacties worden opgezet, en potentieel genoeg materiaal voor andere geïsoleerde mitochondriën experimenten zoals ATP productie, zuurstofverbruik, of importeren assays mogelijk.

<table><tbody><tr><td>L-glutaminezuur</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td>Kan het kaliumzout in plaats daarvan gebruiken.</td></tr><tr><td>appelzuur</td><td>Sigma</td><td>M8304</td><td>Kan het kaliumzout in plaats daarvan gebruiken.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Verdun tot 100&nbsp;&#956;M als werkstock in ethanol en bewaar bij -20&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>Valinomycine</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Maak in DMSO en gebruik als een 5&nbsp;&#956;M werkstock. Bewaar bij -20&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Mallinckrodt</td><td>6379</td><td>Maak een geconcentreerde stock in ethanol en verdun vervolgens met water&nbsp;</td></tr><tr><td>rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Zeer giftig. Gemaakt in ethanol.</td></tr><tr><td>oligomycine</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Zeer giftig. Gemaakt in ethanol.</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>Verdun 100&nbsp;&#956;M stock met EB onmiddellijk voor gebruik.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1x normaal (hoge glucose).</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher</td><td>SH3002101</td><td>Bewaar aliquots bij -20&nbsp;&#176;C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td>VS-oorsprong, premium kwaliteit. Verhit inactiveren en bewaar aliquots bij -20&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Protien Assay Dye (5x)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Elke eiwitanalyse kan worden vervangen.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Maak 2 mg/ml stock in water voor eiwitanalyse.</td></tr><tr><td>MTT-poeder</td><td>Sigma</td><td>M2128</td><td>Filter steriele 5 mg/ml stock gemaakt in PBS. Bewaar aliquots bij -20&nbsp;&#176;C; bewaar maximaal 1 week bij 4&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>Tergitol-oplossing (NP-40)</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-1B</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>Bewaar aliquots bij -20&nbsp;&#176;C nadat het eenmaal is geopend</td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-alpha</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-gamma</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Zorg ervoor dat het vrij is van Mg2+ en Ca2+ ionen.</td></tr><tr><td>Cytochroom c ELISA kit</td><td>R&amp;D systems</td><td>DTC0</td><td>Menselijke voor HEK-293T cellen.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolatie en functionele analyse van mitochondriën uit gekweekte cellen en muis tissue

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Vergelijking tussen twee of meer verschillende groepen, zoals gezond versus ziek, is noodzakelijk om de cellulaire status te bepalen. Mitochondriën bevinden zich op het snijvlak van cellulaire gezondheid vanwege hun rol in zowel de celmetabolisme als de energieproductie, evenals de controle van apoptose. Daarom biedt een directe evaluatie van geïsoleerde mitochondriën en mitochondriale verstoring de mogelijkheid om te bepalen of orgaanspecifieke (dys)functie optreedt. De methoden die in dit protocol worden beschreven, omvatten de isolatie van intacte, functionele mitochondriën uit HEK gekweekte cellen en muislever en ruggenmerg, maar kunnen gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere gekweekte cellen of dierlijke weefsels. Mitochondriële functie beoordeeld door TMRE en het gebruik van gebruikelijke mitochondriale ontkoppelers en remmers in combinatie met een fluorescerende platenlector zorgen ervoor dat dit protocol niet alleen veelzijdig en toegankelijk is voor de meeste onderzoekslaboratoria, maar ook hoge doorvoer biedt.

Behandeling van HEK-293T cellen met 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, en 75 ng / ml IFN-γ (* 3) gedurende 24-48 uren resulteert in een progressieve hoeveelheden celdood (Figuur 1A ). Cellevensvatbaarheid werd gemeten met MTT assays en consequent aantoont dat er ~ 10% afname in cellevensvatbaarheid met 24 uur behandeling en ~ 20% afname met 48 uur behandeling. Cellen behandeld met gelijke concentraties (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, en 75 ng / ml IFN-γ) verkregen soortgelijke resultaten celdood...

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Het algemene doel van deze procedure is om ademende mitochondriën te isoleren van gekweekte cellen of muizenweefsel, en vervolgens de sterkte van hun membraanpotentiaal te beoordelen als maatstaf voor de cellulaire status. Voor gekweekte cellen wordt dit bereikt door de cellen eerst te plateren en vervolgens te behandelen. Vervolgens worden de cellen gehomogeniseerd en het homogenaat wordt door een naald geleid om verdere afgifte van mitochondriën uit de cellen te bevorderen.Voor muizenweefsel wordt de lever uit de muis verwijderd en vervolgens gehomogeniseerd op ijs met beide soorten startmateriaal. Differentiële centrifugatie wordt vervolgens gebruikt om mitochondriën te isoleren van de rest van de cellulaire inhoud. Nadat de mitochondriën aan enkele verwerkingen zijn onderworpen, inclusief toevoeging van de membraanpotentiaalgevoelige fluorescente kleurstof, worden TMRE-fluorescentiemetingen uitgevoerd om de sterkte van het membraanpotentiaal te berekenen.Uiteindelijk kan mitochondriale functie en verstoringen in het mitochondriale membraanpotentiaal worden beoordeeld met behulp van een membraanpotentiaalgevoelige fluorescente kleurstof in combinatie met een fluorescente plate reader Wanneer behandeld met gangbare mitochondriale on koppels en remmers, kan deze methode inzicht bieden in door cytokinen geïnduceerde apoptose en mitochondriale disfunctie in een LS. Het kan ook worden toegepast op elk ander systeem waar vergelijking tussen twee of meer verschillende monsters wordt gezocht, zoals gezond versus ziek of twee verschillende soorten dieren met verschillende metabole snelheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Omdat de stappen voor het isoleren van mitochondriën moeilijk te leren zijn.Dit komt omdat er veel nuances zijn bij het uitvoeren van de techniek die in traditionele methode-secties over het hoofd kunnen worden gezien. Begin deze procedure met het kweken van menselijke embryonale niercellen zoals beschreven in het tekstprotocol op 48 uur voorafgaand aan cytokinebehandeling, 160.000 cellen in een T 1 75 fles plateren om ongeveer 70% dichtheid op te leveren op het moment van behandeling. Vervolgens worden de cellen 24 uur later serumhongerig gemaakt door het medium af te zuigen en het te vervangen door hetzelfde volume serumvrij medium.Behandel ten slotte de serumhongerige cellen door de toevoeging van gesolubiliseerde cytokinen direct op het celkweekmedium om isolatie van mitochondriën uit te voeren. Zuig eerst het medium af en was de adhesiecellen twee keer met 15 milliliter van een x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Elke keer na het wassen, zuig het buffer en schraap de fles om de aanhechtende cellen van de bodem te verwijderen.Voeg vervolgens 15 milliliter van een XPBS toe aan elke fles, draai en breng over naar individuele 15 milliliter kegelbuizen op ijs. Zodra het schrabben klaar is, centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 700 keer G vier graden Celsius, met behulp van een tafelcentrifuge met een draaiende emmer rotor. Na centrifugatie, zuig de supernatanten af en breng over. Suspensieer elk pellet in één milliliter mitochondriale isolatiebuffer.Combineer vervolgens beide suspensies en breng over naar een klein glasvat voor homogenisatie bij de mitochondriën gesuspendeerd en mitochondriale isolatiebuffer tot het glasvat tot de oplossing de eerste lijn bereikt. Met de stamper bevestigd aan een boor, ga door met het homogeniseren van de cellen op ijs op gemiddelde snelheid gedurende drie passen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden verwijderd bij het plaatsen van de stamper in de oplossing, niet om de stamper boven het vloeistofoppervlak te verwijderen en om een gestage snelheid te gebruiken met continue passen. Breng de gehomogeniseerde oplossing over naar een 50 milliliter kegelbuis.Trek vervolgens de oplossing in een drie milliliter spuit met een naald van 18 gauge, een en een halve inch en spuit deze terug in de kegelbuis op ijs met een 27 gauge een halve inch naald. Zorg ervoor dat de oplossing tegen de binnenwand van de buis wordt gespoten om die kracht te gebruiken voor celmembraanvernietiging. Herhaal de spuitpassen in totaal vijf keer, breng vervolgens de oplossing over in een 15 milliliter kegelbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 600 keer G vier graden Celsius in een tafelcentrifuge met een draaiende emmer rotor.Mitochondriën bevinden zich in het supernatant na deze eerste laagsnelheidsspin, terwijl sommige membranen en ongebroken cellen gepelleteerd worden, verwijder de supernatant voorzichtig en verdeel onder drie 1,5 milliliterbuizen. Centrifugeer vervolgens de drie buizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 keer G vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Mitochondriën van gekweekte cellen zien er wit uit.Verwijder de lever uit elk dier en plaats een ijskoude, een XPBS zonder calcium of magnesium om eventueel bloed weg te spoelen. Breng het leverweefsel over naar een wegschaal op ijs en snijd het in fijne stukjes met behulp van een nieuw scheermesje gedurende één minuut. Voeg vervolgens weefsel en de juiste buffer toe aan het vat totdat de buffer de eerste lijn bereikt.Ga door met het homogeniseren van het weefsel op ijs met de stamper met de hand gedurende vijf passen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden verwijderd bij het plaatsen van de stamper in de oplossing, niet om de stamper boven het vloeistofoppervlak te verwijderen en om een gestage snelheid te gebruiken met continue passen. Ga door met het verwerken van de monsters met centrifugatie en homogenisatie zoals beschreven in het tekstprotocol.Na het combineren van de nieuwe supernatanten met de eerste supernatant van elk monster, centrifugeer de buizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 keer G vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Zuig voorzichtig de bovenste witte fluffige laag op met behulp van een pipettentip en/of duw deze naar de zijkanten van de buis. Giet vervolgens voorzichtig de rest van het supernatant af en breng over.Suspensieer de levermitochondriënpellets in 500 microliter mitochondriale isolatie. Mitochondriën uit de lever zijn bruin. Plaats de monsters onmiddellijk op ijs voordat reacties worden ingesteld.Verdun de mitochondriën tot

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Beschrijven we een snelle en effectieve methode voor de zuivering van mitochondriën van de...

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop werd aangetoond in deze video opgenomen protocol.

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

Leer mitochondriën isoleren uit gekweekte cellen en muizenweefsel om hun membraanpotentiaal te meten met fluorescentiedye. Deze methode helpt onderzoekers cellulaire gezondheid en stressrespons te evalueren.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Meer video's verkennen