Name: Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer hoe je Hsp104-varianten isoleert die toxiciteit onderdrukken in gistmodellen voor eiwitmisfoldingstoornissen. Deze methode gebruikt co-transformatie en 5-FOA-selectie om veelbelovende kandidaten te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Sue Lindquist, Aaron Gitler en Martin Duennwald voor het vriendelijk delen van reagentia. Onze studies werden ondersteund door: een American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH-grants R21NS067354, R21HD074510 en R01GM099836, een Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research aan Johns Hopkins University, Target ALS en een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S).

1. Bibliotheek Generation <ol><li> Om bibliotheken van Hsp104 behulp domeinspecifieke fouten gevoelige PCR construeren, eerst het domein van belang met een foutgevoelige DNA polymerase 20 versterken. </li><li> Zuiver het PCR product door gel extractie. </li><li> Voer een megaprimer extensie stap met een standaard plaatsgerichte mutagenese protocol: combineer 50 ng matrijs plasmide, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP&#39;s, en high-fidelity DNA polymerase in PCR buffer, en verdun tot 50 ui totaal volume met PCR kwaliteit water 20 . Voer een standaard PCR-programma. OPMERKING: Specifieke primers zal variëren gebaseerd op de specifieke regio van het gen dat moet worden geamplificeerd. <ol><li> Na PCR, verteren ouderlijke matrijs DNA met 1 pi Dpn I restriction enzyme 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Transformeer de bibliotheek door elektroporatie of andere middelen in ultracompetente E. coli en zuiveren door miniprep. OPMERKING: Bibliotheek generatievarieert in hoofdzaak gebaseerd op de doelen van een bepaald experiment. Hsp104 is een zeer grote eiwitten, dus het is niet praktisch om de hele gen, dat is waarom we gebruik maken van domeinspecifieke fouten gevoelige PCR willekeurig. Bovendien blijft de structuur van Hsp104 slecht begrepen, die het ontwerp van gerichte bibliotheken uitdagende 21. Bibliotheken kunnen worden geconstrueerd onder toepassing gerichte of willekeurige mutagenese benaderingen, met als enige beperking dat het template plasmideskelet de URA3 gen om voor 5-FOA tegenselectie op dextrose media moeten bevatten. </li></ol> 2. Transformatie van de Hsp104 Bibliotheek <ol><li> Integreer de ziekte-geassocieerde substraat in W303aΔ Hsp104 gist met een standaard lithium acetaat / PEG transformatieprotocol 22. Selecteer enkele kolonies en screenen voor toxiciteit voor een stam met een hoge toxiciteit van de ziekte geassocieerde substraat 23 te isoleren. OPMERKING: Gebruik een geïntegreerd rek en isolaTé één kolonie op gelijke meningsuiting te waarborgen in alle cellen. Kloon de ziekte substraat in een plasmide die integratie van het gen onder andere omstandigheden dan uracil marker (we gebruiken histidine) en de Hsp104 bibliotheek in de pAG416GAL plasmide (uracil marker) 24. Om voor 5-FOA counterselection, ervoor zorgen dat de bibliotheek wordt uitgedrukt vanuit een plasmide met de uracil marker. Andere giststammen kunnen worden toegepast. We hebben nota genomen van een soortgelijke toxiciteit onderdrukking fenotype behulp W303a en BY4741 giststammen in zowel WT en Δ Hsp104 achtergronden (MEJ en JS, ongepubliceerde waarnemingen). </li><li> Transformeer de Hsp104 bibliotheek in deze stam met dezelfde lithiumacetaat / PEG transformatieprotocol 22. Schaal van de transformatie behoren tot de volgnummers van de bibliotheek behouden en de voorspelde bibliotheek formaat behouden. </li><li> Plate de transformatie mengsel op noninducing, selectieve platen (bijvoorbeeld SD-His-Ura) met genoeg borden omzorgen groei van een groot aantal kolonies. Gebruik grote petrischalen (150 mm) naar het aantal platen nodig minimaliseren. Herstellen transformanten behulp platen maakt een transformatie-efficiëntie worden beoordeeld. </li><li> Transformeer Hsp104 WT en vector negatieve controles in parallel. </li></ol> 3. Screening voor Onderdrukking van Proteotoxicity <ol><li> Was de kolonies van de platen met behulp van raffinosesynthetase aangevuld dropout media (bijvoorbeeld sraff-His-Ura). Gebruik een serologische pipet en steriele houten applicators naar de koloniën los te maken van de platen. Breng de vloeistof wast in een 50 ml conische buis en vortex grondig om eventuele klonten van cellen te scheiden. Verdun tot een licht bewolkt cultuur, OD 600 ~ 0.025. LET OP: Hier raffinose- dient om te verlichten de cellen van glucose-gemedieerde repressie van inductie, waardoor het vullen van de cellen voor-galactose gemedieerde inductie. </li><li> Groeien de verdunde cultuur overnachting in raffinose uitval media schudden bij 30 ºC. Groeien de Hsp104 WT en vector controles in parallel. </li><li> De volgende ochtend plaat een reeks concentraties op afzonderlijke galactose (bv SGal-His-Ura) platen (1 pi tot 2 ml geconcentreerd kweek in 400 ui totaal volume). Plating een breed bereik van concentraties zorgt dat een plaat enkele kolonies hebben. De feitelijke concentratie vereist hangt af van de toxiciteit van de ziekte substraat van belang. </li><li> Normaliseren van de vector en Hsp104 WT culturen de OD 600 van de bibliotheek en de plaat gelijke volumes groei van de bibliotheek ten opzichte van de controle te vergelijken. </li><li> Om selectie strengheid te beoordelen, het bord van de bibliotheek op glucose (onderdrukken) media. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 ° C tot kolonies verschijnen (figuur 2). Beoordeel de resulterende kolonies en te vergelijken met de controles. OPMERKING: vaak grote en kleine kolonies verkregen, maar geen correlatie tussen koloniegrootte en handelentiviteit wordt waargenomen. Scherm deze mogelijke treffers met een 5-FOA tegenselectie techniek (stap 4) om valse positieven naar sequencing uitgevoerd minimaliseren. </li></ol> 4. 5-FOA Counterselection en Spotting om valse meldingen te elimineren <ol><li> Streak uit enkele kolonies in tweevoud op dubbele en enkele dropout media (bijvoorbeeld SD-Zijn-Ura en SD-Zijn platen) en groeien &#39;s nachts bij 30 ºC. Herhaal dit met vector en Hsp104 WT controles. Uitplaten op SD-His vóór 5-FOA verhoogt de efficiëntie van de 5-FOA stap verhogen de waarschijnlijkheid dat cellen het plasmide Hsp104 zullen verloren wanneer ze worden uitgeplaat op 5-FOA. </li><li> Om platen niet uitdrogen, wikkel de SD-Zijn-Ura platen in parafilm en bewaar bij 4 ºC tijdens het uitvoeren van het scherm 5-FOA. Deze platen zullen uiteindelijk worden gebruikt voor sequencing. </li><li> Streak de kolonies van de SD-His platen enkele kolonies op 5-FOA platen (YPD medium + 1 g / l 5-FOA) en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 &amp;# 186; C tot enkele kolonies verschijnen. Hier, 5-FOA wordt omgezet in een toxisch product (5-fluordeoxyuridine) in cellen die de URA3 gen bevatten. Derhalve zal alle cellen nog huisvesten de Hsp104 plasmide sterven. </li><li> Streak de enkele kolonies van de 5-FOA platen in tweevoud op SD-Ura en SD-Zijn platen. Test 3 kolonies per raken om de waarschijnlijkheid dat ten minste één kolonie voor elke slag de Hsp104 plasmide zal verloren toenemen. Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Kolonies die de Hsp104 plasmide zal groeien op SD-Zijn platen maar niet SD-Ura platen hebben verloren. </li><li> Groeien de stammen die de Hsp104 plasmiden voor het spotten van assays hebben verloren. Groeien de stammen tot verzadiging in raffinose dropout media (bv sraff-Zijn) in 96 Deepwell 2 ml platen overnacht bij 30 ºC met schudden. Zorg ervoor dat de 5-FOA behandelde controle stammen omvatten. </li><li> Bereid platen voor spotten assay. Met behulp van een multichannel pipet, aliquot 200 ul raffinose dropout media (bijvoorbeeld sraff-His) perputje van een plaat met 96 putjes, reserveren kolommen 1 en 7 voor de nette kweken. Aliquot 250 ui van elk van de 16 verzadigde kweken in kolommen 1 en 7 van de plaat. </li><li> Serieel verdunnen culturen 5 maal in elke kolom van de plaat grondig mengen met een multichannel pipet. Verwijderen 50 ul van de verdunde kweek van de kolommen 6 en 12 tot het eindvolume van elk putje 200 pl waarborgen. Dit is essentieel om ervoor te zorgen zelfs spotten. </li><li> Met behulp van een 96-bout replicator gereedschap (Frogger), ter plaatse van de culturen in tweevoud op SD-Zijn en SGal-Zijn platen. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. </li><li> Selecteer voor sequencing stammen die toxiciteit vertonen op de SGal-His platen vergelijkbaar met die van de controles. Gooi als false positives stammen die niet zo giftig als de controles. 5-FOA is vaak giftig op zich, zodat gooi stammen die een groei defect bij SD-His platen of vertonen die aanzienlijk groter toxiciteit vertonen dan de ziekte substraat alleen ( <strong&gt; Figuur 3). </li></ol> 5. Sequencing de Hsp104 Varianten door Kolonie PCR <ol><li> Schraap ~ 10 ul gist van de SD-His-Ura platen in 3 pl 20 mM NaOH in PCR strip buizen en lyseren de cellen door vries-dooi. Plaats de strip buizen in een -80 ° C vriezer gedurende 10 minuten of in vloeibare stikstof en vervolgens incuberen bij 99 ° C in een thermocycler gedurende 10 min. Verdun de stammen tot 100 ul met PCR kwaliteit water. </li><li> Bereid PCR-reacties: 5 pi PCR sjabloon, 0,5 pi 100 uM van elke primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA polymerase in PCR-buffer, en vul aan tot 25 ul totaal volume met PCR kwaliteit water. Ontwerp primers aan de gerandomiseerde regio plus ongeveer 100 bp aan beide zijden versterken. Minimaliseren van de grootte van het geamplificeerde gebied om de kans op succesvolle amplificatie te verhogen. Voer een standaard PCR-programma. </li><li> Analyseer de monsters door agarose gelelektroforese om amplificatie van een PCR-product van de juiste Siz bevestigene. Herhaal PCR als er geen product aanwezig is. OPMERKING: PCR mislukking is meestal te wijten aan te veel gist wordt gebruikt in stap 5.1. </li><li> Bereiden monsters voor DNA sequentiebepaling. Verwijderen PCR primers hetzij door PCR zuivering of met een PCR product schoonmaakbeurt reagens zoals exonuclease I en Garnalen alkalische fosfatase enzym (ExoSAP-IT) enkelstrengs DNA afbreken. Dit reagens enzymatisch degradeert zonder rechtspersoonlijkheid primers en dNTPs, zodat een hogere doorvoersnelheid. </li><li> Sequentie van de PCR producten. Zorg ervoor dat u grondig te analyseren sequencing chromatogrammen voor mutaties. Mutaties kunnen worden waargenomen als een mengsel van twee nucleotiden op een bepaalde plaats (figuur 4), gist vaak meerdere plasmiden herbergen. </li></ol>

<ol><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases%3A+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+aging%2C+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+reveal+a+%27druggable%27+Rsp5%2FNedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li>
<li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein%2C+alpha-synuclein%2C+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%3A+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li>
<li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li>
<li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li>
<li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittrup%2C+KD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoeke%2C+JD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).</li>
<li>Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazaki%2C+K+%22eds+FrancesH+Arnold+%26+George+Georgiou%22">eds FrancesH Arnold & George Georgiou</a>. 231, Humana Press. 23-28 (2003).</li>
<li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+machines+for+protein+folding%2C+unfolding+and+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%C2%AE+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we onze benadering isoleren gepotentieerd Hsp104 varianten die de toxiciteit van ziekte- geassocieerde substraten met gist proteïnopathie modellen onderdrukken. Met deze benadering kunnen grote bibliotheken van varianten worden gescreend in high throughput, met als enige beperking dat het aantal varianten dat het secundaire scherm 5-FOA passen. Door deze stappen in 96 putjes, routinematig screenen we tot 200 treffers tegelijk in de 5-FOA stappen in de loop van 1-2 weken. Het aantal hits verkregen bij de...

Gist proteïnopathie modellen ontwikkeld voor eiwit misfolding aandoeningen zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS) en de ziekte (PD) 1-3 Parkinson. Expressie van de eiwitten TDP-43 en FUS, die misfold bij ALS-patiënten, zijn giftig en mislocalize om cytoplasmatische aggregaten in gist 1,2. Evenzo expressie van α-synucleïne (α-syn), die betrokken is bij PD, giftig en mislocalizes cytoplasmatische aggregaten in gist 3. Deze functies recapituleren fenotypen bij patiënten met deze aandoeningen 4,5. Zo gistmodellen een nuttig platform voor het screenen voor eiwitten of kleine moleculen die voorkomen of reverse deze fenotypes 2,6-13. We geïnteresseerd in de ontwikkeling van eiwitten die in staat omkeren aggregatie en toxiciteit door TDP-43, FUS en α-syn zijn. Wij richten ons op Hsp104, een AAA + eiwit uit gist die uniek is in staat disaggregerende eiwitten zowel frOM amorfe aggregaten en amyloid in gist, maar het heeft geen menselijke homoloog 14,15. Hsp104 is volledig afgestemd op endogene gist prionen disaggregeren en heeft slechts een beperkte capaciteit om substraten betrokken bij de menselijke neurodegeneratieve ziekten, die het nooit normaal tegenkomt 16,17 disaggregeren. Zo streven we naar verbeterde versies van Hsp104 die in staat zijn om krachtdadig disaggregeren deze menselijke substraten zijn ingenieur. Om dit te doen, bouwen we grote bibliotheken van Hsp104 varianten met behulp van fouten gevoelige PCR; Deze bibliotheken kunnen worden gescreend met de gist proteïnopathie modellen 17. We hebben een op een domein gerichte aanpak van de bouw en het screenen van bibliotheken aangenomen, als Hsp104 is zeer groot 17. We richtte zich op de middelste domein (MD) van Hsp104 17, hoewel soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om andere domeinen screenen. Deze modellen stellen screening disaggregase activiteit direct tegenover alternatieve technieken zoals oppervlakte vertoning, die rustricted te gebruiken voor het bewaken binding 18. Ons protocol is gebaseerd op twee stappen screening (figuur 1). Eerst, Hsp104 varianten die de toxiciteit van de ziekte substraat in gist onderdrukken geselecteerd. Om dit te doen, de Hsp104 varianten en de ziekte-geassocieerde substraat worden gecotransformeerd in Δ Hsp104 gist. We maken gebruik van Δ Hsp104 gist Hsp104 sequence ruimte verkennen in de afwezigheid van wild-type (WT) Hsp104 17. Belangrijk is, betekent verwijdering van Hsp104 geen invloed op α-syn, FUS, of TDP-43 toxiciteit in gist, en expressie van Hsp104 WT geeft minimaal rescue 1,13,17. De gist wordt daarna uitgeplaat op media induceren van expressie van beide eiwitten te induceren. Gist herbergen Hsp104 varianten die toxiciteit van de ziekte-geassocieerde substraat conferentiedeelnemers groei van de kolonie te onderdrukken. Deze varianten worden geselecteerd voor verdere analyse, terwijl kolonies behoud varianten die geen toxiciteit sterven onderdrukken. Echter,valse positieven zijn een substantieel probleem in dit scherm. Expressie van TDP-43, FUS en α-syn zeer giftig, die een sterke selectieve druk voor het optreden van spontane genetische suppressors van toxiciteit verbonden aan de Hsp104 variant gemaakt worden uitgedrukt. Aldus hebben we een tweede scherm dat relatief hoge doorzet deze niet-specifieke toxiciteit suppressors 17 elimineren gebruikt. In dit tweede scherm, worden geselecteerd gist behandeld met 5-Fluorootic Acid (5-FOA) selecteren voor de Hsp104 plasmide 19 tegen te gaan. De stammen worden vervolgens beoordeeld op het substraat (TDP-43, FUS of α-syn) toxiciteit via spotten assay dat de toxiciteit van het substraat is hersteld na verlies van de Hsp104 plasmide. Zo gist waarbij toxiciteit wordt hersteld in de secundaire screening vermoedelijk oorspronkelijk weergegeven toxiciteit onderdrukking door de aanwezigheid van de Hsp104 variant. Deze gist zijn aangewezen als &#39;hits&#39; en de Hsp104 plasmide moet danhersteld en gesequenced om de mutaties in het gen Hsp104 17 (figuur 1) geeft. Eventuele treffers dan bevestigd door het construeren van de mutatie onafhankelijk Via plaatsgerichte mutagenese en vervolgens opnieuw testen op toxiciteit onderdrukking. De mogelijke toepassingen voor dit protocol zijn breed. Met deze methoden kunnen bibliotheken van elk type proteïne worden gescreend op varianten die toxiciteit van substraat eiwit dat giftig in gist onderdrukken.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri schotels</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootzuur</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Platen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isoleren versterkt hsp104 varianten met behulp gist proteïnopathie modellen

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Veel eiwitmisvouwingaandoeningen kunnen worden gemodelleerd in de knopgistachtige Saccharomyces cerevisiae. Eiwitten zoals TDP-43 en FUS, geïmpliceerd in amyotrofe laterale sclerose, en α-synucleïne, geïmpliceerd in de ziekte van Parkinson, zijn toxisch en vormen cytoplasmatische aggregaten in gist. Deze kenmerken herhalen eiwitpathologieën die worden waargenomen bij patiënten met deze aandoeningen. Daarom zijn gisten een ideale platform voor het isoleren van toxiciteitssuppressoren uit bibliotheken van eiwitvarianten. We zijn geïnteresseerd in het toepassen van eiwitdisaggregases om misgevouwen toxische eiwitconformers te elimineren. Specifiek zijn we bezig met het ontwerpen van Hsp104, een hexameer AAA+ eiwit uit gist dat uniek in staat is om zowel ongeordende aggregaten als amyloïde stoffen op te lossen en de eiwitten terug te brengen naar hun native conformatie. Hoewel Hsp104 sterk geconserveerd is in eukaryoten en eubacteriën, heeft het geen bekende metazoan-homoloog. Hsp104 heeft slechts beperkte capaciteit om ongeordende aggregaten en amyloïde vezels, geïmpliceerd in menselijke ziekte, te elimineren. Daarom streven we ernaar Hsp104-varianten te ontwerpen om de eiwitmisvouwing geïmpliceerd in neurodegeneratieve aandoeningen om te keren. We hebben methoden ontwikkeld om grote bibliotheken van Hsp104-varianten te screenen op onderdrukking van proteotoxiciteit in gist. Aangezien gist vatbaar is voor spontane niet-specifieke onderdrukking van toxiciteit, is een tweedelige screeningsprocedure ontwikkeld om valse positieven te elimineren. Met behulp van deze methoden hebben we een reeks gepotentieerde Hsp104-varianten geïdentificeerd die de toxiciteit en aggregatie van TDP-43, FUS en α-synucleïne krachtig onderdrukken. Hier beschrijven we dit geoptimaliseerde protocol, dat kan worden aangepast om bibliotheken te screenen die zijn geconstrueerd met behulp van om het even welke eiwitbackbone voor onderdrukking van toxiciteit van om het even welke eiwit die toxisch is in gist.

We hebben een bibliotheek van Hsp104 varianten gerandomiseerd in het midden domein geconstrueerd en gescreend is voor onderdrukking van TDP-43 toxiciteit. De bibliotheek werd getransformeerd en uitgeplaat op glucose en galactose platen (figuur 2) om de stringentie van het scherm beoordelen. Enkele kolonies werden geselecteerd en de stammen werden geselecteerd teller met 5-FOA de Hsp104 plasmide elimineren. Deze stammen werden vervolgens beoordeeld dat citeit was door TDP-43 alleen, zonder Hsp104 variant...

Gist-eiwitopathiemodellen zijn waardevolle instrumenten om de toxiciteit en aggregatie van eiwitten die betrokken zijn bij ziekten te beoordelen. Hier presenteren we methoden voor het screenen van Hsp104 variantenbibliotheken op toxiciteitsonderdrukkers. Dit protocol kan worden aangepast om elke eiwitbibliotheek te screenen op toxiciteitsonderdrukkers van elk eiwit dat toxisch is in gist.

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Het doel van het volgende experiment is om HS P 1 0 4-bibliotheken te screenen voor de selectie van varianten die de toxiciteit van de eiwitten die geassocieerd zijn met eiwitmisvouwenstoornissen onderdrukken. Dit wordt bereikt door HSP 1 0 4-variantbibliotheken samen met een ziekte-geassocieerd substraat in gist te co-transformeren en in een tweede stap de twee eiwitten gezamenlijk te laten tot expressie komen. De geselecteerde gisten worden behandeld met vijf Fluor utic acid of vijf FOA om de HSP 1 0 4-plasmiden tegen te selecteren.Vervolgens worden de hits gesequenced door de mutageenregio te versterken door middel van kolonie-PCR of door de mutaties in het HSP 1 0 4-gen te identificeren. Uiteindelijk kan de onderdrukking van de toxiciteit van het ziekte-geassocieerd substraat worden geëvalueerd om de HS P 1 0 4-varianten te identificeren die het meest veelbelovend zijn voor verdere karakterisering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals binding-gebaseerde selecties, is dat deze techniek toelaat om varianten te selecteren die de toxiciteit van het ziekte-geassocieerd substraat onderdrukken.Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van eiwitvouwen te beantwoorden door de eiwitten te identificeren die eiwitmisvouwen kunnen omkeren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de potentiëring van HS P 1 0 4, kan deze ook worden toegepast op het screenen van bibliotheken van elk eiwit voor de onderdrukking van toxiciteit van elk substraat dat toxisch is in gist. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat er mogelijk veel kolonies moeten worden gescreend om geldige hits te vinden. Om te screenen op onderdrukking van proteatoxiciteit begint men door HSP 1 0 4-kolonies van de platen te wassen met raffinose-aangevuld dropout-medium, een serologische pipet en steriele houten applicators, en de vloeibare wassingen over te brengen naar een 50 milliliter kegelbuis en de kolonies grondig te vortexen om eventuele celklonters te scheiden.Verduidelijk vervolgens de celsuspensie tot een licht troebele cultuur en laat de cellen een nacht groeien in Raffinose-dropout-medium met schudden bij 30 graden Celsius. Laat ook de HSP 1 0 4-wildtype en vectorcontroles parallel groeien op dit moment. De volgende ochtend wordt een reeks celconcentraties op individuele galactoseplaten geplaat om minstens één plaat per groep met enkele kolonies te genereren.Normaliseer de vector- en HSP 1 0 4-wereldtypeculturen naar de OD 600 van de bibliotheek en plaat. Gelijke volumes van deze cellen naar de experimentele stamconcentraties om de groei van de bibliotheek relatief ten opzichte van de controles te vergelijken om de selectie te beoordelen. Plateer ook de bibliotheek op glucoseremmend medium en bebroed vervolgens alle platen gedurende twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius totdat er kolonies verschijnen om vijf FOA te gebruiken voor de selectie van de cellen die geen HSP 1 0 4-expresserende plasmiden meer bevatten. Streek vervolgens de enkele kolonies van elke stam in duplicaat uit op dubbele en enkele dropout-mediumplaten per overnachting bij 30 graden Celsius.Deze platen zullen later worden gebruikt voor sequencing om te voorkomen dat de platen uitdrogen. Wikkel de SD hiss Euro-platen in parafilm en installeer ze bij vier graden Celsius tijdens het uitvoeren van de vijf FOA-screening. Streek vervolgens de kolonies van de SD hiss-platen naar enkele kolonies op vijf FOA-platen voor een incubatie van een tot twee dagen bij 30 graden Celsius totdat enkele kolonies verschijnen.Volgende.Selecteer van elke vijf FOA-plaat en streken. Drie overlevende kolonies op één SD Euro en één SD his-plaat per overlevende kolonie na nog eens een tot twee dagen incubatie bij 30 graden Celsius. De kolonies die het HSP 1 0 4-plasmide zijn kwijtgeraakt, zullen groeien op SD hiss-platen, maar niet op SD Euro-platen.Laat deze stammen tot verzadiging groeien in raffinose-dropout-medium in 96 diepe twee milliliter platen overnacht bij 30 graden Celsius met schudden. Voer vervolgens een spotting-assay uit om eventuele valse positieven te elimineren.Dicht bij het einde van de incubatie is een multikanaals pipetter om 200 microliter raffinose-dropout-medium per put in een nieuwe 96-well plate te pipetteren, waarbij kolom één en zeven worden gereserveerd voor de schone culturen. Pipet vervolgens 250 microliter van elk van de 16 verzadigde culturen in kolom één en zeven van de plaat en verdun de culturen serieel vijfvoudig in elke kolom van de plaat, grondig mengen met de multikanaals pipetter. Vervolgens om gelijkmatige spotting te garanderen, verwijder 50 microliter van de verdunde cultuur uit kolom zes en twaalf om te zorgen dat het eindvolume van elk put 200 microliter is.Gebruik vervolgens een 96-volt replicatortool om de culturen in duplicaat op SD hiss en escal hiss platen te spotten. Na een incubatie van twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius, selecteer voor de sequencingstammen die toxiciteit vertonen op de escal hiss-platen. Net zoals bij de controles kunnen valse positieve stammen, die niet zo toxisch zijn als de controles, worden weggegooid.Gooi ook stammen weg die een groefdefekt vertonen op de sd. His-platen of die substantieel grotere toxiciteit vertonen dan het ziektesubstraat alleen. Om de HSP 1 0 4-varianten door middel van kolonie-PCR te sequencen, schraap eerst ongeveer 10 microliter gist van de SD hiss Euro-platen in drie microliter 20 milli natriumhydroxide in PCR-gestreepte buisjes om de cellen te lyseren door middel van vries-dooi.Plaats eerst de strips in een min 80 graden Celsius vriezer. Na 10 minuten in de vriezer, incubeer de buisjes 10 minuten bij 99 graden Celsius in de thermocycler en verdun vervolgens de stammen tot 100 microliter met PCR-kwaliteitswater met een hoge primerconcentratie. Voer vervolgens een standaard PCR-programma uit op de monsters en analyseer vervolgens de monsters door middel van agelele elektroforese om de amplificatie van een PCR-product van de juiste grootte te bevestigen.Sequenciëer ten slotte de PCR-producten en

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering...

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Dit manuscript beschrijft drie aanvullende protocollen voor de beoordeling van de toxiciteit van polyglutamine (polyQ)-uitbreiding van eiwitten in de...

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Dit protocol beschrijft experimentele procedures karakteriseren van genoom-brede veranderingen in de niveaus van Histon posttranslationele modificaties (PTM) die zich voordoen in verband met de overexpressie van eiwitten ALS en Parkinson in zijn gekoppeld Saccharomyces cerevisiae modellen. Na SDS-pagina de scheiding, worden individuele Histon PTM niveaus gedetecteerd met wijziging-specifieke antilichamen via het westelijke bevlekken.

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Leer hoe je Hsp104-varianten isoleert die toxiciteit onderdrukken in gistmodellen voor eiwitmisfoldingstoornissen. Deze methode gebruikt co-transformatie en 5-FOA-selectie om veelbelovende kandidaten te identificeren.

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Meer video's verkennen