De Infiltratie-centrifugeren Techniek voor de extractie van apoplastische Fluid uit bladeren van de planten met behulp van Phaseolus vulgaris Als een voorbeeld

Het doel van deze procedure is om de extractie van aplastisch vloeistof uit plantenbladeren te demonstreren met behulp van de infiltratie-centrifugeringstechniek. Dit wordt bereikt door eerst een blad in infiltratievloeistof onder te dompelen en vervolgens met behulp van een verschildruk dat door een spuit of vacuümpomp wordt gegenereerd, volledig te infiltreren. De tweede stap is om het blad voor te bereiden op centrifugering met behulp van een ondersteunend apparaat.

Vervolgens wordt het blad zachtjes gecentrifugeerd om het APO plast wasvloeistof te verkrijgen. De laatste stap is het bepalen van de APO plast verdunningsfactor en het bepalen van de kwaliteit van het alast wasvloeistof. Uiteindelijk wordt de infiltratie-centrifugeringstest gebruikt om representatieve APO plast monsters te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstream-analyses.

Het grote voordeel van deze techniek boven andere bestaande methoden is dat het eenvoudig is om te optimaliseren voor verschillende bladtypen om bovenste plus monsters te verkrijgen met minimale besmetting met cytoplasmatische verbindingen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op gebieden zoals plantenfysiologie en interacties tussen planten en microben, waar het belangrijk is om te begrijpen hoe de samenstelling van de APL's varieert tussen planten en verandert onder verschillende fysiologische omstandigheden of stress. Als eerste stap, neem veiligheidsmaatregelen door een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril te dragen.

Bereid vervolgens een volume gedistilleerd water voor om het bladmonster in te dompelen. Houd een scheermes klaar om een monster te verzamelen, in dit geval een blad van de bonencultivar tender green. Plaats het scheermes tegen de pet van een blad en bevestig het blad van de plant.

Na het verzamelen, dompel het vers afgesneden blad in gedistilleerd water om oppervlakteverontreinigingen van het blad te verwijderen. Gebruik vervolgens absorberend weefsel of papier om het blad voorzichtig droog te deppen. Meet het bladgewicht voordat u doorgaat met infiltreren.

Dit zal later helpen bij het benaderen van het infiltratievolum. Begin het infiltratieproces met een spuit van 60 milliliter. Met de plunjer verwijderd, rolt u het blad voorzichtig in de spuit.

Vul vervolgens de spuit met infiltratievloeistof. Hier wordt gedistilleerd water gebruikt. Plaats de plunjer en draai de spuit om alle lucht erin te verwijderen.

Let op de kleur van het blad voor latere vergelijking. Beweeg de plunjer naar de 40 milliliter markering met behulp van een klein stukje para param. Bedek de spuitpunt.

Trek vervolgens de plunjer naar de 60 milliliter markering om negatieve druk te creëren. Draai de spuit om luchtbellen van het bladoppervlak te laten ontsnappen. Breng de plunjer langzaam over ongeveer twee seconden terug naar de startpositie.

Ontdek de spuitpunt en laat eventuele lucht ontsnappen. Bedek vervolgens de punt opnieuw en druk op de plunjer om een bescheiden hoeveelheid positieve druk te creëren. Blijf negatieve druk toepassen, lucht uit de mond stuwen en positieve druk toepassen totdat het blad volledig is geïnfiltreerd.

Een teken van volledige infiltratie is de verduisterde kleur van de geïnfiltreerde gebieden. Zodra dit wordt gezien, verwijdert u het blad uit de spuit. Dep het blad voorzichtig met absorberend papier om vloeistof van het oppervlak te verwijderen.

Meet vervolgens het gewicht van het geïnfiltreerde blad, en een alternatieve infiltratiemethode gebruikt een vacuümfles. Verzamel opnieuw een blad en spoel het af in gedistilleerd water. Meet na het droogblazen het bladgewicht.

Verkrijg een zijarmfles met een minimale inhoud van 250 milliliter. Plaats het blad in de fles en bedek het met gedistilleerd water. Plaats vervolgens een stop in de fles en bevestig een vacuümpomp aan de zijarm.

Breng een vacuüm aan op de fles lang genoeg om een druk te bereiken. Ongeveer 650 millimeter kwik. Roer de fles voorzichtig om luchtbellen uit het blad vrij te maken terwijl het onder verminderde druk staat.

Laat vervolgens het vacuüm voorzichtig en langzaam over een periode van ongeveer 10 seconden los. Herhaal het proces van het aanbrengen van een vacuüm, roeren van de fles en het loslaten van het vacuüm totdat het blad volledig is geïnfiltreerd. Een teken van volledige infiltratie is de verduisterde kleur van de geïnfiltreerde gebieden.

Verwijder het volledig geïnfiltreerde blad uit de fles en dep het blad voorzichtig met absorberend papier. Om vloeistof van het oppervlak te verwijderen, meet u het gewicht van het geïnfiltreerde blad om de benadering van het infiltratievolum te bepalen. Nadat een blad volledig is geïnfiltreerd, bereidt u het voor op centrifugatie.

Leg een stuk parafilm van vier inch breed neer. Leg het blad op de parafilm. Rol vervolgens het blad op met behulp van een pipettentip van vijf milliliter in de parafilm.

Neem een 20 milliliter spuitlichaam met de plunjer verwijderd en steek de opgerolde blad met de pipettentip erin. Plaats eventuele gesneden bladranden en richting de plunjerkant. Verkrijg een 50 milliliter polyethyleen of polycarbonaat buis en steek de spuit erin.

Gebruik een centrifuge met een slingerbekkenrotor. Laad de buis met het geïnfiltreerde blad en centrifugeer bij vier graden Celsius en 1000 G gedurende 10 minuten. Controleer na de centrifugatie het blad om te bepalen of het grootste deel van de infiltratievloeistof is verdreven.

De centrifugeerbuis bevat nu hersteld APO plast wasvloeistof, ga verder door het herstelde alast wasvloeistof in verse 1,5 milliliter buisjes te pipetten. Plaats de APO plast wasvloeistof monsters in de centrifuge en draai met 15.000 G gedurende vijf minuten om eventuele cellen of deeltjes te verwijderen. Na centrifugatie, pipet de supinate in verse buisjes.

Bewaar de monsters op ijs totdat ze