Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Het algemene doel van deze procedure is om ademende mitochondriën te isoleren van gekweekte cellen of muizenweefsel, en vervolgens de sterkte van hun membraanpotentiaal te beoordelen als maatstaf voor de cellulaire status. Voor gekweekte cellen wordt dit bereikt door de cellen eerst te plateren en vervolgens te behandelen. Vervolgens worden de cellen gehomogeniseerd en het homogenaat wordt door een naald geleid om verdere afgifte van mitochondriën uit de cellen te bevorderen.

Voor muizenweefsel wordt de lever uit de muis verwijderd en vervolgens gehomogeniseerd op ijs met beide soorten startmateriaal. Differentiële centrifugatie wordt vervolgens gebruikt om mitochondriën te isoleren van de rest van de cellulaire inhoud. Nadat de mitochondriën aan enkele verwerkingen zijn onderworpen, inclusief toevoeging van de membraanpotentiaalgevoelige fluorescente kleurstof, worden TMRE-fluorescentiemetingen uitgevoerd om de sterkte van het membraanpotentiaal te berekenen.

Uiteindelijk kan mitochondriale functie en verstoringen in het mitochondriale membraanpotentiaal worden beoordeeld met behulp van een membraanpotentiaalgevoelige fluorescente kleurstof in combinatie met een fluorescente plate reader Wanneer behandeld met gangbare mitochondriale on koppels en remmers, kan deze methode inzicht bieden in door cytokinen geïnduceerde apoptose en mitochondriale disfunctie in een LS. Het kan ook worden toegepast op elk ander systeem waar vergelijking tussen twee of meer verschillende monsters wordt gezocht, zoals gezond versus ziek of twee verschillende soorten dieren met verschillende metabole snelheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Omdat de stappen voor het isoleren van mitochondriën moeilijk te leren zijn.

Dit komt omdat er veel nuances zijn bij het uitvoeren van de techniek die in traditionele methode-secties over het hoofd kunnen worden gezien. Begin deze procedure met het kweken van menselijke embryonale niercellen zoals beschreven in het tekstprotocol op 48 uur voorafgaand aan cytokinebehandeling, 160.000 cellen in een T 1 75 fles plateren om ongeveer 70% dichtheid op te leveren op het moment van behandeling. Vervolgens worden de cellen 24 uur later serumhongerig gemaakt door het medium af te zuigen en het te vervangen door hetzelfde volume serumvrij medium.

Behandel ten slotte de serumhongerige cellen door de toevoeging van gesolubiliseerde cytokinen direct op het celkweekmedium om isolatie van mitochondriën uit te voeren. Zuig eerst het medium af en was de adhesiecellen twee keer met 15 milliliter van een x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Elke keer na het wassen, zuig het buffer en schraap de fles om de aanhechtende cellen van de bodem te verwijderen.

Voeg vervolgens 15 milliliter van een XPBS toe aan elke fles, draai en breng over naar individuele 15 milliliter kegelbuizen op ijs. Zodra het schrabben klaar is, centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 700 keer G vier graden Celsius, met behulp van een tafelcentrifuge met een draaiende emmer rotor. Na centrifugatie, zuig de supernatanten af en breng over. Suspensieer elk pellet in één milliliter mitochondriale isolatiebuffer.

Combineer vervolgens beide suspensies en breng over naar een klein glasvat voor homogenisatie bij de mitochondriën gesuspendeerd en mitochondriale isolatiebuffer tot het glasvat tot de oplossing de eerste lijn bereikt. Met de stamper bevestigd aan een boor, ga door met het homogeniseren van de cellen op ijs op gemiddelde snelheid gedurende drie passen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden verwijderd bij het plaatsen van de stamper in de oplossing, niet om de stamper boven het vloeistofoppervlak te verwijderen en om een gestage snelheid te gebruiken met continue passen. Breng de gehomogeniseerde oplossing over naar een 50 milliliter kegelbuis.

Trek vervolgens de oplossing in een drie milliliter spuit met een naald van 18 gauge, een en een halve inch en spuit deze terug in de kegelbuis op ijs met een 27 gauge een halve inch naald. Zorg ervoor dat de oplossing tegen de binnenwand van de buis wordt gespoten om die kracht te gebruiken voor celmembraanvernietiging. Herhaal de spuitpassen in totaal vijf keer, breng vervolgens de oplossing over in een 15 milliliter kegelbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 600 keer G vier graden Celsius in een tafelcentrifuge met een draaiende emmer rotor.

Mitochondriën bevinden zich in het supernatant na deze eerste laagsnelheidsspin, terwijl sommige membranen en ongebroken cellen gepelleteerd worden, verwijder de supernatant voorzichtig en verdeel onder drie 1,5 milliliterbuizen. Centrifugeer vervolgens de drie buizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 keer G vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Mitochondriën van gekweekte cellen zien er wit uit.

Verwijder de lever uit elk dier en plaats een ijskoude, een XPBS zonder calcium of magnesium om eventueel bloed weg te spoelen. Breng het leverweefsel over naar een wegschaal op ijs en snijd het in fijne stukjes met behulp van een nieuw scheermesje gedurende één minuut. Voeg vervolgens weefsel en de juiste buffer toe aan het vat totdat de buffer de eerste lijn bereikt.

Ga door met het homogeniseren van het weefsel op ijs met de stamper met de hand gedurende vijf passen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden verwijderd bij het plaatsen van de stamper in de oplossing, niet om de stamper boven het vloeistofoppervlak te verwijderen en om een gestage snelheid te gebruiken met continue passen. Ga door met het verwerken van de monsters met centrifugatie en homogenisatie zoals beschreven in het tekstprotocol.

Na het combineren van de nieuwe supernatanten met de eerste supernatant van elk monster, centrifugeer de buizen in een vaste hoek rotor bij 10.000 keer G vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Zuig voorzichtig de bovenste witte fluffige laag op met behulp van een pipettentip en/of duw deze naar de zijkanten van de buis. Giet vervolgens voorzichtig de rest van het supernatant af en breng over.

Suspensieer de levermitochondriënpellets in 500 microliter mitochondriale isolatie. Mitochondriën uit de lever zijn bruin. Plaats de monsters onmiddellijk op ijs voordat reacties worden ingesteld.

Verdun de mitochondriën tot