Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing
18 november 2014
MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om microRNA's onpartijdig voor te bereiden voor high throughput sequencing. Dit wordt bereikt door eerst DNA-oligonucleotiden te bereiden of aan te schaffen die competent zijn voor ligatie aan het drie-prime-uiteinde van het micro RNA. De tweede stap is om het drie-prime DNA-oligonucleotide te lijmen aan het drie-prime-uiteinde van het micro RNA.
Vervolgens wordt het ligatieproduct gepurificeerd op een gel en wordt de vijf-prime RNA-oligonucleotide-linker gebonden aan het vijf-prime-uiteinde van het micro RNA. De laatste stap is om de hybride moleculen om te zetten in CDNA en vervolgens het CDNA te versterken door polymerasekettingreactie. Uiteindelijk worden micro RNA-klonen en high throughput sequencing gebruikt om het transcriptoom-brede profiel van microRNA's te tonen op een kwantitatieve manier met een resolutie van individuele nucleotiden.
Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals microsequencing microray qPCR blot, is dat onze techniek beter reflecteert van het werkelijke niveau van microray op een transcriptbreed lab-schaal bij een resolutie van een enkele nucleotide. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de biologie van microRNA, kan het ook worden toegepast op andere high throughput sequencing technologieën zoals HC clip en RNA-Seq. De DNA-oligonucleotiden voor deze procedure zijn ontworpen voor drie-prime ligatiereacties en moeten een vijf-prime fosfaatgroep hebben, een gerandomiseerde dinucleotide aan het vijf-prime-uiteinde en een drie-prime cytosine. Verdun de DNA-oligonucleotiden tot 100 micromolar in nuclease-vrij water.
Assembleer de ventilatieractie door deze reagentia samen te brengen: 200 picomol van de drie-prime linker-oligonucleotide, vier microliter vijf-prime DNAA ventilatiebuffer, vier microliter TP, vier microliter M-T-H-R-N-A, ligase en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 40 microliter. Incubeer de reactie gedurende één uur bij 65 graden Celsius. Beëindig de reactie door gedurende vijf minuten op 85 graden Celsius te verwarmen.
Precipiteer de TED-linker door 2,5 volumes 100% ethanol en een derde volume 10 molar ammoniumacetaat toe te voegen. Om resterende TP te verwijderen en onverwachte ligaties in toekomstige reacties te voorkomen, meng de alcohol, zout en oligonucleotide-oplossing tot homogeniteit door 20 minuten bij volle snelheid te draaien in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Was het pellet in 70% ethanol, laat het drogen en suspendeer het pellet in het juiste volume nuclease-vrij water om 50 tot 100 micromolar van een geventileerde oligonucleotide te verkrijgen.
Bevestig een ventilatie van de oligonucleotide door middel van elektroforese op een 18% polyacrylamidegel. Laat de gel 30 minuten pre-runnen bij 24 volt per centimeter gelbreedte met één XTBE-runbuffer bij kamertemperatuur. Zodra de 30 minuten voorbij zijn, spoel de putjes met running buffer.
De DNA-oligonucleotiden voor deze procedure zijn ontworpen voor drie-prime ligatiereacties en moeten een vijf-prime fosfaatgroep hebben, een gerandomiseerde dinucleotide aan het vijf-prime-uiteinde en een drie-prime oxytocine. Verdun de DNA-oligonucleotiden tot 100 micromolar in nuclease-vrij water. Laat de gel lopen bij 24 volt per centimeter totdat het broomfenolblauw driekwart van de weg naar de onderkant van de gelpost is.
Kleur de gel met één x cyber goud-oplossing in één XTBE en visualiseer op een UV-transluminatorbox. Er zou een enkele nucleotideverschuiving moeten zijn in de grootte van de DNA-oligonucleotide die werd onderworpen aan een ventilatie door M-T-H-R-N-A ligase voor de drie-prime ligatiereactie. Assembleer de volgende componenten op ijs in deze volgorde.
Eén microliter van 50% PEG 8, 000 0,5 microliters van 10 XRNA ligasebuffer. Eén microliter van een geventileerde drie-prime linker, 0,5 microliters RNA-remmer 0,5 tot acht microgram totaal RNA 0,5 microliters van T vier RNA Ligase twee en nuclease-vrij water tot een eindvolume van vijf microliters. Meng de reactie door één keer grondig te pipetteren.
Plaats de reactie in een thermische cycler met een verwarmd deksel. Stel de blok in op 16 graden Celsius en incubeer gedurende vier uur. Merk op dat de reactie kan worden opgeschaald tot een eindvolume van 20 microliter zonder enig verlies in ligatie-efficiëntie.
Na de drie-prime ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van twee XRNA laadbuffer, verhit tot 70 graden Celsius gedurende vijf minuten en snel afkoelen op ijs. Volgend gel. Zuiver het monster op een 15% polyacrylamidegel.
Laat de gel vooraf lopen bij 24 volt per centimeter gelbreedte gedurende minimaal 30 minuten. Schakel de voeding uit en spoel de putjes met running buffer. Laad het monster en laat de gel lopen bij dezelfde spanning als de voorafgaande draai totdat het broomfenolblauw net de gel heeft verlaten.
Het gewenste product zal dicht bij de xyleencyan migreren wanneer de polyacrylamidegelelektroforese voltooid is. Plaats de gel in een schone lade met één x running buffer en één x cyber goud en schudden gedurende 15 minuten. Verwijder de gel uit de kleuringsbak en visualiseer op een UV-transluminatorbox bedekt met schone plasticfolie.
Het ligatieproduct moet ongeveer 45 nucleotiden lang zijn. Aangezien dit ligatieproduct meestal niet zichtbaar is, is het belangrijk om een positieve controle synthetisch RNA-monster in het aangrenzende kanaal op te nemen door met een schone scheermesje het gebied met het ligatieproduct uit te snijden. Geleid door de posities van het synthetische RNA-monster en de maatstaven.
Plaats het uitgesneden gelfragment in een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter. Prik de bodem van het microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter met een naald van 30 gauge en plaats het prikbuisje in een tweede schone lage retentie, 1,5 milliliter microcentrifugebuisje centrifugeer gedurende vijf minuten bij ongeveer 15.000 keer. G. Visueel bevestig dat de hele gelplak door het gat in de binnenbuis is bewogen.
Gebruik indien nodig een schone pipettip om enkele gelfragmenten dichter bij het gat te duwen. Gooi de lege buis van 0,5 milliliter weg en voeg 400 microliter hoog zout kolombuffer toe aan de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het klonen van microRNA's (miRNA's), waarbij gebruik wordt gemaakt van twee ligatiestappen gevolgd door high-throughput sequencing. Deze aanpak maakt een nauwkeurige genoombrede kwantificering van miRNA's mogelijk, wat inzicht geeft in hun regulatoire rollen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- MicroRNA-onderzoek
- Genomische technieken
- High-throughput sequencing
Achtergrond
- MicroRNA's zijn cruciale regulerende moleculen in diverse biologische processen.
- Nauwkeurige kwantificatie van miRNA's is essentieel voor het begrijpen van hun functies.
- High-throughput sequencing maakt een uitgebreide analyse van miRNA-profielen mogelijk.
- De beschreven methode is erop gericht de efficiëntie van miRNA-klonering te verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een robuuste methode voor het kloneren van miRNA's.
- Het mogelijk maken van genoombrede kwantificering van miRNA's.
- Het faciliteren van de studie naar de rollen van miRNA in genregulatie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van DNA-oligonucleotiden voor ligatie aan miRNA's.
- Ligatie van een 3'-DNA-oligonucleotide aan het 3'-uiteinde van miRNA's.
- Gelzuivering van het ligatieproduct.
- Ligatie van een 5'-RNA-oligonucleotide-linker aan het 5'-uiteinde van miRNA's.
- Conversie van hybride moleculen naar cDNA en amplificatie via PCR.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een onbevooroordeelde preparatie van miRNA's voor sequencing mogelijk.
- Het biedt een transcriptome-breed profiel van miRNA's.
- Kwantitatieve analyse wordt bereikt met een resolutie op individueel nucleotide-niveau.
Conclusies
- Deze kloneermethode bevordert de bestudering van miRNA-functies.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor high-throughput sequencing van miRNA's.
- De techniek kan bijdragen aan breder onderzoek naar genregulatie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige microRNA-kwantificering is essentieel voor targetvalidatie en de ontdekking van biomarkers bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze hoogefficiënte ligatiemethode vermindert technische bias in miR-Seq, waardoor betrouwbare transcriptoombrede profilering van complexe biologische monsters mogelijk is. Door ligatie-efficiënties van meer dan 95% en read-counts binnen een factor twee van de verwachte waarden te bereiken, ondersteunt deze methode het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door onbevooroordeelde miRNA-expressieprofielen te leveren.
- Operationele waarde: Vermindert vals-positieven/negatieven bij doelwitidentificatie door nauwkeurige kwantificering.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door reproduceerbare miRNA-biomarkergegevens te leveren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde miRNA-bibliotheken die geschikt zijn voor high-throughput sequencing-platforms.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay via efficiënte en consistente adapterligatie.
- Schaalbaarheid: Compatibel met synthetische miRNA spike-ins voor assay-kalibratie en kwaliteitscontrole.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt nauwkeurige genoombrede miRNA-profilering mogelijk vanuit in vivo totale RNA-monsters.
- Mechanistische Risicoreductie: Verbindt veranderingen in miRNA-expressie aan fenotypische uitkomsten met kwantitatieve precisie.
- Afstemming van Preklinische Modellen: Maakt vergelijking van miRNA tussen verschillende soorten mogelijk met behulp van een methode waarbij bias tot een minimum is beperkt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesegeneratie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder wanneer miRNA-gemedieerde mechanismen worden onderzocht.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt targetvalidatie door de betrokkenheid van miRNA-paden in ziektemodellen te verduidelijken.
- Screening: Produceert sequencing-klare libraries met kwantitatieve getrouwheid voor de beoordeling van het effect van verbindingen.
- Analytiek: Levert read-outs met nucleotide-resolutie die nauwkeurige berekeningen van de fold-change mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met in vivo miRNA-expressieprofielen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar protocol voor library prep voor longitudinale miRNA-studies.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van de selectie van miRNA-targets door ligatiebias te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie van de workflow door middel van hoogefficiënte, schaalbare ligatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door technische variabiliteit in biomarkergegevens te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk op basis van betrouwbare miRNA-expressiesignaturen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in RNA-handling en het optimaliseren van ligatie.
- Afhankelijk van toegang tot thermocyclers, gelelektroforese en systemen voor de zuivering van nucleïnezuren.
- Vereist een gestandaardiseerd oligonucleotide-ontwerp met een 5′-fosfaat en een gerandomiseerd dinucleotide.
- Omvat coördinatie tussen teams van de afdelingen moleculaire biologie en bio-informatica.
- Beperkt door de kwaliteit en kwantiteit van de RNA-input, in het bijzonder bij zeldzame of gedegradeerde monsters.
