Murine In Utero Electroporatie

In utero elektroporatie is een cruciale techniek voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die de neuro-ontwikkeling sturen. Door DNA te injecteren om de genexpressie in specifieke regio's van de ontwikkelende hersenen van knaagdieren te wijzigen, kunnen onderzoekers de proliferatie, differentiatie, migratie en rijping van neurale cellen bestuderen binnen hun natuurlijke omgeving.

Deze video introduceert de belangrijkste principes achter in utero elektroporatie, een basisoverzicht van hoe de techniek wordt uitgevoerd en de toepassingen ervan in neurobiologisch onderzoek.

Voordat we dieper ingaan op de uitvoering van deze procedure, bespreken we eerst enkele principes van elektroporatie. Bij deze procedure worden elektrische pulsen gebruikt die tijdelijke poriën in celmembranen creëren, waardoor DNA de cel kan binnendringen. Aangezien het negatief geladen DNA naar de positieve elektrode zal bewegen, kunnen verschillende celpopulaties worden getarget, afhankelijk van de positionering van het elektrische veld.

Hoewel elektroporatie traditioneel is gebruikt in in vitro studies, hebben wetenschappelijke vooruitboekingen het gebruik uitgebreid naar intacte organen, inclusief die in muisembryo's die zich in utero ontwikkelen.

In utero elektroporatie heeft, in tegenstelling tot celkweek of ex vivo technieken, het voordeel dat getransfecteerde cellen blootgesteld blijven aan alle fysiologische signalen die de normale ontwikkeling sturen. Dit is bijzonder belangrijk in de hersenen, waar structuren zoals axonen sturingssignalen van andere celtypen nodig hebben om zich correct te ontwikkelen.

De hersenontwikkeling in het bijzonder omvat een geprogrammeerde reeks proliferatie- en migratiegebeurtenissen, wat betekent dat verschillende weefsellagen kunnen worden getarget op basis van het tijdstip van de elektroporatie.

Ten slotte maakt de beschikbaarheid van verschillende typen elektroden het voor onderzoekers mogelijk om zowel regio's nabij het hersenoppervlak als dieper gelegen gebieden te bereiken. Paddle-elektroden worden gebruikt bij het targeten van oppervlakkige delen van de hersenen, zoals de cortex en hippocampus, terwijl kleinere naaldelektroden worden gebruikt bij het targeten van diepe structuren zoals de thalamus en hypothalamus.

Nu we enkele basisprincipes van de techniek hebben besproken, zullen we de voorbereidingen treffen zodat we dieper kunnen ingaan op de chirurgische procedure en in utero elektroporatie.

Steriliseer eerst alle instrumenten en neem het operatiegebied af met 70% ethanol. Maak vervolgens een injectieoplossing door plasmide-DNA op te lossen in steriele PBS die 0,1% Fast Green bevat. Fast Green wordt toegevoegd om de injectieoplossing in het embryo zichtbaar te maken. Gebruik tot slot een naaldtrekker om een ultradunne naald te creëren, zodat het verlies aan vruchtwater en de daaropvolgende foetale mortaliteit worden beperkt.

Nu we alles hebben voorbereid, lopen we de basisstappen door voor het electroporeren van hersenweefsel bij knaagdieren in ontwikkeling. Begin met het anesthetiseren van een drachtige moeder met 5% isofluraan en plaats deze vervolgens in een beademingsbuis die gedurende de gehele procedure 2,25% isofluraan toediend. Dien vervolgens, voor postoperatieve pijnbestrijding, een analgeticum zoals buprenorfine subcutaan toe. Scheer daarna de buik en steriliseer de incisieplaats.

Om de uterus chirurgisch bloot te leggen, wordt een verticale incisie langs de middellijn in de huid gemaakt en wordt met een schaar door het peritoneum gesneden. Om te voorkomen dat de embryo's uitdrogen, wordt de opening bedekt met steriel gaas gedrenkt in zoutoplossing. Trek daarna voorzichtig de embryonale keten uit de buikholte, waarbij u ervoor zorgt dat de embryo's nat blijven door ze te bedekken met steriele, voorverwarmde zoutoplossing.

Identificeer met een dissectiemicroscoop embryo's die gunstig gepositioneerd zijn voor gemakkelijke toegang tot de hersenen. Stabiliseer met de vingers of een pincet de kop van het embryo en injecteer de DNA-oplossing door de uteruswand in de hersenen. Plaats aan elke zijde van de kop een elektrode, waarbij de positieve elektrode in de richting wordt geplaatst waarnaar het DNA geëlectroporeerd moet worden. Zodra alle correct gepositioneerde embryo's zijn geëlectroporeerd, wordt de uterushoorn voorzichtig teruggeplaatst in de buikholte.

Voeg voor het sluiten van de incisie 2 - 3 ml warme zoutoplossing toe aan de holte. Hecht het peritoneum met absorbeerbare hechtdraden en sluit daarna de huid met nietjes. Plaats de muis tot slot in een kooi met een warmtemat en monitor deze.

Nu we hebben besproken hoe in utero electroporatie wordt uitgevoerd, bekijken we enkele downstream-toepassingen van deze techniek.

In utero electroporatie is een nuttig instrument om te onderzoeken hoe specifieke genen bijdragen aan de neurale ontwikkeling. Geëlektroporeerde constructen kunnen de overexpressie van wildtype- of mutante eiwitten sturen of de eiwitexpressie volledig blokkeren. Neurologische fenotypen kunnen vervolgens op microscopisch of organisme-niveau worden beoordeeld. Zo stelden deze experimentatoren vast dat transiënte overexpressie van het met schizofrenie geassocieerde gen DISC-1 in de zich ontwikkelende muizenhersenen leidde tot hypersensitiviteit voor amfetamine op latere leeftijd.

In utero electroporatie kan ook nuttig zijn voor het visualiseren van specifieke celpopulaties en de verbindingen die zij maken, door sequenties die coderen voor fluorescerende eiwitten in neuraal weefsel te brengen. Zo electroporeerden deze experimentatoren het gen voor het groen fluorescerende eiwit in E13.5 retina's om retinale ganglioncellen, of RGC's, te bestuderen, die visuele informatie van het oog naar de hersenen overbrengen. Onderzoek van retina's bij E18.5 laat zien hoe deze techniek kan worden gebruikt om het pad van het RGC-axon door de nervus opticus, het chiasma opticum en het tractus opticus te volgen.

Ten slotte vinden veel belangrijke gebeurtenissen in de neurale ontwikkeling plaats na de geboorte, wat wetenschappers heeft geïnspireerd om een aangepaste techniek te ontwikkelen genaamd in vivo electroporatie. Deze procedure volgt dezelfde basisstappen als in utero electroporatie, maar wordt gewoonlijk uitgevoerd binnen de eerste paar dagen na de geboorte. Postnatale genetische manipulatie is bijzonder nuttig voor het bestuderen van later ontstane celtypen, zoals die gevonden in de hier getoonde bulbus olfactorius.

U heeft zojuist de video van JoVE over in utero electroporatie bekeken. Deze video bevatte de belangrijkste principes en een basisoverzicht van hoe in utero electroporatie wordt uitgevoerd, evenals enkele downstream-toepassingen waarmee onderzoekers de moleculaire mechanismen die de neuro-ontwikkeling sturen kunnen onderzoeken.

Bedankt voor het kijken!