Visualiseren Non-lytische Exocytosis van Cryptococcus neoformans Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is om niet-lytische exocytose van cryptococcus neoformans uit primaire beenmergneuron-macrofagen te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst het beplaten en infecteren van geactiveerde neuro-macrofagen met schimmelcellen om fagocytose en internalisatie van Xeomin mogelijk te maken. De tweede stap is het verwijderen van extracellulaire schimmelcellen om een duidelijke monolaag van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde macrofagen te garanderen.

Vervolgens worden macrofagen 24 uur in een kooldioxide temperatuurgecontroleerde kamer geïncubeerd en gedurende 24 uur geregistreerd om gevallen van niet-lytische exocytose en andere interacties vast te leggen. De laatste stap is het maken van een film door alle frames die in een periode van 24 uur zijn gemaakt, samen te drukken. Uiteindelijk wordt macrofaagvisualisatie met digitale lichtmicroscopie gebruikt om de verscheidenheid aan niet-lytische exocytosetypen die macrofagen gedurende een 24-uurs infectie ondergaan, te observeren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van gastheer-pathogeen interactie, zoals timing en kwantificering van cellulaire gebeurtenissen. Selecteer de dag voorafgaand aan het experiment één individuele senior voormankolonie die is gekweekt op een sbarro agarplaat en inoculeer. 10 milliliter sbarro bouillon. Laat de cultuur een nacht groeien bij 37 graden Celsius, schudden met een snelheid van 250 RPM na euthanasie van muizen zoals beschreven in het geschreven protocol.

Steriliseer het hele lichaam met 70%ethyl alcohol. Verwijder beide femurs en tibia en plaats de botten in steriele duo's, gemodificeerd arendsmiddel of DMEM. Verwijder vervolgens overtollig weefsel en spierweefsel met behulp van delicate doekjes totdat de botten volledig schoon zijn.

Plaats alleen intacte botten in een petrischaal met 70%ethyl alcohol en incubeer gedurende drie minuten om geassocieerde micro-organismen te doden. Verwijder de botten en plaats ze in een petrischaal met steriel DMEM. Snijd vervolgens voorzichtig de uiteinden van de botten af.

Houd het bot boven een MT 50 milliliter conische buis geplaatst op ijs en gebruik een 25 gauge naald om voorzichtig 10 milliliter koude DMEM door elk bot te spoelen. Centrifugeer vervolgens de verzamelde celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 650 keer G. Tijdens deze centrifugatie, bereid en filter steriliseer beenmergmacrofaagvoermedia zoals beschreven in het tekstprotocol. Resuspendeer vervolgens de resulterende palet met 10 milliliter voermedia.

Leid de celsuspensie door een 70 micrometer celzeef om celklompjes te verstoren en groot puin te verwijderen. Plateer vervolgens één milliliter van de gezeefde celsuspensie in 10 milliliter voermedia, petrischalen die zijn gespecificeerd voor gebruik in weefselcultuur. Laat de cellen zeven dagen bij 37 graden Celsius met 10%kooldioxide hechten.

Verander het voermedia zoals beschreven in het tekstprotocol de dag voorafgaand aan het experiment. Los macrofagen los van de plaat door het voermedia te verwijderen en voeg vijf milliliter van een zacht celstripreagens toe aan de plaat na incubatie van de cellen gedurende vijf tot tien minuten. Bij 37 graden Celsius, verwijder de macrofagen met zacht pipetteren.

Pellet de cellen door centrifugatie bij 650 keer G gedurende 10 minuten voordat de pellet wordt gebogen in één milliliter voermedia. Gebruik een verdunning van één op twintig om de concentratie van macrofagen te berekenen door tien microliters van de celsuspensie in een hemo cytometer te pipetten met behulp van 14 millimeter glazenbodem. Plaats een concentratie van één maal tien tot de vijfde macrofagen direct in de binnenste put, die een maximum van 200 microliters bevat.

Zorg ervoor dat u dit volume niet overschrijdt. Laat de cellen hechten aan de glazen petrischaal door de schalen één uur in een 37 graden Celsius incubator te plaatsen. Voeg vervolgens een tot twee milliliter voermedia toe, aangevuld met lipopolysaccharide bij één milligram per milliliter en interferon gamma.

Bij 500 eenheden per milliliter, laat de cellen overnacht incuberen op de dag van het experiment. Verwijder één milliliter van een overnacht geïnoculeerde G-celcultuur en pellet de schimmelcellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 420 keer G. Om media en extracellulaire cryptococcale producten te verwijderen, was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS gevolgd door centrifugatie zoals eerder. Na het opnieuw suspenderen van het schimmelcelpellet in één milliliter steriel PBS en het maken van een verdunning van één op honderd, pipet tien microliters van de verdunning in een hemo cytometer en tel de cellen.

Bereken de concentratie van schimmelcellen die nodig is voor een multipliciteit van infectie van één tot vijf. Voeg het berekende volume cryptococcale celsuspensie toe aan één milliliter voermedia met het monoklonale antilichaam, 18 B zeven bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Incubeer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Verwijder vervolgens het voermedia van de glazen petrischaal en was de macrofagen eenmaal met steriel PBS. Voeg vervolgens 100 microliter opsonize cmin rechtstreeks toe aan de put, gevolgd door incubatie met de schimmel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 10%kooldioxide. Na co-incubatie controleerde door middel van een microscoop dat de macrofagen c eForms hebben geïnternaliseerd om als geïnternaliseerde cryptococcale cellen te worden beschouwd, moeten deze duidelijk te zien zijn binnen de grenzen van de macrofaag, zoals aangegeven door de grote pijlpunt.

De kleinere pijlpunt geeft een niet-geïnfecteerde macrofaag aan zonder schimmelcellen. Was de petrischaal drie keer met steriel PBS om alle extracellulaire c neoformans te verwijderen. Voeg vervolgens één tot twee milliliter voermedia toe zonder het monoklonale antilichaam om deze experimenten uit te voeren.

Een microscoop uitgerust met een aangesloten incubatiekamer die kooldioxidelevering en een verwarmingseenheid omvat, is vereist vóór het experiment. Verwarm de incubatiekamer gedurende ten minste 30 minuten op