Name: Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Leer een efficiënte ligatiemethode voor microRNA-kwantificering via high-throughput sequencing. Deze techniek maakt transcriptoombrede profilering mogelijk met nucleotide-resolutie voor genregulatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de leden van het Yi-laboratorium bedanken, met name Zhaojie Zhang voor de vruchtbare discussies over linkerontwerp en ligatie-efficiëntie, evenals de American Cancer Society voor het ondersteunen van dit werk via een postdoctorale beurs (#125209) aan J.E.L. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ook ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health onder Award Number R01AR059697 (aan R.Y.) en een onderzoekssubsidie van het Linda Crnic Institute for Down Syndrome. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

LET OP: Het is cruciaal om RNase vrije omstandigheden te handhaven gedurende de gehele procedure. 1. adenylatie van 3 &quot;Linker <ol><li> Verdun DNA-oligonucleotide ontworpen om 3 &#39;ligatiereacties 100 uM in nuclease-vrij H2O Opmerking: Het oligonucleotide moet 5 &#39;fosfaatgroep, een gerandomiseerde dinucleotide aan het 5&#39; uiteinde en een 3 &#39;dideoxycytosine hebben. De 5 &#39;fosfaatgroep is een vereiste van de Mth enzym efficiënt 5&#39; adenylatie 10. Het fosfaat kan worden toegevoegd door voorbehandeling van het oligonucleotide met een polynucleotide kinase of besteld met de modificatie direct. De gerandomiseerde dinucleotide aan het 5 &#39;is belangrijk voor het minimaliseren van de sequentie die RNA ligasen voorkeur vertonen voor bepaalde end-end verbinden reacties over anderen 6. De 3 &#39;dideoxycytosine plaatst een blokkeerelement op het 3&#39; uiteinde van het oligonucleotide to remmen de vorming van linker-linker concatameren tijdens volgende ligatiestappen en dient ook om het 3 &#39;uiteinde van het miRNA-Linker molecuul gevormd aan het einde van de 3&#39; ligatiereactie 11 blokkeren. De oligonucleotide linkersequentie gekozen voor onpartijdige miR-Seq is als volgt: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. </li><li> Monteer de volgende reactie adenylatie: 200 pmol 3 &#39;linker oligonucleotide, 4 pi 10 x 5&#39; DNA adenylatie buffer, 4 pi 1 mM ATP, 4 pl Mth RNA ligase, nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 40 pi. </li><li> Incubeer reactie bij 65 ° C gedurende 1 uur. Beëindig de reactie door verwarmen tot 85 ° C gedurende 5 min. </li><li> Precipiteren geadenyleerde linker door toevoeging van 2,5 volumes 100% ethanol en 1/3 volume 10 M ammoniumacetaat resterende ATP te verwijderen en onverwachte ligaties voortaan reacties te voorkomen. <ol><li> Kort, meng de alcohol, zout en oligo oplossing tot homogeen, draaien op volle snelheid in een microcentrifuge (~ 15.000 xg) bij 4 ° C gedurende 20 min. Was de pellet in 70% ethanol, lucht drogen, en resuspendeer in de juiste hoeveelheid nuclease-vrij H2O 50-100 uM geadenyleerde oligo opleveren. </li></ol></li><li> Bevestig adenylerings door uitvoeren van 18% polyacrylamidegel. <ol><li> Bereid de gel door menging van de volgende: 6,3 g ureum, 6,75 ml van 40% acrylamide en 1,5 ml van 10x TBE. H Voeg 2 O tot 15 ml. </li><li> Meng tot ureum volledig is opgelost en voeg 150 pl 10% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS) en 15 pl tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Zodra gel heeft ingesteld, pre-run voor 30 min bij 24 V / cm gel breedte met 1x TBE lopende buffer bij kamertemperatuur. Zodra 30 min is up flush waterputten met stromend buffer. </li><li> Meng 5 pmol van geadenyleerde oligonucleotiden met en gelijk volume 2x denaturerende RNA laadbuffer (95% (v / v) formamide,0,02% (w / v) SDS, 0,02% broomfenolblauw (w / v), 0,01% (w / v) xyleencyanol, 1,0 mM EDTA), warmte kort naar 75 ° C en snap gekoeld op ijs. Pipetteer gehele monster in de put van de gel. Ook een identieke hoeveelheid niet-geadenyleerde controle en lage moleculair gewicht standaarden grootte. </li><li> Voer de gel bij 24 V / cm tot de broomfenolblauw is ¾ van de weg naar de bodem van de gel. Demonteer apparaten, post-vlek gel met 1x SYBR-goud oplossing in 1x TBE en visualiseren op UV-transilluminator doos (Figuur 2). OPMERKING: Gel zuiveren geadenyleerde oligo op een wijze overeenkomstig aan die boven beschreven als &quot;geen invoer RNA&quot; controle resulteren in een grote hoeveelheid PCR-product vergeleken met monsters met input RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker Ligatie 3 &#39;einde van miRNA <ol><li> 3 &quot;Ligatie <ol><li> Monteer de volgende componenten op ijs in de genoemde volgorde: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x RNA ligase buffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 pl geadenyleerd 3&#39;Linker (100 uM), 0,5 ui RNase inhibitor, 0.5-8.0 ug totaal RNA, 0,5 pl T4 RNA ligase 2, nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 5 ul. </li><li> Meng de reactie door pipetteren de oplossing te viskeus om vortex vanwege de hoge concentratie van PEG 8000. Na grondig gemengd, zet de reactie in een thermocycler met een verwarmd deksel. Stel het blok tot 16 ° C en incubeer gedurende 4 uur. OPMERKING: De reactie kan worden opgeschaald tot een eindvolume van 20 pl zonder verlies van ligatie efficiëntie. Reageren gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in wezen identieke ligatie efficiëntie opleveren. </li></ol></li><li> Gel Purification <ol><li> Na 3 &#39;ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van 2x RNA laadbuffer. Verwarm tot 70 ° C gedurende 5 min, en snap afkoelen op ijs. </li&gt; <li> Laat het monster op een 15% polyacrylamide gel voor PAGE zuivering. <ol><li> Bereid een 15% polyacrylamide gel die 7 M ureum, in een zelfde wijze als eerder beschreven in stap 1.5. </li><li> Voorlooptijd de gel bij 24 V / cm gel breedte ten minste 30 min. Schakel de stroomvoorziening, flush putten, load monster en run gel op dezelfde spanning als pre-run. </li><li> Laad het monster en draaien de PAGE totdat de broomfenolblauw net heeft verlaten de gel. Het gewenste product migreert nabij de xyleencyanol. </li></ol></li></ol></li><li> Vlekken, Visualisatie, en Excisie <ol><li> Demonteer gel apparaten en plaats gel in een schone bak met 1x lopende buffer (TBE), 1x SYBR-goud, en rock voor 15 min. </li><li> Verwijder gel tegen vlekken schotel en visualiseren op UV transilluminator doos bedekt met schone plastic wrap. Het ligatieproduct moet ongeveer 45 nucleotiden lang. </li><li> Accijnzen het gebied dat de ligatieproduct met een schone Razor mes en plaats in 0,5 ml micro-centrifugebuis. </li></ol></li><li> Product Isolatie en neerslag <ol><li> Pierce bodem van 0,5 ml microcentrifugebuis met een 30 G naald en zet de doorboorde buis in een tweede schone, lage retentie, 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij ~ 15.000 x g. </li><li> Visueel bevestigen dat de gehele gel slice is verplaatst door het gat in de binnenband. Gebruik indien nodig een schone pipet tip om wat gelfragmenten dichter bij het gat te duwen. </li><li> Gooi de lege buis van 0,5 ml en voeg 400 ul hoge zoutconcentratie kolom buffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) aan de acrylamide slurry. Rock tube (s) bij 4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Transfer slurry naar een 0,22 micron celluloseacetaat spin-kolom met een wide-bore pipet tip. Centrifugeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur ~ 15.000 xg verzamelen alle vloeistof verwijderd van acrylamide gel matrix. </li><li> Breng de vloeistof aan een schone, lage retentie, 1,5 ml tube bevattening 1 ui van 20 mg / ml glycogeen. Voeg een gelijk volume isopropanol en 1/10 volume natriumacetaat. Meng de oplossing door het buisje meerdere malen en neerslaan in -80 ° C vriezer gedurende 20 minuten. </li><li> Centrifugeer bij volle snelheid bij 4 ° C gedurende 20 min aan het nucleïnezuur pellet. Verwijder supernatant en was in 70% ethanol. Drogen pellet gedurende 10 min bij kamertemperatuur en direct verder naar 5 &#39;ligatiestap. </li></ol></li></ol> 3. Linker Ligatie tot 5 &#39;einde van miRNA-3&#39; Linker Hybrid <ol><li> Om pellets nucleïnezuur, voeg de volgende componenten: 2 pl PEG 8000 (50% w / v), 0,5 gl 10x RNA Ligase buffer, 0,5 ul ATP (10 mM) 0,5 pl NN-RNA oligo (100 uM) en H 2 O tot een eindvolume van 4 pl. OPMERKING: De samenstelling van de &quot;NN-RNA- oligo &#39;is als volgt 5&#39;-geïnverteerde dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 en werd via HPLC gezuiverd door de fabrikant. </li><li> Vermengendit monster door pipetteren en herhaaldelijk naar beneden. Doe dit enige tijd (tot 5 min) dat de pellet is volledig opnieuw opgelost. Als opnieuw oplosbaar is problematisch, verwarmen het monster kort (3-5 min) tot 37 ° C en opnieuw pipetteren te mengen. </li><li> Nadat de pellet terug in oplossing, breng de inhoud ervan een schone PCR buis die 1 ui van een 1: 1 mengsel van RNase inhibitor en T4 RNA-ligase 1 (5 eenheden). Opnieuw meng door en neer te pipetteren. </li><li> Incubeer de reactie in een thermische cycler bij 37 ° C gedurende 4 uur. Onmiddellijk overgaan tot cDNA synthese. </li></ol> 4. reverse transcriptie / cDNA Synthesis <ol><li> Voeg de volgende componenten aan de 5 &#39;ligatiereactie: 2 pl 5x RT-buffer, 0,75 pl 100 mM DTT, 1 ui Illumina RT primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 uM), en 0,5 pl dNTPs (10 mM). </li><li> Meng door pipetteren en verhit tot 65 ° C gedurende 5 min. Vervolgens langzaam afkoelen op de bank top. </li><li> Zodra reactie afgekoeld tot kamertemperatuur, plaats buis op ijs en voeg 0,5 pl elk van reverse transcriptase enzym en RNase inhibitor. Meng door pipetteren en plaats thermische cycler voor het uitrekstap aangegeven in de instructies van de fabrikant. </li><li> Eenmaal voltooid add 5 ul nuclease-vrij H2O het eindvolume van het cDNA tot 15 pi te brengen. </li></ol> 5. Bibliotheek Voorbereiding <ol><li> Voor de indexering PCR, assembleren de volgende reactie op ijs: 6 pl 5x Phusion buffer, 1 ul dNTP (10 mM), 0,9 pl DMSO, 0,75 pl 5 &#39;primer (25 uM), 0,75 pl 3&#39; primer (25 uM), 3 pl cDNA-bibliotheek (variabele concentratie, afhankelijk van de hoeveelheid van de input), 0,5 gl Phusion polymerase (1 eenheid), nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 30 ui. Kies de primer sequenties voor gegarandeerde compatibiliteit met de template en de sequencing platform vankeuze. <ol><li> Voer de PCR reactie met de volgende instellingen: initiële denaturatie bij 98 ° C gedurende 3 min, gedurende de eerste 4 cycli denaturatie 98 ° C gedurende 15 seconden, annealen bij 50 ° C gedurende 15 seconden, verlengen bij 72 ° C gedurende 15 sec . OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal, variëren de totale PCR cyclus nummers. Kenmerkend voor een ingang van 1-2 ug totaal RNA, 13 totaal PCR cycli voldoende om de miR-Seq bibliotheek genereren. </li><li> Voer de volgende cycli, bijvoorbeeld cycli 5-12, in een tweestaps wijze waarbij de annealing en extensie cycli worden gecombineerd en bij 70 ° C gedurende 30 sec en de denaturatie weer 98 ° C gedurende 15 sec. Opmerking: Het reactievolume is 30 ui toestaan ​​pauzeren het PCR-programma en verwijderen van een 10 pl aliquot op vooraf bepaalde cyclus nummers te controleren op het uiterlijk van het gewenste product. Typisch cycli 10, 13 en 16 zijn gekozen voor het testen van een totaal RNA-monster. </li></ol></li><li> Bereideneen 8% niet-denaturerende acrylamide gel door het mengen van 2 ml 40% acrylamide, 1 ml van 10x TBE, en H2O tot 10 ml. Voeg vervolgens 100 pl 10% APS en 10 ui TEMED. Giet gel en laat set. <ol><li> Pre-run de gel bij 12 V / cm gel breedte voor 30 min. Flush putten. Voeg 1 pl 10x laadbuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) broomfenolblauw), voeg 10 ul monster aan elk putje van afmetingen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Meestal kan elke well maximaal 30 ui monsters. Laat het monster gel bij 10 V / cm breedte gel in 1x TBE buffer totdat de broomfenolblauw kleurstof loopt net uit de bodem van de gel. </li><li> Vlekken en visualiseren gel zoals beschreven in stap 2.3. </li><li> Accijnzen de 146 basenparen band en elueren overnachting in 0,25 ml van HSCB op een manier vergelijkbaar met wat is beschreven in paragraaf 2.4. Precipiteren DNA in een gelijk volume isopropanol en 1/10 volume natriumacetaat. Was de pellet in 70% ethanol en resuspendeer in TE buffer. </li><li> Kwantificeren bibliotheek met picogreen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van een aantal belangrijke variabelen ligatie efficiëntie, namelijk hoge concentraties PEG gebruik van gerandomiseerde linkers en hoge concentratie van linkers 2,6,9 maximaliseren. Deze aanpak maakt het mogelijk op een betrouwbare kwantitatieve sequencing bibliotheken uit totaal RNA monsters 2. We hebben meerdere titraties input RNA uitgevoerd en hebben geconcludeerd dat de voorgaande werkwijze is het meest geschikt voor totale RNA bedragen in het bereik...

High-throughput sequencing-gebaseerde methoden zijn op grote schaal toegepast voor vele biologische monsters laatste jaren enorm uitbreiden ons begrip van de moleculaire complexiteit van biologische systemen 3,4. Echter, het maken van RNA-monsters voor high-throughput sequencing schenkt vaak specifieke biases die inherent zijn aan de gebruikte methoden, het beperken van de potentiële nut van deze krachtige technieken. Deze methode specifieke vooroordelen zijn goed gedocumenteerd voor-ligatie is op kleine RNA bibliotheek voorbereidingen 1,2,5,6. Deze vooroordelen resulteren in 1.000-voudige variatie in leest nummers voor equimoleculaire synthetische miRNAs, waardoor gevolgtrekking van miRNA overvloed van sequencing data wild variabele en foutgevoelig. Studies gericht op de eigenschappen van faag afgeleide T4 RNA ligasen hebben aangetoond dat de enzymen vertonen nucleotide gebaseerde voorkeuren 7, die zoals bevooroordeeld bibliotheken in high-throughput sequencing experimenten manifesteren <sup&gt; 1,2,8. Om de vooroordelen verleend door RNA ligasen minimaliseren, verschillende strategieën zijn toegepast; macromoleculaire verdringing 9 randomizing de nucleotide sequentie van de adapter die proximaal is aan de ligatieplaats 6, met gebruikmaking van hoge concentraties ligatie adapter 2. Door een combinatie van deze drie benaderingen hebben we een workflow voor onpartijdige bereiding van kleine RNA bibliotheken geschikt voor high-throughput sequencing (figuur 1) ontwikkeld. Voor een directe vergelijking tussen de huidige protocollen en onze geoptimaliseerde methode, verwijzen wij u naar onze recente rapport 2. Deze geoptimaliseerde methode levert ligatie efficiëntie van meer dan 95% op zowel 3 &#39;en 5&#39; stappen en maakt de onpartijdige ligatie van kleine RNA moleculen uit synthetische en biologische monsters 2.

<table><tbody><tr><td>3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5' Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5' geblokkeerd, HPLC gezuiverd</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Gespecialiseerd voor ligatie van voor-adenylerde DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligatie buffer (zonder ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Inbegrepen bij M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligatie buffer (met ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Inbegrepen bij M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol (mol. Wt. 8.000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Inbegrepen bij M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We hebben gevonden dat water verzameld uit een destillatieapparaat van gelijke kwaliteit is.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturerende RNA laadbuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Inbegrepen bij M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon buizen</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Microfugebuizen met lage retentie</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenyleringskit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

zeer efficiënte ligatie van kleine rna-moleculen voor microrna kwantificering van high-throughput sequencing

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mirna klonen en high-throughput sequencing, genaamd miR-Seq, staat alleen als een transcriptome-brede benadering van miRNAs met single nucleotide resolutie kwantificeren. Deze techniek vangt miRNAs door aan 3 &#39;en 5&#39; oligonucleotide adapters miRNA moleculen en maakt de novo miRNA ontdekking. Koppeling met krachtige next-generation sequencing platforms, heeft miR-Seq instrumenteel in de studie van miRNA biologie geweest. Echter, belangrijke vooroordelen geïntroduceerd door oligonucleotideligatie stappen hebben verhinderd miR-Seq wordt gehanteerd als een nauwkeurige kwantificering tool. Eerdere studies tonen aan dat biases in de huidige miR-Seq methoden leiden vaak tot onnauwkeurige miRNA kwantificering met fouten tot 1.000-voudig voor sommige miRNAs 1,2. Om deze vertekeningen verleend door RNA ligatie lossen, hebben we een kleine RNA ligatie werkwijze die leidt tot ligatie efficiëntie van meer dan 95% voor zowel de 3 &#39;en 5&#39; ligatiestappen ontwikkeld. Benchmarking deze imbleek bibliotheek bouwmethode met equimolair of verschillend gemengde synthetische miRNAs consequent levert leest getallen minder dan tweevoudige afwijking van de verwachte waarde. Verder is deze high-efficiency miR-Seq methode maakt nauwkeurige genoom-brede miRNA profilering van in vivo totaal RNA monsters 2.

De verwachte resultaten voor de bovenstaande methode dient echter aanvankelijk waarneming van een enkel nucleotide verandering (toename) van de omvang van de DNA oligonucleotide die aan adenylatie van Mth RNA ligase was (Figuur 2). Na 3 &#39;ligatie visualisatie van de acrylamide gel aangeeft (zie figuur 3) scherp hoogmoleculaire banden zichtbaar in de 100-300 nucleotide gebied van de gel. Dit betekent dat de totale RNA-monster gebruikt van hoge kwaliteit (niet afgebroken). Ten...

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Het algemene doel van deze procedure is om microRNA's onpartijdig voor te bereiden voor high throughput sequencing. Dit wordt bereikt door eerst DNA-oligonucleotiden te bereiden of aan te schaffen die competent zijn voor ligatie aan het drie-prime-uiteinde van het micro RNA. De tweede stap is om het drie-prime DNA-oligonucleotide te lijmen aan het drie-prime-uiteinde van het micro RNA.Vervolgens wordt het ligatieproduct gepurificeerd op een gel en wordt de vijf-prime RNA-oligonucleotide-linker gebonden aan het vijf-prime-uiteinde van het micro RNA. De laatste stap is om de hybride moleculen om te zetten in CDNA en vervolgens het CDNA te versterken door polymerasekettingreactie. Uiteindelijk worden micro RNA-klonen en high throughput sequencing gebruikt om het transcriptoom-brede profiel van microRNA's te tonen op een kwantitatieve manier met een resolutie van individuele nucleotiden.Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals microsequencing microray qPCR blot, is dat onze techniek beter reflecteert van het werkelijke niveau van microray op een transcriptbreed lab-schaal bij een resolutie van een enkele nucleotide. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de biologie van microRNA, kan het ook worden toegepast op andere high throughput sequencing technologieën zoals HC clip en RNA-Seq. De DNA-oligonucleotiden voor deze procedure zijn ontworpen voor drie-prime ligatiereacties en moeten een vijf-prime fosfaatgroep hebben, een gerandomiseerde dinucleotide aan het vijf-prime-uiteinde en een drie-prime cytosine. Verdun de DNA-oligonucleotiden tot 100 micromolar in nuclease-vrij water.Assembleer de ventilatieractie door deze reagentia samen te brengen: 200 picomol van de drie-prime linker-oligonucleotide, vier microliter vijf-prime DNAA ventilatiebuffer, vier microliter TP, vier microliter M-T-H-R-N-A, ligase en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 40 microliter. Incubeer de reactie gedurende één uur bij 65 graden Celsius. Beëindig de reactie door gedurende vijf minuten op 85 graden Celsius te verwarmen.Precipiteer de TED-linker door 2,5 volumes 100% ethanol en een derde volume 10 molar ammoniumacetaat toe te voegen. Om resterende TP te verwijderen en onverwachte ligaties in toekomstige reacties te voorkomen, meng de alcohol, zout en oligonucleotide-oplossing tot homogeniteit door 20 minuten bij volle snelheid te draaien in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Was het pellet in 70% ethanol, laat het drogen en suspendeer het pellet in het juiste volume nuclease-vrij water om 50 tot 100 micromolar van een geventileerde oligonucleotide te verkrijgen.Bevestig een ventilatie van de oligonucleotide door middel van elektroforese op een 18% polyacrylamidegel. Laat de gel 30 minuten pre-runnen bij 24 volt per centimeter gelbreedte met één XTBE-runbuffer bij kamertemperatuur. Zodra de 30 minuten voorbij zijn, spoel de putjes met running buffer.De DNA-oligonucleotiden voor deze procedure zijn ontworpen voor drie-prime ligatiereacties en moeten een vijf-prime fosfaatgroep hebben, een gerandomiseerde dinucleotide aan het vijf-prime-uiteinde en een drie-prime oxytocine. Verdun de DNA-oligonucleotiden tot 100 micromolar in nuclease-vrij water. Laat de gel lopen bij 24 volt per centimeter totdat het broomfenolblauw driekwart van de weg naar de onderkant van de gelpost is.Kleur de gel met één x cyber goud-oplossing in één XTBE en visualiseer op een UV-transluminatorbox. Er zou een enkele nucleotideverschuiving moeten zijn in de grootte van de DNA-oligonucleotide die werd onderworpen aan een ventilatie door M-T-H-R-N-A ligase voor de drie-prime ligatiereactie. Assembleer de volgende componenten op ijs in deze volgorde.Eén microliter van 50% PEG 8, 000 0,5 microliters van 10 XRNA ligasebuffer. Eén microliter van een geventileerde drie-prime linker, 0,5 microliters RNA-remmer 0,5 tot acht microgram totaal RNA 0,5 microliters van T vier RNA Ligase twee en nuclease-vrij water tot een eindvolume van vijf microliters. Meng de reactie door één keer grondig te pipetteren.Plaats de reactie in een thermische cycler met een verwarmd deksel. Stel de blok in op 16 graden Celsius en incubeer gedurende vier uur. Merk op dat de reactie kan worden opgeschaald tot een eindvolume van 20 microliter zonder enig verlies in ligatie-efficiëntie.Na de drie-prime ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van twee XRNA laadbuffer, verhit tot 70 graden Celsius gedurende vijf minuten en snel afkoelen op ijs. Volgend gel. Zuiver het monster op een 15% polyacrylamidegel.Laat de gel vooraf lopen bij 24 volt per centimeter gelbreedte gedurende minimaal 30 minuten. Schakel de voeding uit en spoel de putjes met running buffer. Laad het monster en laat de gel lopen bij dezelfde spanning als de voorafgaande draai totdat het broomfenolblauw net de gel heeft verlaten.Het gewenste product zal dicht bij de xyleencyan migreren wanneer de polyacrylamidegelelektroforese voltooid is. Plaats de gel in een schone lade met één x running buffer en één x cyber goud en schudden gedurende 15 minuten. Verwijder de gel uit de kleuringsbak en visualiseer op een UV-transluminatorbox bedekt met schone plasticfolie.Het ligatieproduct moet ongeveer 45 nucleotiden lang zijn. Aangezien dit ligatieproduct meestal niet zichtbaar is, is het belangrijk om een positieve controle synthetisch RNA-monster in het aangrenzende kanaal op te nemen door met een schone scheermesje het gebied met het ligatieproduct uit te snijden. Geleid door de posities van het synthetische RNA-monster en de maatstaven.Plaats het uitgesneden gelfragment in een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter. Prik de bodem van het microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter met een naald van 30 gauge en plaats het prikbuisje in een tweede schone lage retentie, 1,5 milliliter microcentrifugebuisje centrifugeer gedurende vijf minuten bij ongeveer 15.000 keer. G. Visueel bevestig dat de hele gelplak door het gat in de binnenbuis is bewogen.Gebruik indien nodig een schone pipettip om enkele gelfragmenten dichter bij het gat te duwen. Gooi de lege buis van 0,5 milliliter weg en voeg 400 microliter hoog zout kolombuffer toe aan de

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Leer een efficiënte ligatiemethode voor microRNA-kwantificering via high-throughput sequencing. Deze techniek maakt transcriptoombrede profilering mogelijk met nucleotide-resolutie voor genregulatieonderzoek.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Meer video's verkennen