Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Het algemene doel van deze procedure is om een embryonale cochlea te beeldvormen die genomen is van een fluorescerende reportermuis, met intervallen van 30 minuten over een periode van vijf dagen. Dit wordt bereikt door eerst de cochlea van embryonale dag 13 te oogsten van fluorescerende reportermuizen. Vervolgens worden de cochlea in vitro gekweekt.

Daarna worden de cochleaire explantaatculturen geplaatst in een incubatormicroscoop. Ten slotte wordt een geautomatiseerd beeldvormingsschema ingesteld en worden de cochlea E beeldvormd. Uiteindelijk kan langdurige time-lapse beeldvorming van cochleaire explantaatculturen worden gebruikt om morfogenetische bewegingen van het cochleaire epitheel als geheel te tonen, evenals veranderingen in reportergenexpressie in de loop van de tijd, en de effecten van langzaam werkende farmacologische middelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het handmatig fotograferen van X fund-culturen over een tijdsverloop, is dat dit systeem volledig geautomatiseerd is. Het stelt ons in staat om meer tijdstippen te verzamelen en zorgt ervoor dat dezelfde regio van de cochlea of set cellen wordt beeldvormd in dezelfde oriëntatie op elk tijdstip, terwijl het groeit in een onregelmatige weefselkweekincubator. Na suppletie van KO's gemodificeerd eagle medium of DMEM en Hank's balanced zout oplossing of HBSS volgens het bijbehorende tekstprotocol.

Onder een laminaire stromingshaak, gebruik vijf milliliter onsupplementeerd DMEM om te resuspenderen, 200 microliters van basement membrane substraat pipet 150 microliters in het centrum van elke 10 millimeter put van een 35 millimeter diameter glazen bodem kweekschaal. Incubeer gedurende 40 minuten in een CO2-incubator bij 35 graden Celsius. Om de werkstation en gereedschappen voor te bereiden, zet de laminaire stroming schone bank aan en gebruik 70% ethanol om het te sproeien en om forceps, lepels en een zwarte siliconen gecoate schaal te weken.

In de schone werkstation, oogst embryo's van de juiste draagtijd in ijs. Koud HBSS gesupplementeerd met 1% heaps. Gebruik een fluorescerende stereomicroscoop om embryo's te identificeren die reporteractiviteit extern of binnen een zichtbaar orgaan vertonen en breng ze over naar vers ijskoud HBSS met 1% heaps voor het verzamelen van temporale botten, met behulp van een koele lichtbron en fijne forceps.

Werk snel om bij de cervicale wervelkolom en onder de kaak te knippen om de hoofden te verzamelen. Na het verzamelen van de embryohoofden volgens het tekstprotocol, open voorzichtig de schedel, verwijder vervolgens de hersenen en trim de voorkant van het hoofd af en breng de achterste schedel over naar een schaal met vers ijs. Koud. HBSS heaps, dissecteer voorzichtig de pinda-vormige temporale botten, waarbij u ervoor zorgt dat het vestibulaire systeem intact blijft.

Om de cochlea te dissekteren, breng de temporale botten over naar een zwarte siliconen elastomeer gecoate schaal in ijskoud HBSS heaps. Speld de vestibulaire regio van het bot door pinnen in een schuine hoek in te brengen om het temporale bot te stabiliseren en ruimte te creëren voor de forceps. Vervolgens verwijdert u voorzichtig het kraakbeen rond de cochlea door een lus van de forceps in het kraakbeen aan de buitenrand van de basis van de cochlea in te brengen en een gat in het kraakbeen te knippen.

Knip horizontaal over de bovenkant en diagonaal en til voorzichtig het voorste gedeelte van de capsule op. Steek een tand van de forceps tussen het resterende kraakbeen en het kanaal en knijp voorzichtig het resterende kraakbeen af. Het apicale oppervlak van de cochlea is nu blootgelegd.

Begin bij de basis, vang het gebied waar het dak van het kanaal het cochleaire epitheel ontmoet en open het cochleaire kanaal. Schil voorzichtig het dak af, trim waar nodig totdat het volledig is verwijderd. Trim eventuele delen van het membraan die op de mediale zijde van het kanaal achterblijven.

Vervolgens reinig het kanaal van overtollig mesenchymaal weefsel en los het kanaal los van het vestibulaire systeem om implantaten te kweken. Plaats één luminale oppervlak omhoog in het midden van een substraat gecoat glazen bodem kweekschaal. Trek voorzichtig de vloeistof af en laat het twee minuten staan.

Voeg vervolgens druppelsgewijs 150 microliters gesupplementeerd DMEM toe aan de X explant, zorg ervoor dat het niet wordt verstoord zodat het zich kan nestelen op het substraat. Plaats de glazen bodem schalen in een diepe 12 centimeter diameter Petri schotel met een klein schaaltje steriel water om de vochtigheid te behouden.

Plaats de culturen een nacht in een 35 graden Celsius incubator om de explant aan het substraat te laten hechten en plat te laten liggen om live beeldvorming uit te voeren. Na het selecteren van monsters, gebruik een fluorescerende stereomicroscoop om de conditie van elke explanteerde cochlea te evalueren en selecteer alleen explanten waarbij het kanaal intact is en zich aan de glasbasis tot apex hecht. Stel de incubator in op 35 graden Celsius met 5% CO2 om te kweken.

Aspireer voorzichtig het gesupplementeerde DMEM uit de culturen en vervang het met minimaal 500 microliters vers medium. In gevallen waarbij de explant losjes is bevestigd, pipet een ring medium rond de rand van de schaal. Deze extra vloeistof zal een miniatuur bevochtigde kamer maken zonder de explant te verstoren terwijl het zich blijft hechten aan de matrix.

De microscoop in dit voorbeeld heeft een roterend platform dat 8 35 millimeter steekproefschalen onder de laminaire stromingshaak houdt. Vervang de plastic deksels door glazen deksels en plaats de schalen in de steekproefschaalhouder. Als het nodig is om het medium te veranderen tijdens het verloop van het experiment.

Om de explant niet te verstoren, gebruik gebogen schaaldeksels die het mogelijk maken de deksels te openen terwijl de schaal in zijn fitting in de microscoop blijft, plaats de steekproefschaalhouder binnen de incubatormicroscoop, zorg ervoor dat de explant niet uit de bodem van de schaal wordt