Name: Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer een protocol voor grootschalige zuivering van fotoreceptor buitenste segmenten uit varkens- of runderogen met behulp van ultracentrifugatie en sucrosegradiënten. Deze methode maakt opslag bij -80°C mogelijk voor fagocytosetesten op retinale pigmentepitheelcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs naar EVK), Fondation Voir et Entendre en Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Grants naar EVK), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, permanente positie voor EVK) , en The National Eye Institute van de National Institutes of Health (R01-EY13295 om SCF). Bovendien, het Institut de la Vision wordt gefinancierd door het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Parijs 6, Centre National de la Recherche Scientifique en afdeling de Paris.

Deze POS isolatie experiment is tijdrovend en kunnen tot 12 uur in beslag wanneer POS gelabeld vóór opslag. Het protocol is aangepast van een paper gepubliceerd door RS Molday en collega&#39;s in 1987 31 en gewijzigd door SC Finnemann en collega&#39;s in 1997 10. De dieren werden behandeld volgens de Association for Research in Vision en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. Protocollen werden beoordeeld en door de Charles Darwin ethische commissie van de Universiteit Pierre en Marie Curie-Paris 06 en de Fordham University Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurd. 1. Algemeen Set Up <ol><li> Verkrijgen 80 vers varken of koe ogen zo vers als snel na het slachten mogelijk en houd ze gekoeld in het donker. Instructies geven aan de provider zodat het bedrijf verloopt op dezelfde manier. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 80 ogen. Naardoorgaan met meer ogen en krijgen grotere voorraden (bv, van 160 ogen), het dubbele van de oplossing hoeveelheden en uitvoeren 2 rondes van ultracentrifuge; pool monsters later aan de collectie stap (zie stap 2.2.2). </li><li> Opgezet op de bank de rode safelight lamp, absorberende kussentjes, doekjes (Materials tabel). Bereid 15 cm schalen en biohazard zakken voor afvalinzameling (ongebruikte oog onderdelen, glasvocht ...). Draag nauwsluitende labjas, handschoenen, mouwbeschermers en een veiligheidsbril. </li><li> Voorzorgsmaatregelen: <ol><li> Pre-chill alle oplossingen dan houden ze koud tijdens alle stappen. Houd ogen en gradiënten op ijs gekoeld zoveel mogelijk. </li><li> Houd ogen en afgeleide weefsels in het donker zoveel mogelijk tot de verzamelstap na ultracentrifugatie vermijden fotobleken visuele pigmenten en verlies van de oranje-roze kleur van de actieve vorm van de photopigments. </li></ol></li></ol> 2. Protocol Acties <ol><li> Bereid oplossingen en hellingen: <ol><li> Dooi taurine voorraad volledig met behulp van een 37 ° C waterbad. </li><li> Bereid alle oplossingen uit voorraad oplossingen (tabel 1, Stock oplossingen) en meng de sucrose met andere ingrediënten om met een magneetroerder voor elke oplossing. <ol><li> Maak 15 ml van de homogenisering oplossing tot een eindconcentratie van 20% sucrose, 20 mM Tris acetaat pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glucose en 5 mM taurine. </li><li> Bereid de 25% sucrose oplossing tot een eindconcentratie van 25% sucrose (met 70% sucrose stock), 20 mM tris pH 7,2, 10 mM glucose en 5 mM taurine. </li><li> Bereid de 60% sucrose oplossing tot een eindconcentratie van 60% sucrose (saccharose met poeder), 20 mM Tris acetaat pH 7,2, 10 mM glucose en 5 mM taurine. </li><li> Bereid de Wash 1 oplossing tot een eindconcentratie van 20 mM tris pH 7,2 en 5 mM taurine. </li><li> Bereid de Wash 2 oplossingtot een eindconcentratie van 10% sucrose, 20 mM tris pH 7,2 en 5 mM taurine. </li><li> Bereid de 3 Wash oplossing tot een eindconcentratie van 10% sucrose, 20 mM natriumfosfaat pH 7,2 en 5 mM taurine. </li></ol></li><li> Steady de gradiënt maker op een magneetroerder en plaats een roerstaafje in de kamer het dichtst bij de uitgang waar de 60% oplossing zal worden ingevoegd. Gebruik een cut-off P200 pipet tip geplaatst bij de uitgang van de slang aan op een goede casting snelheid te bereiken. </li><li> Cast lineaire verlopen subtiel door het verdunnen en roeren van de 60% ​​sucrose-oplossing met de 25% een met behulp van 12 ml van elke oplossing (dat wil zeggen, in totaal 6 buizen voor 80 ogen) in de pre-gekoelde ultracentrifugebuizen. Roer het geleidelijk-verdunning van 60% sucrose-oplossing ook. Steady de snelheid van gradiëntstroom, gieten van de oplossing soepel en niet te snel. OPMERKING: Om een ​​continue, lineair verloop te krijgen, houdt u de pipet tip opening direct aan het oppervlak van de oplossing voor de gehele gradiënt vormingenn. </li><li> Laat de gradiënten zitten op het ijs voor ongeveer 1 uur om te stabiliseren. Houd de hellingen gekoeld totdat geladen. Laat de buizen niet schudden om verstoring van de gradiënt te voorkomen. </li></ol></li><li> Tissue collectie: <ol><li> Verzamel weefsels onder gedimd rood licht. Neem een oogje in de ene hand en porren de voorzijde met rand van scheermesje terwijl de aandacht weg (om spatten te voorkomen; figuur 1). Gebruik het scheermes aan het voorste oogbol in 2 helften (cornea plus ten minste 5 mm in de sclera) afgesneden. Verwijder de lens en draai de oogschelp binnen naar buiten, zodat het kan worden gehouden over het puntje van een vinger waardoor het blootstellen van de retina. </li><li> De scheermesje schuin voorzichtig schrapen het netvlies losmaken eenvoudig en verschijnen als een rozeachtige laag van de tapetum oppervlak en afgesneden de oogzenuw (figuur 1). Verzamel netvlies in 2 x 50 ml buisjes die elk 15 ml homogenisering oplossing op ijs. </li><li> Retina homogenization: <ol><li> Schud de suspensie krachtig met de hand gedurende 2 min teneinde de verschillende cellagen verstoren, afbreken POS van de rest van de PR cel fragment POS en homogeniseer de retina suspensie. </li><li> Filtreer 3x door een dubbele laag van schone gaas grote weefselfragmenten en vang de doorstroming in schone buizen van 50 ml (figuur 1). De retinale schorsing wordt vrij dik, om de opbrengst te maximaliseren, drukt u voorzichtig op het gaas om de resterende gefragmenteerde weefsels na elke filtratie los. </li></ol></li></ol></li><li> Fotoreceptor buitenste segment fragment (POS) isolatie: <ol><li> Leg de ruwe netvlies prep, ongeveer 6-7 ml per buis, gedurende 6 x 30 ml ultracentrifugebuizen elk 24 ml vers gekoeld continue 25-60% sucrose gradiënt (figuur 1). Balans de tegengestelde buizen, die voor het rotor te gebruiken. Ultracentrifuge bij 106.000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C. </li&gt; <li> Verwijder het grootste deel van de oplossing boven de oranje-roze band in het bovenste derde van de gradiënt door aspiratie (Figuur 2A). Het verzamelen van de oranje-roze band met een cut-off P1000 tip in een bekerglas. Gooi de rust na het neutraliseren met behulp van bleekwater (biologisch afval). </li><li> Verdun met ~ 4-5 volumina ijskoude Wash 1 oplossing. Verdeel in maar 30 ml buisjes als nodig. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant voorzichtig. </li><li> Resuspendeer pellets in 10 ml 2-oplossing wassen en centrifugeren bij 3000 xg gedurende 10 min zoals hierboven beschreven. Resuspendeer pellets in 15 ml Was 3 en draaien opnieuw bij 3000 xg gedurende 10 min. Combineer suspensies van enkele pellets het aantal buizen nodig voordat centrifugeren Wash 2 verminderen en wassen 3 oplossingen. </li></ol></li><li> POS aliquoting zonder etikettering: <ol><li> Hersuspendeer POS in 10-20 ml DMEM. Predilute 10 ul in 490 ul DMEM (01:50) en tel maar ook langwerpig als wervelde POS in eencel telkamer (figuur 2B). Bereken opbrengst en concentratie in POS-deeltjes per ml. OPMERKING: De opbrengst varieert, hoofdzakelijk afhankelijk van de leeftijd en het type van varkens / koeien en grootte van de ogen, bijvoorbeeld, een goede voorbereiding varieert 5-8 x 10 9 POS van 80 varkens ogen. </li><li> Bepaal het uiteindelijke volume DMEM (meestal 10-20 ml) en voeg sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 2,5% sucrose verkregen. </li><li> Aliquots van de gewenste grootte, bijvoorbeeld 5 x 10 7 POS per buis voor een 2 ml resuspensie volume van een 96-well experiment bij 40 pl / putje. Spin 1 portie gedurende 5 min bij 2300 xg bij RT en evalueren pellet grootte. Bereid verschillende portie maten voor verschillende toepassingsgebieden volumes als POS NIET moeten worden bevroren en twee keer ontdooid. </li><li> Freeze POS aliquots bij -80 ° C tot verder gebruik. OPMERKING: Hoeveelheden zijn stabiel gedurende vele maanden. In onze handen, kunnen ongelabelde of geëtiketteerd POS wordt ten minste één jaar. </li></ol></li><li> POS etikettering en aliquoteren: OPMERKING: We gebruiken meestal FITC POS label voor het kwantificeren van fagocytose assays, maar andere kleurstoffen kunnen eveneens worden gebruikt afhankelijk van de behoeften. <ol><li> Resuspendeer 1 10 mg FITC flacon 2,5 mg / ml concentratie in 0,1 M Na-carbonaatbuffer pH 9,5 door mengen 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 met 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11.5 (Tabel 2, Voorraadoplossingen). Draai gedurende 1 uur bij KT en beschermt tegen licht en centrifugeren gedurende 5 minuten bij maximale snelheid niet-FITC vaste pellet geresuspendeerd. </li><li> Resuspendeer de POS pellet in 10 ml Wash 3 oplossing (of DMEM) en 2 ml van FITC oplossing 80 ogen. Bewaar overgebleven FITC bevroren bij -80 ° C. Draai minstens 1,5 uur bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie. </li><li> Was gelabeld POS tweemaal wassen met 3-oplossing zoals beschreven in paragraaf 2.3.4, dan een of twee keer in DMEM tot bijna geen vrije FITC gezien in de supernatant Fraction. Hersuspendeer POS in DMEM en ga als voor ongelabelde POS voor het tellen en aliquoteren (paragraaf 2.4). </li></ol></li><li> Met behulp van POS in experimenten: <ol><li> Dooi POS bij RT, en bewaar ze in het donker zoveel mogelijk indien zij fluorescent label. Spin gedurende 5 min bij 2300 xg bij kamertemperatuur. Zuig de supernatant. </li><li> Onmiddellijk opnieuw in suspensie in de juiste hoeveelheid testoplossing zoals gedicteerd door het experiment. In geval van verschillende tijden van POS uitdaging, winkel geresuspendeerd POS bij RT in het donker tussen tijd-punten voor enkele uren. </li></ol></li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Drie stappen of omstandigheden cruciaal voor een optimale zuivering kwaliteit gradiënt gieten en delicate gradiëntbuizen manipulatie, waardoor weefsels gekoeld en in het donker totdat de verzamelstap, sterkte schudden van retinale homogenaten de juiste POS isolatie verkrijgen van de rest van de PR cel. Als sommige problemen zich voordoen in de juiste zien van de oranje band, ze zijn het meest waarschijnlijk te wijten aan één van de drie bovenstaande redenen (zie ook de tweede paragraaf van de Resultaten).</stron...

In de retina, wordt zicht veroorzaakt door isomerisatie van fotogevoelige moleculen genaamd opsins, alvorens te worden omgezet in een signaal dat tussen neuronen kunnen worden doorgegeven aan de visuele gebieden van de hersenen. Deze moleculen zijn ingebed in stapels van membraneuze schijven lijkt op pannenkoeken dat de buitenste segment delen van lichtgevoelige cellen (PV&#39;s) vormen. Worden onderworpen aan een constante blootstelling aan licht en dus een aanzienlijke mate van oxidatieve stress, continu PR&#39;s hun buitenste segmenten te vernieuwen om mogelijke oxidatieve schade te beperken. Fotoreceptor buitenste segmenten staan ​​in nauw contact met de apicale microvilli van het naburige retinale pigment epitheel (RPE) cellen. RPE-cellen vormen het buitenste gedeelte van de bloed-retina barrière en zorgen talrijke taken die cruciaal zijn voor fotoreceptoren gezondheid en functie 1 zijn, zoals afschrikken lichtstralen via melanine, opnieuw isomerisatie van de fotoreactieve opsin component retinal verstrekken van voedingsstoffen en gGROEI factoren, deelnemen aan PR metaboliet beschikking. Bovendien elimineren RPE cellen besteed POS en hun componenten, een dagelijkse bezigheid die wordt gereguleerd door het circadiane ritme in zoogdierretina 2,3 recyclen. De klaring van loods POS is absoluut noodzakelijk voor PR overleven. Wanneer deze volledig is ingetrokken, POS vuil ophopen en PR&#39;s ontaarden dat een snel verlies van het gezichtsvermogen 4,5. Als de ritmische profiel verloren en vervangen door een constante activiteit, PR en RPE gebreken accumuleren 6 leeftijd. Daarom is het erg belangrijk om de moleculaire regulatie van RPE fagocytose karakteriseren in vitro om fenotypen verbonden met de dysfunctie begrijpen. Interessant is dat de moleculaire machinerie van RPE cellen vergelijkbaar met die gebruikt door macrofagen apoptotische cellen wissen en beide zijn afhankelijk erkenning van blootgestelde fosfatidylserine op fagocyterende vuil 7-9. Toch RPE cellen en macrofagen reguleren phagocytosis anders macrofagen kiezen voor onmiddellijke verwijdering van apoptotische cellen bij ontmoeting moment tijdens RPE cellen ritmisch overspoelen POS eenmaal daags ondanks hun permanent contact met de buitensegmenten. Dit suggereert specifieke mechanismen regelgeving die nog niet volledig begrepen. Veel moleculen betrokken bij het RPE fagocytaire machine geïdentificeerd of gevalideerd door het gebruik van geïsoleerde POS en celcultuur fagocytose assays. De alphavbeta5 integrine receptor bij het ​​RPE apicale celoppervlak, in samenwerking met zijn ligand MFG-E8, bindt specifiek aan POS 10-12, die vervolgens worden geïnternaliseerd via MerTK tyrosine kinase receptor 13-15. De CD36 scavenger receptor werd aangetoond dat POS inname en beïnvloeden de snelheid 16,17 en kan dienen als een sensor van geoxideerde fosfolipiden op het POS vlak 18. Internalisatie moet de werving van F-actine cytoskelet-associated eiwitten zoals annexine 2 19, myosine II 20 en myosine VIIA 21,22. Inheemse of geoxideerd POS in vitro worden ook gebruikt om veroudering fenotypes van RPE cellen in vivo gekoppeld aan accumulatie van slecht verteerd geoxideerde POS 23-28 begrijpen. Het genereren van RPE cellen afkomstig van stamcellen is een nieuwe toepassing voor geïsoleerde POS die worden gebruikt om de functies van cellen bewijzen voordat ze worden getransplanteerd dieren of patiënten 29,30,27 geïnitieerd. Eerst beschreven door Molday en collega&#39;s in 1987 31, het protocol voor isolatie van runderen POS combineert een ultracentrifuge stap van retinale homogenaten op continue sucrosegradiënten met observatie van de karakteristieke oranje uiterlijk van ongebleekt retinale photopigment (uitvoeren 11- cis retinal). In de afgelopen 10 jaar, als gevolg van voorzorgsmaatregelen genomen om het risico van de gekkekoeienziekte te minimaliseren, het gebruik van varkens ogen is geworden increasingly prominent. De hier beschreven protocol duidelijk dat grote hoeveelheden POS van varkens of runderen ogen die kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen voor langere tijd te verkrijgen. Dit elimineert de noodzaak om POS bereiden van knaagdieren ogen, die vereist het gebruik van een groot aantal dieren per POS voorbereiding en test 32,33,21,22. Daarnaast worden gegevens over POS labeling vóór opslag met fluorescerende moleculen gegeven, te kwantificeren en visualiseren POS in een vereenvoudigde en vergelijkbare wijze voor sommige toepassingen tegenover etikettering POS na fagocytose assay 32,10. Daarom zijn deze grote voorraden zorgen voor reproduceerbaarheid en gebruiksgemak in vele verschillende experimenten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Specifiek Materiaal/Uitrusting</td></tr><tr><td>2 Chamber gradient maker</td><td></td><td></td><td>Gradient maker met 30 ml kamers</td></tr><tr><td>3 mm diameter siliconen slang</td><td></td><td></td><td>Slang voor gradiëntcasting</td></tr><tr><td>Kleine magneetroerdbaar</td><td></td><td></td><td>Roerder die past in de gradiënt maker kamer</td></tr><tr><td>Rode safelight lamp</td><td></td><td></td><td>Inactieve lamp voor dissectie in het donker</td></tr><tr><td>Ultra Clear 25 x 89 cm buizen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Ultracentrifugatiebuizen</td></tr><tr><td>PP Oak Ridge buizen</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>30 ml centrifugatiebuizen</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultracentrifuge</td></tr><tr><td>SW 32Ti schommelrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Schommelrotor voor ultracentrifuge</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>JA-25.50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>Rotor voor Avanti J-26 XP centrifuge</td></tr><tr><td>FITC Isomer I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td colspan="4">Ander Materiaal/Uitrusting</td></tr><tr><td>Tellingkamer (zoals Neubauer of Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkere ijsemmers met deksels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magneetroerder en standaard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C waterbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Labjas</td><td></td><td></td><td>Gezondheid en veiligheid</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouwenbeschermers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsbril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorberende kussens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biogevaar afvalzakken en -bakken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weck-Prep messen</td><td></td><td>Dissectie</td><td>60 mm/2.25 inch brede scheermessen</td></tr><tr><td>15 cm plastic schaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele gaasbladen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 en 50 ml buizen</td><td></td><td></td><td>Gemeenschappelijke verbruiksartikelen</td></tr><tr><td>Microbuizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

grootschalige zuivering van varkens of bovine fotoreceptor outer segmenten voor fagocytose testen op retinale pigment epitheelcellen

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analyse van een van de vitale functies van retinale pigmentepitheel (RPE) cellen, de fagocytose van verbruikte leeftijd distale fragmenten van fotoreceptor buitenste segmenten (POS) kan worden uitgevoerd in vitro. Fotoreceptor buitenste segmenten met stapels van membraneuze discs met de fototransductie machines worden continu vernieuwd in het netvlies. Doorgebracht POS worden dagelijks geëlimineerd door RPE cellen. Knaagdier, varken / rund en humane RPE cellen herkennen POS uit verschillende soorten op dezelfde wijze. Voor het uitvoeren grote reeks experimenten met weinig variabiliteit vergemakkelijken kan een grote voorraad POS worden geïsoleerd uit varkens ogen en opgeslagen in aliquots ingevroren. Dit protocol maakt gebruik van de eigenschap van photopigments die een oranje kleur weergegeven bij bewaring in het donker. Onder gedimd rood licht, zijn retinae opgevangen in een buffer uit geopende oogschelpen gesneden in helften. De retinale cel suspensie wordt gehomogeniseerd, gefiltreerd en geladen op een continue sucrose gradiënt. Na centrifugation, POS wordt in een afzonderlijke band in het bovenste deel van de gradiënt die een karakteristieke oranje kleur heeft. POS worden vervolgens verzameld, gesponnen, geresuspendeerd opeenvolgend in wasbuffers, geteld en in porties verdeeld. POS verkregen die wijze kan worden gebruikt voor fagocytose assays en analyse van eiwitten activatie lokalisatie of interactie op verschillende tijdstippen na POS challenge. Als alternatief kan POS gelabeld worden met fluoroforen, e. G., FITC, voordat aliquoting voor volgende fluorescentie kwantificering van POS binden of afblazen. Andere mogelijke toepassingen omvatten het gebruik van gemodificeerde POS of POS uitdaging gecombineerd met stressomstandigheden het effect van oxidatieve stress of veroudering op RPE cellen te bestuderen.

De combinatie van de lineaire sucrose gradiënt ultracentrifugatie en maakt de scheiding van de verschillende componenten van het retinale suspensie door dichtheid. Zware grotere retinale puin en RPE cellen zinken naar of nabij de bodem van de gradiënt (figuur 2A). Lichter POS en lichter afzonderlijke cellen of celresten van het netvlies migreren als afzonderlijke banden op de bovenste helft van de gradiënt tegen het einde van de periode centrifugatie. Door het houden van de ogen en de monsters in het do...

Dit artikel beschrijft het protocol voor de zuivering van fotoreceptorbuitensegmentfragmenten (POS) via ultracentrifugatie uit porcine/runderetinae met behulp van homogenisatie en sucrosegradiëntcentrifugatie. Dit protocol maakt de bereiding mogelijk van grote voorraden van POS-aliquots, gelabeld of ongelabeld, die vervolgens op -80 °C kunnen worden bewaard.

Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Het algemene doel van deze procedure is om grote hoeveelheden fotoreceptor uitwendige segmenten te genereren, gezuiverd van oorlogssporen of runderogen. Om een van de belangrijkste functies van het retinale pigment, epitheliale cellen, hun ritmische dagelijkse OC-zuuractiviteit te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst 25 tot 60% sucrose te gieten, gradiënten in ultracentrifugebuizen.Vervolgens worden varkens- of runderogen gedissecteerd en de ogen worden verzameld en gehomogeniseerd. Vervolgens worden de ogen gefilterd en op de sucrosegradiënt geladen en gecentrifugeerd om de fotoreceptor uitwendige segmenten te scheiden. Ten slotte wordt de oranje band die de fotoreceptor uitwendige segmenten bevat, verzameld in een aliquot of opgeslagen zoals het is, of gelabeld voordat Ali wordt geciteerd en opgeslagen.Uiteindelijk worden geautomatiseerde fluorescente scannen, fluorescente microscopie of immunoblotting gebruikt om de fagocytische activiteit van cellijnen, gedifferentieerde cellen afkomstig van stamcellen of primaire culturen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de isolatie van autosegmenten uit massa of ogen voor elk experiment is dat dezelfde pool van materiaal kan worden gebruikt voor meerdere experimenten, waardoor een hogere mate van reproduceerbaarheid mogelijk is. Visuele demonstratie van deze methode is praktisch omdat een kritische stap ligt in het ioncasting omdat het de reeks geïsoleerde uitwendige segmenten conditioneert.De procedure zal worden gedemonstreerd door Celia Parino, een afgestudeerde student en tevreden laboratoriumtechnicus. Nadat 80 verse varkens- of koeienogen volgens het tekstprotocol zijn verkregen, bewaar ze ze in het donker en koel ze op ijs zo veel mogelijk. Om het fotobleken van visuele pigmenten en verlies van oranje roze kleur op de werkbank te voorkomen, stelt u rode veiligheidslampabsorberende kussens en doekjes op. Bereid een 15 centimeter schotel biohazard zakken voor voor afvalverzameling en scheermessen.Zodra alle oplossingen zijn voorbereid, volgens het tekstprotocol, kil ze voor en bewaar ze koud tijdens alle stappen. Stel de gradiëntmaker vast op een magnetische roerplaat en plaats de roerstaaf in de kamer dichtstbij de uitgang waar de 60% oplossing zal worden gegoten. Gebruik een afgesneden P 200 pipettip geplaatst bij de uitgang van de buis om de juiste gietsnelheid te bereiken met 12 milliliters van elk 25% en 60% sucrose-oplossing.En terwijl het 60% oplossing wordt geroerd, wordt een lineaire sucrosegradiënt gegoten in een voorgekoelde centrifugeerbuis, waarbij de opening van de pipettip op het oppervlak van de voortdurend stijgende gradiëntoplossing wordt gehouden. Om weefselverzameling uit te voeren, draag een goed passende laboratoriumjas, handschoenen, sleevebeschermers en een veiligheidsbril bij zwak rood licht terwijl u een oog in één hand houdt met de snijvlakkant weg, gebruik de rand van een scheermes om de voorkant van het oog te doorboren. Gebruik vervolgens het scheermes om het voorste oogbol in twee helften te snijden.Verwijder de lens en draai de oogkom binnenstebuiten zodat deze over de punt van één vinger kan worden gehouden. Breng zo de retina bloot met behulp van het scheermes in een hoek, schraap voorzichtig de retina, die gemakkelijk loslaat en verschijnt als een roze laag van het tetumoppervlak en snijd bij de optische zenuwkop. Breng de retina's over naar een van de twee tot 50 milliliter buizen die 15 milliliter homogenisatie-oplossing op ijs bevatten.Na het verzamelen van alle retina's, schud de suspensie krachtig met de hand gedurende twee minuten. Om de verschillende cellagen te verstoren, breek de fotoreceptor uitwendige segmenten of POS van de rest van de fotoreceptoren, fragmenteer de POS en homogeniseer de retinasuspensie. Gebruik de dubbele laag schone gaas om grote weefselfragmenten te verwijderen, filter de suspensie driemaal in een 50 milliliter buis.Druk voorzichtig op het gaas om resterende gefragmenteerde weefsels vrij te geven. Na elke filtratie legt u de ruwe retina-voorbereiding voorzichtig op zes tot 24 milliliter, 25 tot 60% sucrose-gradiënten. Na het balanceren van de buizen Ultracentrifugeer bij 106.000 Gs gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius.Wanneer het draaien voltooid is, aspireert u het grootste deel van de oplossing boven de oranjeroze band in de bovenste derde van de gradiënt. Gebruik vervolgens een P 1000 tip om de oranjeroze band in een beker te verzamelen. Gebruik ongeveer vier tot vijf volumes van was één om de oplossing te verdunnen en verdeel in zoveel 30 milliliter buizen als nodig is.Centrifugeer bij 3000 GS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi voorzichtig de supernatant weg. Spuit vervolgens met was twee oplossing opnieuw, suspendeer de pellets voordat u opnieuw spint. Gebruik was drie oplossing om de pellets te wassen.Een derde keer. Om de POS te verdelen. Gebruik 10 tot 20 milliliter DMM om de cellen opnieuw op te schorsen.Gebruik vervolgens 490 microliters DMM om 10 microliters cellen te verdunnen en bereken de opbrengst en concentratie opnieuw in POS-deeltjes per milliliter. Bepaal een eind DMM-volume en voeg sucrose toe tot een eindconcentratie van 2,5%. Bereid de gewenste aliquoten voor. Draai een enkele aliquot bij 2.300 GS gedurende drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur.Evalueer de pelletgrootte en bereid verschillende aliquotvolumes voor om bevriezing en ontdooien meer dan eens te voorkomen. Gebruik 0,1 molair natriumcarbonaatbuffer om één 10 milligramvial van ZI op te schorsen tot een concentratie van 2,5 milligram per milliliter om de cellen te labelen voordat Eloqua watting.Roteer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker en draai met maximale snelheid gedurende vijf minuten om resterende ZI-deeltjes te pelleten. Gebruik 10 milliliters van was drie oplossing of DMM om de POS-pellet op te schorsen en voeg twee milliliter van de Fite-oplossing toe voor 80 ogen.

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video we describe a technique to isolate iris and retinal pigment epithelial cells from porcine eyes to obtain their primary cultures for in vivo and ex vivo studies. These pigment cells could be genetically modified to study regenerative approaches to treat ocular disorders.

Isolation of IPE and RPE cells: A Technique to Obtain Pigmented Epithelial Cells from Isolated Porcine Eye

This video demonstrates the procedure to isolate the retinal pigment epithelial, or RPE, cells and iris pigment epithelial, or IPE, cells from harvested bovine eyes. The isolated cells can be cultured to study their role in the treatment of ocular diseases.

Isolating RPE and IPE Cells from Bovine Eye: A Procedure to  Harvest and Culture Bovine Primary Pigment Epithelial Cells

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Hier wordt een eenvoudig te volgen methode gepresenteerd om primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens in vitro te kweken.

Primaire cultuur van porcine retinale pigmentepitheelcellen

We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.

Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

Dit protocol schetst de procedure voor het verkrijgen en kweken van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) uit lokaal geproduceerde varkensogen. Deze cellen dienen als hoogwaardig alternatief voor stamcellen en zijn geschikt voor in vitro netvliesonderzoek.

Isolatie van primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens voor in vitro modellering

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Leer een protocol voor grootschalige zuivering van fotoreceptor buitenste segmenten uit varkens- of runderogen met behulp van ultracentrifugatie en sucrosegradiënten. Deze methode maakt opslag bij -80°C mogelijk voor fagocytosetesten op retinale pigmentepitheelcellen.

Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen (Video) | JoVE Journal

Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen

Meer video's verkennen