A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties tussen bloed en endotheelcellen te bestuderen met behulp van een nieuwe bloed-endotheelkamertest. Dit wordt bereikt door eerst bloed te verzamelen van een gezonde vrijwilliger door venepunctie in een open systeem. In de tweede stap wordt het bloed voorzichtig op een heparine-oppervlak gecoate bloedkamer aangebracht, gekoppeld aan een op endotheelcelcultuur gebaseerde schuifplaat.

Vervolgens worden deze bloed-endotheelcelkamers voorzichtig geroteerd om de interactie tussen het bloed en de endotheelcellen te vergemakkelijken. Uiteindelijk kunnen de cel-cel interacties tussen het bloed en de endotheelcellen en de resulterende productie van thrombine-antitrombine complex worden beoordeeld door middel van immunofluorescentiemicroscopie en respectievelijk Eliza. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die welke gebruik maken van diermodellen, is dat hier een humaan modelsysteem kan worden gebruikt om vasculaire ziekten te onderzoeken vóór het begin van het experiment.

Koppel een 18 gauge hypodermische naald aan een stukje siliconenbuis met een binnendiameter van twee millimeter, gecoat met heparine-oppervlak. De kunststofoppervlakken zijn gecoat met heparine om onspecifieke activering van coagulatie te voorkomen. Bijvoorbeeld, in deze afbeelding is een stolsel duidelijk zichtbaar in deze ongecoate kamer.

Na 30 minuten bloedcontact, beschermt het behandelen van de kamer met heparine-oppervlak het bloed tegen ongecontroleerde activering, waardoor de resultaten te wijten zijn aan de interacties tussen endotheelcellen en bloed. Pas na het aansluiten van de buis, verzamel voorzichtig een bloedmonster van een gezonde donor door venepunctie in een open systeem in een buis met een heparine-oppervlak van 50 milliliter. Vul het verzamelde bloed aan met ongefractioneerd heparine om een eindconcentratie van 0,75 IU per milliliter te bereiken en draai de buis twee tot drie keer om voor zachtjes mengen.

Voor analyse van de initiële bloedeiwitconcentratie, meng voorzichtig één milliliter bloed per buis in microcentrifugebuizen die 30 microliters van 10 millimolair K drie EDTA bevatten, en plaats de buizen op ijs. Gebruik vervolgens een met heparine-oppervlak gecoate pipettentip om 1,5 milliliter bloed over te brengen in elke bloed-endotheelcelkamer met heparine-oppervlak, zorg ervoor dat het bloed langzaam stroomt en zonder bellen te creëren om activering te voorkomen. Verwijder vervolgens de plastic wanden van de endotheelcelcultuurschuifjes volgens de instructies van de fabrikant, en spoel de endotheelcellen voorzichtig.

Met PBS verplaatsen we zoveel mogelijk van de was van de cellen zonder dat de culturen uitdrogen en plaatsen de schuifjes bovenop de bloedkamers met de cellen naar het bloed gericht. Gebruik vervolgens plastic schuifjes voor extra ondersteuning. Om breuk van de celcultuurschuifjes te voorkomen, plaats een klem om elke bloed-endotheelcelkamer om de schuifjes te beveiligen.

Draai nu de kamers op een draaiende wiel in een waterbad van 37 graden Celsius bij 0,5 Gs gedurende 30 minuten. Na de rotatie, ontmantel de bloed-endotheelcelkamers, was de celcultuurschuifjes in PBS en fixeer de cellen in ijskoud 1% paraldehyde gedurende 10 minuten. Ten slotte, voor evaluatie van de geactiveerde bloedeiwitconcentratie, meng één milliliter bloed van elke kamer in microcentrifugebuizen met 30 microliters van 0,34 molair K drie EDTA, en plaats de buizen maximaal één uur op ijs.

Na het centrifugeren van de cellen, bewaar het plasma in nieuwe microcentrifugebuizen bij min 70 graden Celsius tot verdere analyse. Activering van de coagulatiefactoren vindt waarschijnlijker plaats in stilstaand bloed, omdat de kans op een interactie tussen de geactiveerde factoren toeneemt. Inderdaad, het volume van bloed zonder enige beweging door luchtbellen is twee en een half keer groter.

Wanneer 1,75 milliliter bloed aan de kamer wordt toegevoegd in vergelijking met wanneer 1,5 milliliter bloed wordt gebruikt, suggereren de gemeten thrombine-antitrombine waarden een verhoogde thrombine-antitrombine vorming met een verhoogd bloedvolume. Interessant is dat wanneer ve worden geïncubeerd met een van beide volumes vol bloed, er geen verschillen worden opgemerkt tussen de twee groepen, wat suggereert dat de endotheelcellen de activering van de coagulatie kunnen moduleren om het effect van TNF-alfa op leukocytenrekrutering te bestuderen. In dit experiment werden qve behandeld met 20 nanogram per milliliter van TT NF-alfa vier uur vóór bloedcontact, waarna het aantal CD 16 positieve cellen werd gekwantificeerd.

Rekrutering van de CD 16 positieve cellen nam significant toe met TNF-alfa-behandeling van 100 naar 256 CD 16 positieve cellen per vierkante millimeter en 1,5 liter bloed, en van 172 naar 378 en 1,75 milliliter bloed. De vorming van de thrombine-antitrombine complexen werd vervolgens gemeten in de corresponderende plasmamonsters van het bloed dat werd geïncubeerd met of TNF-alfa-behandelde of onbehandelde cellen. Zoals verwacht, induceerden de TNF-alfa-gestimuleerde cellen een verdubbeling van de thrombine-antitrombine complexen in vergelijking met de onbehandelde controles na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek zal de weg banen voor onderzoekers op het gebied van immunologie om onderzoek, complement en coagulatie in een in vitro model te verkennen met behulp van humane primaire cellen en menselijk volbloed.