Name: A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Ontdek een nieuw bloed-endotheelkamerassay om interacties tussen menselijk volbloed en endotheelcellen te bestuderen. Deze methode maakt onderzoek naar stolling en immuunreacties in vasculaire biologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Zweedse Research Council (90293501, A0290401, A0290402), zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap in het kader subsidieovereenkomst n ° 602699 (DIREKT), de NovoNordisk Foundation, de Gurli en Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapie, Vleugel Foundation en Åke Wiberg Foundation.

OPMERKING: Bloed werd van gezonde individuen door open systeem venapunctie in goedkeuring bij de Ethical Review Board in Uppsala (Permit No. 2008/264). 1. Zaaien Cellen <ol><li> Cultuur primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) bij 37 ° C in 5% CO2 in T75 kolven bekleed met 1% gelatine in PBS pH 7,4. </li><li> Verwijderen kweekmedium een ​​T75 kolf die HUVEC (of andere soort primaire humane endotheelcellen) en was de cellen met 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Los cellen door toevoeging van 1 ml 0,25% trypsine-EDTA en incubatie gedurende 2 - 3 min bij 37 ° C. </li><li> Verzamel cellen door de kolf te spoelen met 9 ml 10% FBS in PBS pH 7,4 en breng de celsuspensie aan een 15 ml buis. Spin down de cellen bij 735 g gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet zorgvuldig endotheliale celgroei medium microvasculaire (EG GMMV) en tel de cellen in een Bürker kamer. Zaad 21.000 cel / cm 2 in 1 putjes celkweek glijbanen en incubeer bij 37 ° C. De HUVEC wordt confluent na 1-2 dagen van de cultuur. Bewaken van de celmorfologie en confluentie dagelijks onder een lichtmicroscoop. </li></ol> 2. Voorbereiding van volbloed <ol><li> Bereid alle kunstmatige oppervlakken die in contact komen met bloed met een dubbele laag geïmmobiliseerd heparine (CHS) volgens de instructies van de fabrikant. CHS beklede materialen stofdicht kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 6 maanden zonder verlies van functie. </li><li> Gebruik open systeem venapunctie om bloed van een gezonde donor kort (&lt;30 min) te tekenen voordat het bloed endotheliale kamer experiment. Koppel een injectienaald (18 G x 50 mm) om CHS gecoat siliconenslang (binnendiameter: 2 mm) vóór zorgvuldig verzamelen bloed in een CHS gecoat 50 ml tube. Supplement bloed met ongefractioneerde heparine tot een eindconcentratie van 0,75 IU / ml bereikt. Meng het bloed zachtjes door inverting de buis 2 - 3 keer. </li></ol> 3. Bloed endotheliale Chamber Model <ol><li> Fabriceren bloed kamers (Figuur 1A; bovenaanzicht) in acryl polymethylmethacrylaat (PMMA), bestaande uit twee cilinders (hoogte 8 mm en radius 9 mm) die zijn gelijmd op een PMMA slide (25 x 75 mm). Breng de randen van de cilinders naar boven met rubberen O-ringen de bloedkamer dichten tegen de objectglaasjes met gekweekte endotheelcellen (Figuur 1B). Draai het bloed kamers verbonden met de cultuur dia met endotheelcellen vervolgens in verticale positie (figuur 1C). </li><li> Gebruik een CHS gecoat pipettip tot 1,5 ml bloed zetten in elk CHS gecoat kamer verzorgen het bloed niet te activeren. </li><li> Breng 1 ml bloed in microcentrifuge buisjes die 30 pl 0,34 MK 3 EDTA tot een eindconcentratie van 10 mM K 3 EDTA bereiken voor bepaling van initiële plasma eiwitconcentraties gebruikeen enzym gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Meng zorgvuldig het bloed en houdt de buizen op ijs. </li><li> Verwijder de plastic wanden van de celkweek objectglaasjes volgens de instructies van de fabrikant en zorgvuldig was de cellen in PBS pH 7,4. Zorg ervoor dat vervolgens zoveel vloeistof verwijderen mogelijk van de objectglaasjes. Laat de cellen uitdrogen. </li><li> Plaats het preparaat op de bloed kamers met cellen naar het bloed. Zet de schuif door het plaatsen van een klem om het bloed van endotheelcellen kamer. Een kunststof glijbaan voor aanvullende ondersteuning breuk van de celkweek objectglaasje te voorkomen bij het plaatsen van de klem. </li><li> Bevestig het bloed endotheelcel kamer op een roterend wiel (40 cm diameter) plaats in een 37 ° C waterbad. Draai elke kamer op het wiel bij 0,5 g gedurende 30 min. </li><li> Na incubatie, ontmantelen de bloed endotheelcellen kamer. Was de celcultuur slides in PBS pH 7,4 en bevestig de cellen in ijskoud 1% paraformaldehyde (PFA) fof 10 min. Breng 1 ml bloed uit elke kamer naar microcentrifuge buisjes met 30 pl 0,34 MK 3 EDTA tot een eindconcentratie van 10 mM K 3 EDTA bereiken en meng de buizen voorzichtig. Houd de buizen op ijs. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 4560 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het bloedplasma nieuwe microcentrifuge buizen en bewaar -70 ° C tot verdere analyse. </li></ol> 4. Analyse van Blood endotheliale Interacties <ol><li> Voer immunofluorescente kleuring met muis anti-humaan CD16, gevolgd door secundaire geit anti-muis Alexa 488 en phalloidin-TexasRed. Voer elke stap kleuring gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en het wassen van de objectglaasjes in PBS pH 7,4 tussen elke stap. Tegenkleuring de kernen met DAPI gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Analyseer bloedcomponenten aan de endotheelcellen gebonden met behulp van fluorescentie microscopie in combinatie met beeldanalyse met behulp van geschikte software voor beeldanalyse zoals CellProfiler. </li><li> Quantify de reacties in het bloedcompartiment met trombine-antitrombine (TAT) ELISA volgens de instructies van de plasmamonsters fabrikant. </li><li> Gebruik geschikte statistische instrumenten, bijv., Een ongepaarde t-test, om de gegevens te analyseren. </li></ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Meerdere interacties tussen bloed en vaatwand worden normaal gehouden in een rusttoestand door niet hechtende en antitrombotische aard van het endotheel. 7 tijdens pathologische aandoeningen waarbij ontsteking is het endotheel geactiveerd met een resulterende toename van hechting receptor expressie en 8 een verminderd vermogen om te remmen hemostase. 9 Activering van de cascade in het bloed beurt versterkt de trombogeniciteit van het endotheel waardoor verdere trombose en rekrutering van leukocyten. 10 Voor een beter begrip te krijgen van deze delicate interacties tussen endotheliale cellen en bloed, we ontwikkelde een nieuwe in vitro werkwijze waarbij gekweekte endotheelcellen in contact met bloed worden geplaatst. Voor zover wij weten ons setup eerste endotheelcellen volledig menselijk bloed met geen of zeer weinig antistollingsmiddel voor langere tijd. nt &quot;&gt; De gevoeligheid van het systeem wordt ingeschakeld open systeem venapunctie in combinatie met een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine op alle oppervlakken in contact met bloed. Het gebruik van een open tijdens bloed verkrijgen vermindert de activering van de cascade systemen tijdens venapunctie terwijl die het gebruik van een zelf bepaalde hoeveelheid anticoagulant. handel verkrijgbare geëvacueerd bloed buizen kunnen echter worden gebruikt, afhankelijk van het beoogde eindpunt van de studie. De eindconcentratie van anticoagulans toegevoegd meeste commercieel beschikbare gesloten systeem buizen kunnen gevoelig remmen en anders moeilijk te bestuderen, interacties in de setup. 6 een beschermende heparine oppervlak voorkomt verdere activering van bloed door oppervlaktecontact door anderen dan de endotheelcellen oppervlakken. 5 inderdaad incubatie van bloed aangevuld met een kleine hoeveelheid ongefractioneerde heparine kamer zonder de bescherming van CHS gevolg stolselvorming. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; De luchtbel in de kamer maakt het mengen van het bloed tijdens incubatie met de endotheelcellen. Om het effect van de omvang luchtbel beoordelen, gebruikten we twee verschillende bloedvolume. In dit model, maten we vergelijkbare TAT niveaus ongeacht luchtbelgrootte in kamers geïncubeerd met HUVEC. TAT werd echter verhoogd met een kleine luchtbel grootte in de volledig CHS behandelde kamers. Dit, overeenkomstig de eerder beschreven endotheliale cellen te 11 geeft een regulerend effect op de verhoogde activering van de stolling door de endotheliale cellen die ontbreekt in de inerte CHS kamer. De luchtbel in het systeem een ​​stroom bij rotatie van de kamer. De grootte van de bel invloed krachten in dit draaisysteem. Dit blijkt uit onze resultaten in figuur 2D waren een kleinere bubbel creëert hogere TAT waarden die een verminderde werking na het bloed dwz, het bloed bewegingbinnen de kamer lager en daardoor activering van de cascade systeem optreedt in hogere mate. Opgemerkt zij dat in dit systeem creëren we een roterende stroming die verschillende snelheid wordt in de kamer met de hoogste snelheid langs de wanden en het laagste in het midden. Dit is duidelijk geen optimale milieu voor stroming en afschuifspanning voor endotheelcellen, maar hebben we een systeem produceert stabiele en reproduceerbare resultaten. Optimalere omstandigheden zou omvatten circulerende laminaire stroming in de afwezigheid van turbulentie. Dit is echter niet mogelijk het model vertegenwoordigd hier en onze kennis dergelijk systeem niet bijgewerkt. Hoewel er verschillende microfluïdische systemen commercieel beschikbaar die onmogelijk te combineren met volbloed met geen of lage anticoagulans toegevoegd aan het systeem daardoor niet goed gevoelige beoordeling van de interactie mogelijk tussen alle componenten aanwezig in bloed en endotheelcellen. Verder is er een 2-voudige toename rekrutering van bloedcellen naar TNFa geactiveerde HUVEC in combinatie met een verdubbelde vorming van TAT onafhankelijk van het bloedvolume. Dit verifieert stabiliteit van het modelsysteem en toont ook de mogelijkheid om een ​​geactiveerd endotheel in combinatie met volbloed. Toekomst op het bloed endotheelcel kamer worden gebruikt bloedcellen rekrutering naar geactiveerde endotheelcellen onderzocht door een verscheidenheid van merkers uitgedrukt op cellen onder verschillende omstandigheden en fasen van activatie. Verder kan het model worden gebruikt in combinatie met farmacologische middelen om de effecten van inflammatoire te evalueren. Samengevat, laten we het grote voordeel van het combineren van een kamer model met menselijk bloed en vasculaire cellen volledig menselijke in vitro systeem om relevante onderzoeken van vaatziekten met uitgevonden.

Methoden voor het analyseren van bloed-vasculaire interacties in hart-en vaatziekten in het algemeen onderzoek dierproeven te betrekken. Resultaten die in experimenteel onderzoek diermodellen kunnen echter weinig of geen gevolgen voor de menselijke ziekte. 1,2 Zodoende is er behoefte aan goede en betrouwbare in vitro modellen cellulaire interacties tussen het bloedcompartiment en vasculaire endotheelcellen in onderzoeken een humaan-achtig systeem. We hebben hiertoe een systeem van bloed endotheelcellen kamermodel. Deze is gebaseerd op een eerder beschreven model gebruikt om de interacties tussen biomaterialen en humaan totaal bloed onderzoeken. 3 tegenstelling tot andere in vitro opstellingen waar gewoonlijk beperkt aantal gezuiverde componenten, dwz trombocyten, leukocyten of endotheelcellen zijn, de onderhavige model omvat alle de bestanddelen van een bloedvat. De opzet van het bloed endotheliale cell kamermodel is ontworpen om het gebruik van vers getrokken menselijk bloed met weinig of geen toegevoegde antistollingsmiddel in te schakelen. Bloed opgeslagen tijdens langere perioden verwerven zogenaamde storage laesies waar afbraak van erytrocyten kan interfereren met delicate interacties tussen bloed en endotheelcellen. 4 Om stolselvorming tijdens hanteren van bloed ex vivo voorkomen vereist bij hoge doses anticoagulantia of dat al het materiaal in contact met bloed niet-activerende zijn. Als niet-activerende oppervlakken zijn zeldzaam in de laboratoriumomgeving, kunnen materialen ook worden uitgerust met een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine. Een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine (hierna Corline heparine oppervlak (CHS)) die kunnen worden toegepast op de meeste materialen waardoor een oppervlak waar bloedcontact kunnen optreden zonder dat een activering van de stollingscascade. 5 Aldus, door de inrichting van de kamers met CHS, het bloed endotheliale cell kamermodel maakt gebruik van zeer lage concentraties van antistollingsmiddel in het bloed. Het vermijden van de toevoeging van hoge concentraties van antistollingsmiddel in het bloed endotheliale kamer model kunnen gevoelige interacties binnen een bloedvat die anders gemaskeerd bestuderen. 6 Het bloed endotheliale celkamer model bestaat uit twee kamers gevormd door toevoeging van plastic cylinders (hoogte: 8 mm, radius: 9 mm) op een kunststof microscoopglaasje. De randen naar boven op de cilinders zijn voorzien van groeven die zijn voorzien van rubberen O-ringen voor het afdichten van de kamers tegen de celkweek dia. De kamers worden slechts gedeeltelijk gevuld met bloed de lucht in de kamer blijft bloed in beweging wanneer de kamers vervolgens in een verticale positie (figuur 1) wordt geroteerd. Om de functionaliteit van het model te evalueren, voerden we experimenten met hetzij een volledig CHS gecoatkamer of humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Twee afzonderlijke volumes bloed werden getest en de vorming van trombine antitrombine (TAT) complexen (indirecte marker van coagulatie) werd bepaald met enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Vervolgens hebben we onderzocht het effect van bloedvolume en tumor necrosis factor (TNFa) gestimuleerde endotheelcellen leukocyt rekrutering door beeldanalyse. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Instellen van het bloed van endotheelcellen kamermodel. (A) Bovenaanzicht schematische tekening van het bloed kamer gemaakt in PMMA. (B) Primaire humane endotheelcellen zijn gekweekt op 1-goed kamer slides. Vers humaan totaal bloed twee kamers toegevoegd op een microscoopglaasje. De kamers en alle materialen die bij het hanteren van het bloed behandeld met een beschermende coating HS. Nadat de wanden van het cell cultuur schuif, worden de cellen geplaatst tegenover het bloed en het systeem wordt dichtgeklemd. (C) Het bloed endotheelcel kamers worden vervolgens geïncubeerd onder draaien bij 37 ° C. Daarna kunnen de reacties in het bloedcompartiment geanalyseerd door ELISA en de endotheelcellen kan worden geanalyseerd door microscopie.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Elke andere vorm van primaire humane endotheelcellen mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Bereid 1% gelatine in PBS, incubeer 5 ml in een T75 gedurende 15 minuten en verwijder voor het kweken van cellen.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Verdunning 10 μg/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber kan worden vervaardigd in PMMA of een andere kunststof die in staat is om CHS te binden</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Grootte: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Bereid een 0.34 M stamoplossing in milliQ H2O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Beschikbaar gratis op www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

De meerderheid van deze ziekten gepaard gaan met aandoeningen van het cardiovasculaire systeem. Studies naar de complexiteit van de interactie responsen tijdens cardiovasculaire pathologieën geactiveerd worden echter beperkt door het gebrek aan sterke en fysiologisch relevante methoden. Om modelleren pathologische vasculaire gebeurtenissen hebben we een in vitro assay voor het bestuderen van de interactie tussen endotheel en volbloed ontwikkeld. De test bestaat uit primaire humane endotheelcellen, die in contact met menselijk volledig bloed worden geplaatst. De werkwijze gebruikt natieve bloed geen of zeer weinig anticoagulans, waardoor onderzoek delicate interacties tussen moleculaire en cellulaire componenten aanwezig in een bloedvat. We onderzochten functionaliteit van de test door het vergelijken coagulatie door verschillende volumes bloed geïncubeerd met of zonder menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC). Overwegende dat een groter bloedvolume bijgedragen aaneen toename van de vorming van trombine antitrombine (TAT) complexen, aanwezig HUVEC resulteerde in verminderde coagulatie. Bovendien pasten wij beeldanalyse van leukocyt hechting aan HUVEC gestimuleerd met tumornecrosefactor (TNFa) en vond de aanwezigheid van CD16 + cellen significant hoger op TNFa gestimuleerde cellen in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen na contact met bloed zijn. Concluderend kan de assay worden toegepast op vasculaire pathologieën, waarbij interacties tussen het endotheel en het bloedcompartiment worden verstoord bestuderen.

De noodzaak van CHS Coating Om reacties in volbloed specifiek zijn voor die opgewekt door de endotheelcellen gemeten, moeten alle voor bloed endotheliale celkamer materialen worden geleverd met een CHS coating voor gebruik. Figuur 2A (links) toont een onbekleed kamer na 30 min bloedcontact met een duidelijk zichtbare stolsel aanwezig. Behandelen van de kamer met CHS (Figuur 2A, rechts) daarentegen beschermt de bloed ongecontroleerde activering, zodat de resultaten door de endotheliale cel-interacties bloed. Het effect van de Blood Volume in de Kamer Coagulatie waarschijnlijker in stilstaand bloed de kans op interactie tussen geactiveerde stollingsfactoren verhoogd. In het bloed endotheelcel kamermodel wordt bloed in beweging gehouden door de circulatie van een luchtbel in de kamer. In oestellen het effect van veranderingen in het bloedvolume luchtbelgrootte bepalen, en dus ook, werd een CHS bekleed kamer verbonden met een CHS beklede glazen dia die werd getest met 1,5 ml of 1,75 ml bloed gedurende 30 min. Het volume van bloed zonder enige beweging van de luchtbel is 2,5 keer groter wanneer 1,75 ml bloed toegevoegd aan de kamer vergelijking met wanneer 1.5 ml van het bloed wordt gebruikt (figuur 2B). De gemeten TAT-waarden stelde verhoogd TAT-formatie met verhoogde bloedvolume (figuur 2D). Wanneer HUVEC (Figuur 2C) werden geïncubeerd met ofwel 1,5 of 1,75 ml volbloed werd geen verschil waargenomen tussen de twee groepen, wat suggereert dat endotheelcellen coagulatie (figuur 2D) kunnen moduleren. Het effect van TNF op Bloedcel Werving en coagulatie Om het effect van TNF op leukocyt rekrutering te onderzoeken, werden HUVEC traktatieed met 20 ng / ml TNFa 4 uur vóór bloedcontact. Bloedcontact - met ofwel 1,5 ml of 1,75 ml bloed - werd voortgezet gedurende 30 min waarna de kweek glaasjes werden gekleurd voor CD16 (Figuur 2F), afgebeeld en het aantal CD16 + cellen werd gekwantificeerd. De werving van CD16 + cellen significant toe met TNFa behandeling (figuur 2E) 100-256 CD16 + cellen / mm 2 (p &lt;0,0001) met 1,5 ml bloed en 172-378 (p &lt;0,0001) met 1.75 ml bloed. De vorming van TAT complexen werd gemeten in de overeenkomstige plasmamonsters van het bloed geïncubeerd met ofwel TNFa behandelde of onbehandelde cellen (figuur 2G). TNFa gestimuleerde cellen induceerde ongeveer een verdubbeling van TAT complexen in vergelijking met onbehandelde cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Vijgure 2: Functionaliteit van het bloed van endotheelcellen kamermodel. (A) Chambers met of zonder CHS werden geïncubeerd met volbloed. Zonder CHS, werd een stolsel gevormd na 30 min. Meting van trombine-antitrombine (TAT) complexen, een indirecte marker van stolling in het bloed geïncubeerd zonder CHS was&gt; 6000 ug / ml. (B) Het volume van het bloed niet in beweging gehouden door de roterende luchtbel zal variëren met verschillende bloed volumes. Met de toevoeging van 1,5 ml bloed, dit volume 0,3 ml, dat het zal toenemen tot 0,74 ml onder toevoeging van 1,75 ml. (C) HUVEC afgebeeld met fasecontrastmicroscopie tonen kenmerkende endotheelcellen morfologie van een confluente monolaag vóór bloedcontact. (D) TAT waarden voor volledig CHS gecoate kamers tonen een klein verschil wanneer verschillende bloed volumes worden toegevoegd. De toevoeging van 1,5 ml bloed resulteerde in 35 ± 11 pg / ml (n = 7) in vergelijking met 1,75 ml, waardoor 8577; 70 ug / ml TAT (n = 8). Dit verschil is niet meer aanwezig als HUVEC worden geïncubeerd met dezelfde bloedvolume; 66 ± 55 pg / ml 1,5 ml (n = 5) en 66 ± 29 pg / ml 1,75 ml (n = 7). (E) Kwantificering van het aantal CD16 + cellen aanwezig op zowel gestimuleerde TNFa of gestimuleerde HUVEC na bloedcontact. Het aantal CD16 + cellen is aanzienlijk toegenomen met TNF gestimuleerde cellen geïncubeerd ofwel met 1,5 ml (basaal: 100 ± 40 cellen / mm; TNFa: 256 ± 121 cellen / mm) of 1,75 ml (basaal: 172 ± 67 cellen / mm; TNFa: 378 ± 185 cellen / mm) van volbloed (F) Vertegenwoordiger beelden van gestimuleerde en TNF gestimuleerde HUVEC gekleurd voor phalloidin (red), CD16 (groen) en DAPI (blauw).. Schaal bar = 250 urn (G) De vorming van TAT complexen ruwweg verdubbeld door TNFa gestimuleerde cellen in vergelijking met onbehandelde cellen geïncubeerd met bloed (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 maal meer TAT, n = 3; 1.75 ml: 1,7 ± 1,0 maal TAT, n = 4). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaard deviatie; p-waarden werden berekend door de ongepaarde t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

De toegankelijkheid van betrouwbare modellen om vasculaire bloedinteracties bij mensen te onderzoeken ontbreekt. We presenteren een in vitro model van gekweekte primaire humane endotheelcellen gecombineerd met menselijk volbloed om cellulaire interacties zowel in het bloed (ELISA) als in het vasculaire compartiment (microscopie) te onderzoeken.

A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties tussen bloed en endotheelcellen te bestuderen met behulp van een nieuwe bloed-endotheelkamertest. Dit wordt bereikt door eerst bloed te verzamelen van een gezonde vrijwilliger door venepunctie in een open systeem. In de tweede stap wordt het bloed voorzichtig op een heparine-oppervlak gecoate bloedkamer aangebracht, gekoppeld aan een op endotheelcelcultuur gebaseerde schuifplaat.Vervolgens worden deze bloed-endotheelcelkamers voorzichtig geroteerd om de interactie tussen het bloed en de endotheelcellen te vergemakkelijken. Uiteindelijk kunnen de cel-cel interacties tussen het bloed en de endotheelcellen en de resulterende productie van thrombine-antitrombine complex worden beoordeeld door middel van immunofluorescentiemicroscopie en respectievelijk Eliza. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die welke gebruik maken van diermodellen, is dat hier een humaan modelsysteem kan worden gebruikt om vasculaire ziekten te onderzoeken vóór het begin van het experiment.Koppel een 18 gauge hypodermische naald aan een stukje siliconenbuis met een binnendiameter van twee millimeter, gecoat met heparine-oppervlak. De kunststofoppervlakken zijn gecoat met heparine om onspecifieke activering van coagulatie te voorkomen. Bijvoorbeeld, in deze afbeelding is een stolsel duidelijk zichtbaar in deze ongecoate kamer.Na 30 minuten bloedcontact, beschermt het behandelen van de kamer met heparine-oppervlak het bloed tegen ongecontroleerde activering, waardoor de resultaten te wijten zijn aan de interacties tussen endotheelcellen en bloed. Pas na het aansluiten van de buis, verzamel voorzichtig een bloedmonster van een gezonde donor door venepunctie in een open systeem in een buis met een heparine-oppervlak van 50 milliliter. Vul het verzamelde bloed aan met ongefractioneerd heparine om een eindconcentratie van 0,75 IU per milliliter te bereiken en draai de buis twee tot drie keer om voor zachtjes mengen.Voor analyse van de initiële bloedeiwitconcentratie, meng voorzichtig één milliliter bloed per buis in microcentrifugebuizen die 30 microliters van 10 millimolair K drie EDTA bevatten, en plaats de buizen op ijs. Gebruik vervolgens een met heparine-oppervlak gecoate pipettentip om 1,5 milliliter bloed over te brengen in elke bloed-endotheelcelkamer met heparine-oppervlak, zorg ervoor dat het bloed langzaam stroomt en zonder bellen te creëren om activering te voorkomen. Verwijder vervolgens de plastic wanden van de endotheelcelcultuurschuifjes volgens de instructies van de fabrikant, en spoel de endotheelcellen voorzichtig.Met PBS verplaatsen we zoveel mogelijk van de was van de cellen zonder dat de culturen uitdrogen en plaatsen de schuifjes bovenop de bloedkamers met de cellen naar het bloed gericht. Gebruik vervolgens plastic schuifjes voor extra ondersteuning. Om breuk van de celcultuurschuifjes te voorkomen, plaats een klem om elke bloed-endotheelcelkamer om de schuifjes te beveiligen.Draai nu de kamers op een draaiende wiel in een waterbad van 37 graden Celsius bij 0,5 Gs gedurende 30 minuten. Na de rotatie, ontmantel de bloed-endotheelcelkamers, was de celcultuurschuifjes in PBS en fixeer de cellen in ijskoud 1% paraldehyde gedurende 10 minuten. Ten slotte, voor evaluatie van de geactiveerde bloedeiwitconcentratie, meng één milliliter bloed van elke kamer in microcentrifugebuizen met 30 microliters van 0,34 molair K drie EDTA, en plaats de buizen maximaal één uur op ijs.Na het centrifugeren van de cellen, bewaar het plasma in nieuwe microcentrifugebuizen bij min 70 graden Celsius tot verdere analyse. Activering van de coagulatiefactoren vindt waarschijnlijker plaats in stilstaand bloed, omdat de kans op een interactie tussen de geactiveerde factoren toeneemt. Inderdaad, het volume van bloed zonder enige beweging door luchtbellen is twee en een half keer groter.Wanneer 1,75 milliliter bloed aan de kamer wordt toegevoegd in vergelijking met wanneer 1,5 milliliter bloed wordt gebruikt, suggereren de gemeten thrombine-antitrombine waarden een verhoogde thrombine-antitrombine vorming met een verhoogd bloedvolume. Interessant is dat wanneer ve worden geïncubeerd met een van beide volumes vol bloed, er geen verschillen worden opgemerkt tussen de twee groepen, wat suggereert dat de endotheelcellen de activering van de coagulatie kunnen moduleren om het effect van TNF-alfa op leukocytenrekrutering te bestuderen. In dit experiment werden qve behandeld met 20 nanogram per milliliter van TT NF-alfa vier uur vóór bloedcontact, waarna het aantal CD 16 positieve cellen werd gekwantificeerd.Rekrutering van de CD 16 positieve cellen nam significant toe met TNF-alfa-behandeling van 100 naar 256 CD 16 positieve cellen per vierkante millimeter en 1,5 liter bloed, en van 172 naar 378 en 1,75 milliliter bloed. De vorming van de thrombine-antitrombine complexen werd vervolgens gemeten in de corresponderende plasmamonsters van het bloed dat werd geïncubeerd met of TNF-alfa-behandelde of onbehandelde cellen. Zoals verwacht, induceerden de TNF-alfa-gestimuleerde cellen een verdubbeling van de thrombine-antitrombine complexen in vergelijking met de onbehandelde controles na de ontwikkeling ervan.Deze techniek zal de weg banen voor onderzoekers op het gebied van immunologie om onderzoek, complement en coagulatie in een in vitro model te verkennen met behulp van humane primaire cellen en menselijk volbloed.

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

Dit protocol beschrijft een uitgebreide hemocompatibiliteitsevaluatie van bloedcontactapparatuur met behulp van lasergesneden neurovasculaire implantaten. Een flow loop model met vers, gehepariniseerd menselijk bloed wordt toegepast om de bloedstroom na te bootsen. Na perfusie worden verschillende hematologische markers geanalyseerd en vergeleken met de waarden die direct na de bloedafname zijn opgedaan voor hemocompatibiliteitsevaluatie van de geteste apparaten.

Hemocompatibiliteittesten van bloedcontactimplantaten in een Flow Loop-model dat menselijke bloedstroom nabootst

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier gepresenteerd is een protocol voor een gestandaardiseerd in vitro hemodynamic loop model. Dit model maakt het mogelijk om de hemocompatibiliteit van perfusiebuizen of vasculaire stents te testen in overeenstemming met ISO (International Organization for Standardization) norm 10993-4.

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

Ontdek een nieuw bloed-endotheelkamerassay om interacties tussen menselijk volbloed en endotheelcellen te bestuderen. Deze methode maakt onderzoek naar stolling en immuunreacties in vasculaire biologie mogelijk.

A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

Meer video's verkennen