Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse
11 november 2014
RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om potentiële belangrijke regulatoren van zelfvernieuwing en differentiatie van muizen EML-cellen te identificeren door gebruik te maken van RNA-sequencing-technologie. Dit wordt bereikt door eerst lijn-negatieve CD 34-positieve en lijn-negatieve CD 34-negatieve EML-cellen te scheiden op basis van oppervlaktemarkers. De tweede stap is om mRNA te isoleren, het mRNA om te zetten in cDNA en de bibliotheek voor sequencing voor te bereiden.
Vervolgens wordt de DNA-bibliotheek onderworpen aan high-throughput sequencing. De laatste stap is om de sequencingresultaten te analyseren en te zoeken naar differentieel tot expressie gebrachte transcriptiefactoren. Uiteindelijk wordt RNA-sequencing-technologie gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte transcriptiefactoren in lijn-negatieve CD 34-positieve en lijn-negatieve CD 34-negatieve EML-cellen te laten zien.
Het belangrijkste voordeel van RNA-sequencing boven andere G-expressieproline-methoden zoals microray, is dat het een hogere gevoeligheid, nauwkeurigheid en een breder dynamisch bereik heeft, en het is niet afhankelijk van bestaande genannotatie-informatie. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het stamcelveld te beantwoorden, zoals wat de belangrijke transcriptiefactoren zijn die de celzelfvernieuwing en differentiatie reguleren. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot waar de therapie van bloedziekten omdat een beter begrip van de belangrijke regulator die de hematopoëtische precursorcellen, zelfvernieuwing en differentiatie controleert, kan leiden tot de ontwikkeling van effectieve behandelingen.
Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er verschillende bioformatics-tools nodig zijn voor de sequencinganalyse. De babyhamsternier of BHK-cellen voor stamcelfactorverzameling worden gekweekt in dmem-medium met 10%FBS in een flacon van 25 vierkante centimeter bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Wanneer de cellen 80 tot 90% confluency hebben bereikt, probeer ze met trypsine en verzamel ze door centrifugatie bij 200 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gooi de snat weg en suspendeer het cellenpalletje opnieuw in 10 milliliter vers BHK-celcultuurmedium.
Breng twee milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe flacon van 75 vierkante centimeter en voeg 48 milliliter vers BHK-celcultuurmedium toe aan de flaconcultuur. De BHK-cellen gedurende twee dagen.
Na twee dagen verzamelt u het kweekmedium en passeert het door een punt van 45 micrometer filter. Bewaar het medium bij min 20 graden Celsius. De muizen erythroïde, myeloïde en lymfatische of EML-cellen die in dit protocol worden gebruikt, worden gekweekt in suspensie in EML-basismedium dat BHK-celcultuurmedium bevat bij 37 graden Celsius en 5%CO2.
Houd de EML-cellen bij een lage celdichtheid met een piekdichtheid van minder dan 600.000 cellen per milliliter. Verdeel de cellen elke twee tot drie dagen met een verhouding van één op vijf passage naar cellen voorzichtig, maar niet meer dan 10 generaties om lijn-positieve cellen te depleteren. Oogst de EML-cellen door centrifugatie bij 200 Gs gedurende vijf minuten.
Was de cellen eenmaal met PBS en centrifugeer opnieuw na het weggegooien van het supernatant. Resuspendeer de cellen in PBS en tel de cellen met een hemo cytometer. Het aantal cellen is nodig voor het bepalen van de antilichaamconcentratie in de volgende stap.
Isoleer de lijn-negatieve of lijn-negatieve cellen met behulp van een lijn-antilichaamcocktail en een magnetisch geactiveerd celsorteringssysteem volgens de instructies van de fabrikant. Om deze procedure te beginnen, draai de lin-negatieve cellen naar beneden bij 200 Gs gedurende vijf minuten. Resuspendeer het cellenpalletje met PBS en tel de cellen met een hemo cytometer.
Was de cellen twee keer met faxbuffer. Na de tweede wassing, pellet de cellen bij 200 Gs gedurende vijf minuten. Label de vijf 1,5 milliliter microcentrifugebuizen met de nummers 1, 2, 3, 4 en vijf respectievelijk.
Resuspendeer de cellen met een geschikt volume aan factsbuffer tot een concentratie van 1 miljoen cellen per 100 microliter. Verdeel vervolgens 100 microliter celsuspensie in elk van de vijf microcentrifugebuizen. Voeg een microgram anti-muis CD 34 FE-antilichaam toe aan buis een en buis twee.
Meng de buizen voorzichtig en incubeer alle buizen gedurende één uur bij vier graden Celsius in het donker. Voeg vervolgens punt 25 microgram PE-geconjugeerd antica-een-antilichaam en 20 microliter van een PC-geconjugeerd lijncocktail toe aan buis één. Voeg punt 25 microgram PE-geconjugeerd antica-een-antilichaam toe aan buis drie en 20 microliter van een PC-geconjugeerd lijncocktail toe aan buis vier.
Meng de buizen voorzichtig en incubeer de cellen gedurende een extra 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Voeg na 30 minuten 300 microliter faxbuffer toe aan alle buizen en centrifugeer de cellen naar beneden bij 200 Gs gedurende vijf minuten.
Was de cellen drie keer met 500 microliter faxbuffer na de laatste wassing. Resuspendeer elk cellenpalletje in 500 microliter faxbuffer en isoleer lijn-negatieve SCA-positieve CD 34-positieve en lijn-negatieve SCA-negatieve CD 34-negatieve cellen in buis één door middel van fluorescence-geactiveerde celsortering. Totaal RNA wordt geëxtraheerd uit de lijn-negatieve CD 34-positieve en lijn-negatieve CD 34-negatieve cellen met behulp van triool en besmette DNA wordt verwijderd met behulp van deoxyribonuclease één.
Volg het protocol van de fabrikant en beoordeel de kwaliteit van het totale RNA met behulp van een bioanalyzer volgens de instructies van de fabrikant. Alleen RNA-monsters met een RNA-integriteitsnummer of RIN van meer dan negen worden gebruikt voor mRNA-extractie en daaropvolgende bibliotheekconstructieprocedures. Deze figuur toont het resultaat van een hoogwaardig RNA-monster met een RIN gelijk aan 9,4. Het protocol voor bibliotheekconstructie dat hier wordt gebruikt, is specifiek voor het Illumina
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van RNA-sequencing om transcriptiefactoren te identificeren die differentieel tot expressie komen in Lin-CD34+ en Lin-CD34- subpopulaties van muis EML-cellen. Inzicht in deze factoren is cruciaal voor het ontrafelen van de mechanismen van zelfvernieuwing en differentiatie in deze cellen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genomics
Achtergrond
- EML-cellen zijn een model voor het bestuderen van het gedrag van hematopoëtische stamcellen.
- Transcriptiefactoren spelen een cruciale rol bij beslissingen over het cellot.
- RNA-sequencing biedt een uitgebreid overzicht van de genexpressie.
- Inzicht in de verschillen tussen Lin-CD34+ en Lin-CD34- cellen kan bijdragen aan stamcelonderzoek.
Doel van de studie
- Het identificeren van belangrijke regulatoren van zelfvernieuwing en differentiatie in muis EML-cellen.
- Het analyseren van de expressie van transcriptiefactoren in verschillende cel-subpopulaties.
- Het verdiepen van het begrip van stamcelbiologie door middel van transcriptomische analyse.
Gebruikte methoden
- Scheiding van lineage-negatieve CD34-positieve en -negatieve EML-cellen op basis van oppervlaktemarkers.
- Isolatie van mRNA uit de gescheiden cellen.
- Conversie van mRNA naar cDNA en voorbereiding van sequencing-libraries.
- High-throughput sequencing van de DNA-library.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van differentieel tot expressie gekomen transcriptiefactoren tussen de twee celpopulaties.
- Inzichten in de regulatoire netwerken die zelfvernieuwing en differentiatie aansturen.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van het gedrag van stamcellen.
- Gegevens die de rol van specifieke transcriptiefactoren bij de lijnvastlegging ondersteunen.
Conclusies
- RNA-sequencering is een krachtige tool voor het analyseren van genexpressie in stamcellen.
- Geïdentificeerde transcriptiefactoren kunnen dienen als doelwitten voor verder onderzoek.
- De bevindingen dragen bij aan een breder begrip van de biologie van hematopoëtische stamcellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het ontleden van de reguleringsmechanismen van zelfvernieuwing en differentiatie in hematopoëtische precursorcellen is cruciaal voor het bevorderen van validatie van targets in een vroeg stadium en het verminderen van risico's bij therapeutische strategieën op basis van stamcellen. RNA-sequencing van EML-cel-subpopulaties maakt een betrouwbare identificatie van transcriptionele regulatoren mogelijk, wat voorspellende besluitvorming in discovery- en translationeel onderzoek ondersteunt. Deze benadering versterkt de prioritering van portfolio's door lineage-commitmentroutes en functionele targets te verduidelijken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematische identificatie mogelijk van transcriptiefactoren die zelfvernieuwing en differentiatie reguleren.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door lijnspecifieke regulatoire netwerken te verduidelijken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via analyse van differentiële genexpressie.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van stamcelgerelateerde targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde celpopulaties voor downstream functionele assays en screeningsplatforms.
- Levert kwantitatieve transcriptomische outputs voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Maakt een robuuste vergelijking mogelijk van compound-effecten op lineage-specifieke genexpressie.
- Ondersteunt schaalbare workflows voor het evalueren van regulatoire factormodulatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt moleculaire bevindingen in lijn met ziekterelevante hematopoëtische modellen.
- Maakt continuïteit mogelijk van transcriptomics in de ontdekkingsfase naar preklinische functionele validatie.
- Informeert de selectie van biomarkers voor lineage-committering en differentisatiestatus.
- Vermindert het translationele risico door targets te verankeren in mechanistische gegevens.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze RNA-seq workflow integreert stappen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie, waardoor er een herbruikbaar platform ontstaat voor het onderzoeken van regulatiemechanismen in hematopoëtische systemen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de hypothese-gestuurde identificatie van belangrijke transcriptionele regulatoren bij beslissingen over het lot van stamcellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genexpressiegegevens voor assay-ontwikkeling en compound-profilering.
- Analytica: Maakt robuuste statistische analyse van differentiële expressie en pathway-verrijking mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen moleculaire inzichten en functionele studies in ziekte-relevante modellen.
- Herbruik op bedrijfsniveau: Vestigt een gestandaardiseerde transcriptomische workflow die toepasbaar is over verschillende celtypen en onderzoeksprogramma's.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van transcriptomische analyses.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en optimaliseert de toewijzing van middelen in de vroege ontdekkingsfase.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van programma's gerelateerd aan stamcellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in cel sortering, RNA-hantering en bio-informatische analyse.
- Vereist toegang tot high-throughput sequencing-platformen en analytische infrastructuur.
- Noodzaakt een strikte standaardisatie van monstervoorbereiding en gegevensverwerking tussen teams.
- Aanpasbaar aan andere lineage-specifieke of ziekterelateerde celmodellen door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van RNA van hoge kwaliteit en gevalideerde sorteringsstrategieën voor betrouwbare resultaten.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
2:09
Preparation of Baby Hamster Kidney (BHK) Cell Culture Medium for Stem Cell Factor Collection
3:25
EML Cell Culture and Depletion of Lineage Positive Cells
4:52
Separation of Lin–CD34+ and Lin–CD34– Cells
7:15
RNA Preparation and Library Construction for High-throughput Sequencing
9:54
Results: RNA-Seq Identifies Transcription Factors that Regulate EML Self-renewal and Differentiation
11:38
Conclusion
