Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Het doel van het volgende experiment is om HS P 1 0 4-bibliotheken te screenen voor de selectie van varianten die de toxiciteit van de eiwitten die geassocieerd zijn met eiwitmisvouwenstoornissen onderdrukken. Dit wordt bereikt door HSP 1 0 4-variantbibliotheken samen met een ziekte-geassocieerd substraat in gist te co-transformeren en in een tweede stap de twee eiwitten gezamenlijk te laten tot expressie komen. De geselecteerde gisten worden behandeld met vijf Fluor utic acid of vijf FOA om de HSP 1 0 4-plasmiden tegen te selecteren.

Vervolgens worden de hits gesequenced door de mutageenregio te versterken door middel van kolonie-PCR of door de mutaties in het HSP 1 0 4-gen te identificeren. Uiteindelijk kan de onderdrukking van de toxiciteit van het ziekte-geassocieerd substraat worden geëvalueerd om de HS P 1 0 4-varianten te identificeren die het meest veelbelovend zijn voor verdere karakterisering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals binding-gebaseerde selecties, is dat deze techniek toelaat om varianten te selecteren die de toxiciteit van het ziekte-geassocieerd substraat onderdrukken.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van eiwitvouwen te beantwoorden door de eiwitten te identificeren die eiwitmisvouwen kunnen omkeren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de potentiëring van HS P 1 0 4, kan deze ook worden toegepast op het screenen van bibliotheken van elk eiwit voor de onderdrukking van toxiciteit van elk substraat dat toxisch is in gist. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat er mogelijk veel kolonies moeten worden gescreend om geldige hits te vinden. Om te screenen op onderdrukking van proteatoxiciteit begint men door HSP 1 0 4-kolonies van de platen te wassen met raffinose-aangevuld dropout-medium, een serologische pipet en steriele houten applicators, en de vloeibare wassingen over te brengen naar een 50 milliliter kegelbuis en de kolonies grondig te vortexen om eventuele celklonters te scheiden.

Verduidelijk vervolgens de celsuspensie tot een licht troebele cultuur en laat de cellen een nacht groeien in Raffinose-dropout-medium met schudden bij 30 graden Celsius. Laat ook de HSP 1 0 4-wildtype en vectorcontroles parallel groeien op dit moment. De volgende ochtend wordt een reeks celconcentraties op individuele galactoseplaten geplaat om minstens één plaat per groep met enkele kolonies te genereren.

Normaliseer de vector- en HSP 1 0 4-wereldtypeculturen naar de OD 600 van de bibliotheek en plaat. Gelijke volumes van deze cellen naar de experimentele stamconcentraties om de groei van de bibliotheek relatief ten opzichte van de controles te vergelijken om de selectie te beoordelen. Plateer ook de bibliotheek op glucoseremmend medium en bebroed vervolgens alle platen gedurende twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius totdat er kolonies verschijnen om vijf FOA te gebruiken voor de selectie van de cellen die geen HSP 1 0 4-expresserende plasmiden meer bevatten. Streek vervolgens de enkele kolonies van elke stam in duplicaat uit op dubbele en enkele dropout-mediumplaten per overnachting bij 30 graden Celsius.

Deze platen zullen later worden gebruikt voor sequencing om te voorkomen dat de platen uitdrogen. Wikkel de SD hiss Euro-platen in parafilm en installeer ze bij vier graden Celsius tijdens het uitvoeren van de vijf FOA-screening. Streek vervolgens de kolonies van de SD hiss-platen naar enkele kolonies op vijf FOA-platen voor een incubatie van een tot twee dagen bij 30 graden Celsius totdat enkele kolonies verschijnen.Volgende.

Selecteer van elke vijf FOA-plaat en streken. Drie overlevende kolonies op één SD Euro en één SD his-plaat per overlevende kolonie na nog eens een tot twee dagen incubatie bij 30 graden Celsius. De kolonies die het HSP 1 0 4-plasmide zijn kwijtgeraakt, zullen groeien op SD hiss-platen, maar niet op SD Euro-platen.

Laat deze stammen tot verzadiging groeien in raffinose-dropout-medium in 96 diepe twee milliliter platen overnacht bij 30 graden Celsius met schudden. Voer vervolgens een spotting-assay uit om eventuele valse positieven te elimineren.

Dicht bij het einde van de incubatie is een multikanaals pipetter om 200 microliter raffinose-dropout-medium per put in een nieuwe 96-well plate te pipetteren, waarbij kolom één en zeven worden gereserveerd voor de schone culturen. Pipet vervolgens 250 microliter van elk van de 16 verzadigde culturen in kolom één en zeven van de plaat en verdun de culturen serieel vijfvoudig in elke kolom van de plaat, grondig mengen met de multikanaals pipetter. Vervolgens om gelijkmatige spotting te garanderen, verwijder 50 microliter van de verdunde cultuur uit kolom zes en twaalf om te zorgen dat het eindvolume van elk put 200 microliter is.

Gebruik vervolgens een 96-volt replicatortool om de culturen in duplicaat op SD hiss en escal hiss platen te spotten. Na een incubatie van twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius, selecteer voor de sequencingstammen die toxiciteit vertonen op de escal hiss-platen. Net zoals bij de controles kunnen valse positieve stammen, die niet zo toxisch zijn als de controles, worden weggegooid.

Gooi ook stammen weg die een groefdefekt vertonen op de sd. His-platen of die substantieel grotere toxiciteit vertonen dan het ziektesubstraat alleen. Om de HSP 1 0 4-varianten door middel van kolonie-PCR te sequencen, schraap eerst ongeveer 10 microliter gist van de SD hiss Euro-platen in drie microliter 20 milli natriumhydroxide in PCR-gestreepte buisjes om de cellen te lyseren door middel van vries-dooi.

Plaats eerst de strips in een min 80 graden Celsius vriezer. Na 10 minuten in de vriezer, incubeer de buisjes 10 minuten bij 99 graden Celsius in de thermocycler en verdun vervolgens de stammen tot 100 microliter met PCR-kwaliteitswater met een hoge primerconcentratie. Voer vervolgens een standaard PCR-programma uit op de monsters en analyseer vervolgens de monsters door middel van agelele elektroforese om de amplificatie van een PCR-product van de juiste grootte te bevestigen.

Sequenciëer ten slotte de PCR-producten en