Explantcultuur van neuraal weefsel

Explantculturen dienen als techniek om de ontwikkeling van specifieke celpopulaties en neurale structuren te onderzoeken. In experimenten binnen de ontwikkelingsneurowetenschappen zijn explantaten neurale weefsels die uit een embryo zijn weggesneden voor verdere ontwikkeling in vitro. Deze culturen stellen onderzoekers in staat om ontwikkelende weefsels te manipuleren en te visualiseren op manieren die in vivo niet mogelijk zijn. Deze video introduceert enkele belangrijke principes bij het werken met geëxplanteerde weefsels, stapsgewijze procedures voor twee benaderingen van explantcultuur, evenals toepassingen van deze techniek.

Voordat we dieper ingaan op de methoden, bespreken we enkele basisprincipes. Explantaten kunnen worden verkregen uit verschillende modelorganismen en diverse weefseltypen. Over het algemeen worden de culturen gecreëerd door neuronaal weefsel zorgvuldig uit een embryo te verwijderen, een regio van belang telydissecteren en deze in een kunstmatige omgeving te plaatsen.

Weefsels kunnen ook in dunne plakjes worden gesneden en worden gekweekt in een "slice culture". Omdat de kweekomgeving is ontworpen om de in vivo condities van het gehele orgaan na te bootsen, wordt deze kweekstrategie vaak "organotypisch" genoemd.

Steriliseer vóór aanvang uw instrumenten met 70% ethanol. Eutanaseer vervolgens een drachtige muis volgens de voorkeursmethode van uw laboratorium. Exciteer daarna chirurgisch de uterus en plaats deze in een ijskoude buffer. Verplaats de schaal naar een dissectiemicroscoop en verwijder de individuele embryo's uit hun dooierzak. Isoleer vervolgens de hersenen, disseceer zorgvuldig de gewenste regio en breng deze over naar een kweekschaal met kweekmedium. Explantaten kunnen enkele weken worden onderhouden in een incubator van 37 °C met 5% CO2 door elke 2 - 3 dagen 50% van het medium te vervangen.

Kleefcultuur van hersenweefsel vereist enkele extra stappen. Voor het doorsnijden wordt het weefsel ingebed in agarose, wat ondersteuning biedt zodat het weefsel intact blijft tijdens het snijden. Hiervoor wordt een 1,5% agarose-oplossing met een laag smeltpunt verhit tot de agarose is opgelost. Vervolgens wordt de agarose overgebracht naar inbeddingsvormen en lichtjes afgekoeld om beschadiging van het weefsel te voorkomen.

Het weefsel kan vervolgens voorzichtig worden ondergedompeld, waarna de agarose kan uitharden. De resulterende blokken worden bijgesneden, op een preparaat houder gelijmd en gesneden met een vibratoom, een instrument dat een trillend mes gebruikt om dunne plakjes levend weefsel te snijden. Zodra de plakjes zijn verkregen, worden ze voorzichtig overgebracht naar een gecoate plaat met cultuurmedium en gekweekt zoals eerder beschreven.

Het gebruik van explantaatkweken biedt een aantal voordelen ten opzichte van in vivo en andere in vitro methoden. Ten eerste zijn cellen in geëxplanteerde weefsels toegankelijker voor experimentele instrumenten. Ten tweede betekent het feit dat explantaten de complexe cellulaire architectuur van ontwikkelend neuraal weefsel behouden, dat cel-celinteracties bestudeerd kunnen worden. Ten derde kunnen wetenschappers, omdat zij de chemische samenstelling van het kweekmedium kunnen beheersen, explantaten gebruiken om het effect van specifieke verbindingen op de weefselontwikkeling te testen.

Desalniettemin moet er, aangezien het weefsel uit zijn natuurlijke omgeving wordt verwijderd, speciale zorg worden betracht om het weefsel in vitro in goede en gezonde conditie te houden. Zo heeft de aanwezigheid van de extracellulaire matrix, of ECM, een aanzienlijke invloed op het celgedrag, waardoor gezuiverde ECM-proteïnen vaak worden gebruikt om kweekschalen te coaten. Een andere belangrijke overweging is de oplossing waarin de explantaten worden ondergedompeld. Hoewel vaak traditionele celkweekmedia worden gebruikt, vereisen sommige experimenten oplossingen die sterk lijken op de vloeistof die in het centrale zenuwstelsel circuleert: het cerebrospinaalvloeistof, wat een cruciaal reagens is in experimenten zoals die u nu gaat zien.

Nu we de methoden voor explantaatcultuur hebben besproken, bekijken we hoe deze technieken worden toegepast.

Celmigratie-assays maken gebruik van geëxplanteerde weefsels om de afstotende en aantrekkende signalen te onderzoeken die betrokken zijn bij de beweging van neurale cellen. In dit experiment worden beads, die vooraf zijn geweekt in groeifactoren, geïmplanteerd in explantaten van de ruitenhersenen om de neurale celmigratie te bestuderen. Na 3 - 4 dagen blootstelling werden de neuronen in beeld gebracht met een confocale microscoop. De resultaten tonen aan dat motorneuronen migreren naar beads die zijn geweekt in vascular endothelial growth factor, maar niet naar controlebeads die zijn geweekt in buffer.

Co-cultuur-assays worden vaak gebruikt om cel-celinteracties tijdens de ontwikkeling te onderzoeken. In dit voorbeeld werden segmenten van het ruggenmerg gekweekt op een laag spiercellen om te bestuderen hoe verbindingen ontstaan tussen spinale motorneuronen en skeletspieren. Al 2 dagen na incubatie zijn er uitlopers van de neuronen, ook wel neurieten genoemd, te zien die uit het explantaat groeien. Binnen 5 dagen wordt functionele innervatie waargenomen door de contractie van de spiercellaag.

Tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel moeten neuronen hun axonen verlengen om een verbinding tot stand te brengen tussen het doelweefsel en het centrale zenuwstelsel. Een manier om dit complexe proces te bestuderen is via axongeleidings-assays. Onderzoekers gebruiken geëxplanteerde weefsels om de factoren binnen de neuronen en in de omringende omgeving te onderzoeken die helpen het axon naar de juiste locatie te leiden.

U heeft zojuist de JoVE-handleiding voor explantaatcultuur van neuraal weefsel bekeken. Deze video bood een overzicht van de voordelen van explantaatculturen, cultuurstrategieën, stapsgewijze protocollen van twee veelgebruikte explantaatprocedures en de manieren waarop deze technieken tegenwoordig in het laboratorium worden toegepast.

Bedankt voor het kijken!