Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito Aedes aegypti
30 december 2014
Met twee methodologie om genexpressie in grote smaak aanhangsels van Aedes aegypti, hebben we de set genen vermoedelijk onderliggende neuronale reacties op bitter en afstotende verbindingen geïdentificeerd, zoals bepaald door elektrofysiologische onderzoeken.
Het algemene doel van deze procedure is om de reacties van smaakgevoelige neuronen bij insecten te observeren en de genexpressie in smaakweefsels te meten. Dit wordt bereikt door eerst de reacties van specifieke smaakharen op verschillende smaken bij verschillende concentraties op te nemen. De tweede stap is om de smaakweefsels zorgvuldig te dissekeren.
Scheiden vervolgens de monsters op geslacht en aanhangsel. Isolateer vervolgens het totale RNA uit elk weefselmonster en maak CD NA-voorbereidingen voor next gen sequencing en QPCR. De laatste stap is het analyseren van de genexpressiegegevens en het formuleren van hypothesen, zoals hoe de tot expressie gebrachte chemosensorische genen fysiologische reacties op smaken bij insecten mediëren.
Uiteindelijk worden elektrofysiologische opnames gebruikt om het receptieve bereik van het smaakstelsel van insecten te laten zien en RNA-sequencing van smaakweefsels wordt gebruikt om de belangrijkste genetische componenten van de smaakreceptie te benadrukken. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methoden worstelen vanwege de kleine omvang van insect chemo. Sensorische aanhangsels.
Of het nu gaat om het dissekeren of opnemen van kleine insectenorganen, oefening bij patiënten zijn de sleutels om deze technieken onder de knie te krijgen. Om deze procedure te beginnen, trekt u een dun tip opname-elektrode in een pipettenplukker met een glazen capillair onder de dissectiemicroscoop. Breek voorzichtig de elektrodetip af zodat de opening ervan groot genoeg is om de doelcentum te omhullen, maar klein genoeg om contact met de aangrenzende structuren te vermijden.
Vervolgens verdooft u twee tot vier volwassen insecten in de vriezer bij min 20 graden Celsius gedurende 20 seconden. Daarna immobiliseert u een van de insecten met een dekglas met kleine strookjes cellofaantape. Onder de microscoop.
Identificeer het doelzintuig door zijn morfologie en positie en oriënteer het dier om vrije toegang tot het doelzintuig mogelijk te maken vanuit de hoek van de elektrode-invoer. Plaats vervolgens een tungsteendraad in zijn dorsale thorax. Om als grondelektrode te dienen, vult u de glazen elektrode vanaf de punt met een stimulerende oplossing van belang.
Verwijder de luchtbellen door de punt naar beneden te houden. Plaats een zilverdraad in de elektrode om als opname- en stimulerende elektrode te dienen. Verbind vervolgens de elektroden met een voorversterker, die het verminderen van de settling time mogelijk maakt om neuronale activiteit op te vangen.
De voorversterker is aangesloten op een computer die is uitgerust met spike-opnamesoftware om elektrische signalen te verzamelen, opslaan en analyseren. Stimuleer nu de centum met een controleoplossing om de functionaliteit ervan te garanderen. Tel de spikes beginnend 200 milliseconden na het stimulusartefact.
Om de dosisresponsresultaten te verkrijgen. Stel de centum bloot aan toenemende concentraties van de experimentele chemische stof en laat minimaal drie minuten tussen de stimulaties verstrijken om voldoende herstel te garanderen. Bereid voor deze procedure een ondiepe koeler voor met droog ijs.
Voor de weefselverzamelbuisjes, label de 1,5 milliliter RNA-vrije snap-capbuisjes voor de verzameling van verschillende soorten weefsel. Houd de buisjes gesloten om overtollige condensatie te voorkomen. Verdooft vervolgens 30 tot 40 muggen in de min 20 graden Celsius vriezer gedurende 15 tot 30 seconden.
Breng vervolgens de verdoofde muggen over naar een koude tafel en sorteer ze op geslacht. Draai de insecten met de rug naar beneden door hun vleugels vast te pakken, zorg ervoor dat u de smaakkantjes niet beschadigt. Onder een dissectiemicroscoop, disseker de gepaarde label Bella of tarsi van mannetjes of vrouwtjes door voorzichtig de mug pro Bois vast te pakken net voorbij de label.
Bella met een paar pincetten om de binnenste stylus bloot te leggen en verwijder de label met het andere paar pincetten. Plaats vervolgens het weefsel in de koude verzamelbui voor tarsaalweefsel. Grijp voorzichtig de mugpoot op de overgang van de tibia en het eerste tarsale segment en verwijder de tarsi.
Plaats vervolgens het weefsel in de koude gelabelde buis. Draai de verzamelbui voor één minuut in een centrifuge van nul graden Celsius bij 9.000 keer de zwaartekracht om het weefsel op de bodem van de buis te houden. Als er vocht zich ophoopt in de verzamelbui tijdens de dissectie, voeg dan 50 microliters van koud triol-reagens toe om het verzamelde weefsel te bedekken en te beschermen.
Bevriest de buisjes in de 1,5 milliliterbuisjeshouder met vloeibaar stikstof. Bereid daarna de goed passende RNA-vrije stampers voor door ze af te koelen op droog ijs voordat u het weefsel verpulvert. Maal vervolgens het weefsel tot fijn poeder en herhaal het nog een keer.
Breng het totale volume van triol op één milliliter en resus. Sla het gemalen weefsel op door te vortexen. Voeg vervolgens 200 microliters chloroform toe aan het gemalen weefsel en meng goed.
Na vijf minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer het in de centrifuge bij vier graden Celsius bij 11.000 keer de zwaartekracht gedurende 15 minuten. Voeg voorzichtig de waterige laag direct toe aan een genomische DNA-filterkolom. Centrifugeer het vervolgens bij 11.000 keer de zwaartekracht gedurende vijf minuten.
Voeg een gelijk volume van RNA-vrij 70% ethanol toe aan het flow-through en meng door pipetteren. Breng de vloeistof over naar een RNA-verzamelkolom en vervolg de RNA-extractie. Kwantificeer en beoordeel vervolgens de zuiverheid van het totale RNA op een precisiespectrofotometer en ga verder met een willekeurige standaard RNA-sequencing methode.
De trace-opnames van actiepotentialen van aide's E GTI smaakilla demonstreren de effectiviteit van directe stimulatie met het bereik van chemicaliën. Deze techniek kan worden gebruikt om reacties op elke stimulerende chemische stof te kwantificeren door de spikes van een bepaalde amplitude en duur te tellen over een redelijke tijdsperiode van minder dan 500 milliseconden. Deze drie spikes komen overeen met drie smaakgevoelige neuron subtypen met verschillende gevo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de reacties van gustatoire neuronen in Aedes aegypti op verschillende smaken en meet de genexpressie in gustatoire weefsels. Door middel van elektrofysiologische technieken identificeert het onderzoek genen die geassocieerd zijn met neuronale reacties op bittere en afstotende verbindingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Entomologie
- Genexpressie
Achtergrond
- Het gustatoire systeem bij insecten speelt een cruciale rol bij de smaakperceptie.
- Aedes aegypti dient als modelorganisme voor het bestuderen van sensorische responsen.
- Inzicht in genexpressie kan de mechanismen van smaakperceptie onthullen.
- Elektrofysiologische methoden zijn essentieel voor het meten van neuronale activiteit.
Doel van de studie
- Om de responsen van smaakneuronen op verschillende smaakverbindingen te observeren.
- Om de genexpressie in het smaakweefsel van Aedes aegypti te meten.
- Om hypothesen op te stellen over hoe chemosensorische genen de fysiologische responsen op smaken beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Het registreren van reacties van smaakharen op verschillende smaken bij diverse concentraties.
- Het dissekeren van smaakweefsels en het scheiden van monsters op basis van geslacht en aanhangsel.
- Het isoleren van totaal RNA uit elk weefselmonster.
- Het maken van cDNA-preparaten voor next-generation sequencing en QPCR.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van genen die gerelateerd zijn aan neuronale reacties op bittere verbindingen.
- Inzichten in de genetische basis van smaakperceptie bij Aedes aegypti.
- Data-analyse ondersteunt hypothesen over de functies van chemosensorische genen.
- Elektrofysiologische resultaten correleren met bevindingen uit genexpressie.
Conclusies
- De studie vergroot het begrip van de functie van gustatoire neuronen bij insecten.
- De bevindingen dragen bij aan de bredere kennis van de sensorische biologie.
- Toekomstig onderzoek kan toepassingen in strategieën voor plaagbestrijding verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het begrijpen van de moleculaire basis van chemosensorische perceptie bij ziektevectoren zoals Aedes aegypti maakt doelwitvalidatie mogelijk voor de ontwikkeling van nieuwe repellentia. Elektrofysiologische en transcriptomische profilering van gustatoire weefsels biedt mechanische risicoreductie door genexpressie te koppelen aan gedragsmatige uitkomsten, zoals de verstoring van het zoeken naar een gastheer. Deze geïntegreerde aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij het screenen van verbindingen die interfereren met sensorische paden van muggen, wat bijdraagt aan vroege strategieën voor vectorenbestrijding.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert smaakreceptorneuronen die reageren op DEET en kinine, wat onderzoek naar bitter-senseringspaden in ziektevectoren mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Biedt een gevalideerde fysiologische read-out voor het screenen van verbindingen die chemosensorische neuronen van muggen moduleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: RNA-sequencing van labellar- en tarsi-weefsels onthult expressieprofielen van chemoreceptiegenen, wat de ontwikkeling van assays op basis van biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: qRT-PCR-validatie waarborgt de reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid voor cross-platform vergelijkingen van genexpressie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt de expressie van chemosensorische genen aan de perceptie van repellentia, wat doelgerichte screening mogelijk maakt voor het verstoren van het gastheerzoekend gedrag.
- Operationele waarde: Weefselspecifieke bemonstering (pro-, meso- en metathoracale tarsi) ondersteunt schaalbare, op geslacht gestratificeerde screeningsmodellen.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode verbindt vroege target-identificatie via fenotypische screening met preklinische validatie door neuronale activiteit te koppelen aan moleculaire targets in chemosensorische weefsels.
- Ontdekkingsbiologie: Elektrofysiologische registraties maken hypothesetoetsing mogelijk van de effecten van verbindingen op de vuursnelheid en gevoeligheid van gustatoire neuronen.
- Screening: RNA-seq en qRT-PCR-resultaten bieden gestandaardiseerde, kwantitatieve read-outs van genexpressie voor de beoordeling van target engagement.
- Analytica: Spike-telling en statistische equivalentietoetsing maken vergelijking mogelijk van neuronale responsen en genexpressie over verschillende condities en methoden.
- Translationeel onderzoek: Validatie van chemosensorische genen ondersteunt de afstemming van biomarkers voor het voorspellen van de repellent-effectiviteit in vivo.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: De gecombineerde elektrofysiologie-transcriptomics workflow is herbruikbaar voor verschillende insectensoorten en chemische bibliotheken om risico's bij targets voor vectorbestrijding te verminderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanische risicoreductie van repellent-targets door directe correlatie van neuronale activiteit en genexpressie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor weefseldissectie, RNA-isolatie en elektrofysiologie waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Maakt vroege go/no-go-beslissingen mogelijk over repellent-kandidaten door de target-interactie in relevante chemosensorische weefsels te valideren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risicogecorrigeerde prioritering van verbindingen die specifieke gustatoire receptorpaden moduleren die gekoppeld zijn aan gastheerzoekend gedrag.
Overwegingen bij de implementatie
- Expertise in insectenelectrofysiologie en weefseldissectie onder een microscoop is vereist voor betrouwbare opnamen van smaakharen.
- Toegang tot RNA-vrije apparatuur, centrifuges en spectrofotometrie is noodzakelijk voor hoogwaardige RNA-isolatie uit kleine weefselmonsters.
- Standaardisatie tussen teams vereist consistente sekse-bepaling van weefsels, scheiding van aanhangsels en handelingen in de koudeketen om RNA-degradatie te voorkomen.
- Aanpassing aan andere muggensoorten of weefsels kan optimalisatie van de elektrodeplaatsing en dissectietechnieken vereisen vanwege morfologische variatie.
- Beperkingen in het aantal biologische herhalingen bij RNA-seq als gevolg van weefseltekort kunnen worden opgevangen door qRT-PCR-validatie van belangrijke targets, zoals aangetoond in de studie.
