Name: Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een fluorescerende assay voor PAD4-activiteit met behulp van een pro-fluorescerend substraatanaloog. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor het meten van enzymatische conversie van arginine naar citrulline.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het startpakket van de Lehigh University. We danken Dr. Walter Fast voor het verstrekken van het GST-PAD4 plasmide voor eiwitexpressie.

1. PAD4 Transformatie, Expressie en zuivering <ol><li> Voor PAD4 Transformatie, transformeren de pGEX plasmide dat PAD4 GST fusie in chemisch competente E. Coli (BL21 (DE3)) cellen voor eiwitexpressie met de volgende procedure. Bereid chemisch bevoegde (calciumchloride) E. Coli (BL21 (DE3)) -cellen volgens standaard protocollen. <ol><li> Dooi 50 ul van eerder chemisch competente BL21 (DE3) cellen op ijs en meng met 1 ul van het plasmide met pGEX PAD4 gen in een 5 ml kweek tube. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 10 minuten onder zacht schudden om de 2 min. </li><li> Heat shock de cellen door het plaatsen van het mengsel in een 42 ° C waterbad gedurende 40 sec. Plaats onmiddellijk cel-plasmide mengsel opnieuw op ijs gedurende 2 minuten om de cellen te herstellen. Voeg 1 ml steriel LB-medium aan het mengsel en plaats op ijs gedurende 1 minuut. </li><li> Incubeer de hitteschok cellen bij 37 ° C, onder schudden bij 250 rpm gedurende 1hr. Pipetteer 75 ul van de getransformeerde cellen op een ampicilline resistente agar plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur. Store plaat staan ​​bij 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Pick 1 kolonie van BL21 (DE3) cellen van de ampicilline agarplaat en plaats in 5 ml LB met ampicilline 1x. Plaats in incubator en schud O / N bij 37 ° C. </li><li> Breng de 5 ml LB (starter) in 1 L van steriele LB dat 1x ampicillinetrihydraat (MW 403,45 g / mol). Plaats groei in een 37 ° C incubator schudden. Bewaken van de OD 600 van de groei. Wanneer de groei een OD 600 van 0,3 bereikt, bewegen de groei naar 16 ° C schudincubator. </li><li> Bij het ​​bereiken van een OD 600 van 0,6, induceren de cellen met 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Laat cellen schudden gedurende 15 uur bij 16 ° C. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Giet supernatant en bewaar pellet bij -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Zuivering <ol><li> Resuspendeer de pellet dat het tot expressie PAD4 in BL21 (DE3) cellen in een buffer van 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM imidazool (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, MW 174,94 g / mol) en 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8.0. </li><li> Lyseren de cellen via sonicatie gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Na sonicatie, gecentrifugeerd cellysaat bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Giet af en bewaar supernatant. Batch de supernatant met glutathion (GSH) agarose parels gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Tap supernatans van GST kralen / kolom via de zwaartekracht. Was kralen met 4 x 25 ml 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH = 8,0) bij kamertemperatuur. </li><li> Elueer PAD4 met 2 x 10 ml elutiebuffer, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8.0. </li><li> Concentreer PAD4 behulp 100k MW cut-off centrifugebuizen en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Aliquot eiwit in 200 gl volumes in 1,0 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiden van Stock Solutions voor Buffers <ol><li> Weeg natriumchloride (NaCl, MW 58,44 g / mol) en bereidt een 2 M oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk. </li><li> Weeg Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris Base, MW 121,14 g / mol) en stelt een 2 M oplossing, pH = 8,0. Meng de oplossing totdat duidelijk. </li><li> Weeg calciumchloridedihydraat (CaCl2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) en bereiden een 500 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk. </li><li> Weeg Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP, MW 250,19 g / mol) en bereiden een 200 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Weeg dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) en voor te bereiden op een 1 M oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereideneen oplossing van 0,5% Triton X-100. </li><li> Weeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, MW 292,24 g / mol) en bereiden een 100 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk. </li><li> Weeg Z- Arg-Arg-7- amido 4- methylcumarine hydrochloride (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) en bereiden een 10 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 Assay bij 37 ° C <ol><li> Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 125 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 125 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn </li><li> Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, en 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B. </li><li> Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2 en 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dit zal Solution C. </li><li> Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20° C. Dit zal Solution D. </li><li> Verkrijgen van een 96-well plaat en wijst een aantal putten voor controles (geen PAD4) en testputten (+ PAD4). </li><li> Pipetteer 160 ul van oplossing B in testputten en pipet 160 ul van Solution C in controle putten. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Pipetteer 40 ul oplossing A in ieder putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min. </li><li> Pipetteer 10 ul van dH 2 O helft van de controleputjes en de helft van de test wells. De andere helft van controleputjes en testcontroles Pipetteer 10 ul van oplossing D. gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 Assay bij RT <ol><li> Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 50 pM oplossing van ZRcoum in water. Deze 50 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn </li><li> Bereid een buffer van 100 mM Na-Cl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, en 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B. </li><li> Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP en 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dit zal Solution C. </li><li> Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution D. </li><li> Verkrijgen van een 384-wells plaat en aanwijzen putten voor de controles (geen PAD4) en testputten (+ PAD4). </li><li> Pipetteer 25 ul van oplossing B in testputten en pipet 25 ul van Solution C in controle putten. Laat buffer met / zonder PAD4 geïncubeerd in putjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 25 ul van oplossing C in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 10 ul van dH 2 O helft van de controleputjes en de helft van de test wells. De andere helft van controleputjes en testcontroles, pipette 10 pl van oplossing D. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Time Cursus Testen bij 37 ° C en RT <ol><li> Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 125 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 125 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn </li><li> Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, en 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B. </li><li> Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution C. </li><li> Verkrijgen 2 platen met 96 putjes en pipet 160 ul van oplossing B in # hoeveelheid putjes (# putten afhankelijk van het aantal tijdstippen). </li><li> Incubeer een 96-puts plaat bij 37 ° C. Incubeer de andere plaat met 96 putjes bij kamertemperatuur. </li><li> Pipette 40 pl van oplossing A in alle putjes in zowel 96-well platen en direct pipet 10 ul van oplossing C in de t = 0 min putten. Verder toevoegen van 10 pl van oplossing C op specifieke tijdstippen tot alle putjes werden gedoofd. </li><li> Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Remming Assay bij KT <ol><li> Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 83 pM oplossing van ZRcoum in water. Deze 83 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn </li><li> Weeg Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) en bereiden een 100 uM stockoplossing. Dit zal Solution B. </li><li> Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, en 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution C. </li><li> Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP en 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). This zal Oplossing D. </li><li> Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution E. </li><li> Verkrijgen van een 384-wells plaat en aanwijzen putten voor de controles (geen PAD4), testputten (+ PAD4), en remming putten (PAD4 + Cl-amidine). </li><li> Pipetteer 25 ul van Solution C in testputten en pipet 25 ul van Solution D in controle putten. Laat buffer met / zonder PAD4 geïncubeerd in putjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 10 ul van oplossing B in remming putjes en incubeer gedurende 20 minuten bij RTE. </li><li> Pipetteer 15 ul oplossing A in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 10 ul van oplossing E aan alle putjes. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li></ol> 7. ruwe cellysaat Assaybij KT <ol><li> Na het oogsten van cellen van PAD4 1 L groei, resuspendeer cellen in 10 ml van 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, MW 174,94 g / mol) en 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8.0. </li><li> Lyseren de cellen via sonicatie gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het cellysaat bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Concentreer de heldere supernatant helft van het volume door centrifugatie bij 4000 rpm bij 4 ° C met 100k MW cut-off centrifugebuizen. </li><li> Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 250 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 250 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn </li><li> Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2 en 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dit zal Solution B. </li><li> Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution C. </li><li> Verkrijgen van een zwarte 384-well plaat en designaten putten voor de controles (geen cellysaat) en testputten (+ cellysaat). </li><li> Pipetteer 100 ul van oplossing B in ieder putje en pipet 60 ul cellysaat in testputjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 40 ul oplossing A in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer 10 ul van oplossing C aan alle putjes. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Verkrijgen van een fluorescentieaflezing van multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li></ol>

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin is met succes een op fluorescentie gebaseerde test ontwikkeld die de activiteit van PAD4 bewaakt. De test heeft bewezen ongelooflijk robuust te zijn in een aantal omstandigheden met hoge doorvoer en is ook compatibel met gehele cel-lysaten37.
De affiniteit tussen de histon-eiwitten en de DNA-strengen eromheen wordt zwakker door de neutralisatie van de positieve lading op de arginine zijketen bij citrullinering. Het werd voorzien dat de neutralisatie van de arginine zijketen o...

Een groot aantal zoogdiereiwitten worden sterk veranderd door de werking van enzymen na de biosynthese van eiwitten door het ribosoom. Deze post-translationele modificaties (PTM) kan verhogen de functionele diversiteit van het proteoom door de grootte, lading, structuur en oligomerisatie toestand (naast andere functionaliteiten) van eiwitten 1-3. Hierdoor kan de verandering in eiwitstructuur leiden tot fysiologische gevolgen, zoals proteïne afbraak, cellulaire differentiatie, signalering, modulatie van genexpressie en eiwit-eiwit interacties. Hoewel deze wijzigingen heersen in een groot percentage van alle menselijke eiwitten, de uiteinden van histon eiwitten ondergaan een ongewoon hoog aantal covalente 4 modificaties. Histon eiwitten zijn een familie van structurele eiwitten die de condensatie van genomisch DNA te vergemakkelijken. Covalente modificaties van de ongestructureerde histon staarten worden uitgevoerd en gereguleerd door een series van enzymen die de covalente modificatie van residuen (schrijvers) kan katalyseren, reverse dezelfde modificaties (gummen), en onderscheid te maken tussen de veranderingen die zijn bedrukt op de histon staarten (lezers) 5-7. De meeste van de bekende PTMs mogelijk binnen dit korte segment van de histon zoals methylatie, fosforylatie, acetylatie, sumoylation, ubiquitinatie en citrullinatie 8. Citrullinatie Daarbij worden peptidyl-arginine aan de niet t RNA gecodeerde peptidyl-citrulline (figuur 1A). De eiwitten, die verantwoordelijk is voor deze zijketen neutralisatie, lid van de PAD (p eptide een rginine d eiminase) eiwitfamilie, die allemaal calciumafhankelijke enzymen. 9,10. Tot op heden hebben vijf leden van de PAD familie beschreven (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 en PAD6). Ieder lid van deze familie lijkt te onderscheiden cellulaire eiwitten richten en toont ook unique weefsel distributie profielen. PAD4 is het enige lid van deze eiwitfamilie bekende gelokaliseerd in de kern via een nucleaire lokalisatie sequentie 11. Dienovereenkomstig is aangetoond dat een aantal nucleaire doelen, waaronder arginine zijketens op de N-terminale staarten van histonen H2A arginine residu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 en H3R26) en H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Terwijl elk van de PAD isozymen specifieke en kritische fysiologische functies heeft PAD4 veel meer aandacht gekregen vanwege zijn rol in een aantal menselijke processen zowel zieke en gezonde cellen. Recent PAD4 bleek een lid van de pluripotentie transcriptionele netwerk 14 zijn. Beide PAD4 expressie en activiteit werden getoond tijdens de herprogrammering en de grondtoestand pluripotent staten bij muizen te worden verheven. Door regeling van de regulatie van stamcellen genen kan PAD4 een cruciale rol in de cellulaire herprogrammering efficiency behouden. PAD4 is ook geïmpliceerd in devorming van neutrofiele extracellulaire vallen, die na binding van pathogenen in staat hun systeem klaring. De hypercitrullination histon eiwitten door PAD4 induceert decondensatie van het chromatine, dat als grondstof voor de inkapseling van pathogene bacteriën door de extracellulaire val, waardoor afweren bacteriële infecties 15,16. Daarnaast is gebleken PAD4 een actieve rol in een aantal menselijke ziekten. Eerder is aangetoond dat afwijkende expressie van PAD4 geassocieerd met het begin en de ernst van reumatoïde artritis, ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en multiple sclerose 17. In feite is de aanwezigheid van anti-eiwit antilichamen gecitrullineerde is een van de meest betrouwbare en definitieve diagnostische en prognostische biomarkers van reumatoïde artritis 18. Evenzo heeft ontregelde activiteit PAD4 recent waargenomen in een aantal menselijke tumoren zoals eierstok-, borst-, long-, eend slokdarm kanker 19-22. Het verband tussen PAD4 en kanker een gemedieerd via ELK1 oncogen of via het p53 tumor suppressor eiwit 22,23 en eerder werk heeft gesuggereerd dat PAD4 een nieuwe anti-kanker therapeutische target 17,24,25 kunnen zijn. Als proof of principle studie, de uitputting van PAD4 via shRNA in de colorectale kanker cellijn HCT116 werd geopenbaard voldoende voor het induceren van apoptose en celcyclus 26 te zijn. Een recent ontwikkelde PAD4 irreversibele remmer tot een zeventig procent reductie in tumormassa bij muizen 27. Opmerkelijk genoeg PAD4 remming bleek als een doelgerichte therapie die resulteerde in selectieve doden van kankercellen terwijl spaarde ongetransformeerde cellen. Het gebruik van kleine moleculen de functie van PAD4 uitschakelen kan blijken een krachtige nieuwe strategie om kankercellen richten of bestaande chemotherapieën 28 vergroten zijn. Helaas, een potent omkeerbare PAD4 remmer moet nog worden ontdekt. Een aantal covalente remmers zijn ontwikkeld met behulp van de chloor / fluor imidine handvat dat de arginine substraat 27,29,30 nabootst en hebben bewezen praktische hulpmiddelen zijn in het begrijpen van de rol van PAD4 bij zowel gezonde als zieke toestand cellen. Echter, deze moleculen remmen alle actieve PADS met gelijke potentie. Daarom is de behoefte aan een gemakkelijke test die rapporteert over de activiteit van PAD4 cruciaal. Tot op heden zijn PAD4 assays beschreven die de afgifte van ammoniak verbinden van de reactie op een colorimetrische uitlezing 31, uitgerust met een fluorescent gemerkt chloroamidine substraat analoog voor fluorescentie polarisatie assay 32 gebruikmaken van de zuur-ondersteunde reactie tussen glyoxal en citrulline 33, en koppel de PAD4 activiteit om een fluorescentie dequenching stap 34. Hiervan alleen de covalente modifier haloacetamidine strategie gebleken geschikt high-throughput sch tetanen platforms 32,35,36. We beschrijven een facile fluorescentie gebaseerde test die betrouwbaar meet de activiteit van PAD4. De test, die een sterk signaal-ruisverhouding, analysesnelheid en robuustheid van meting toont, heeft het potentieel om een ​​echt krachtige en selectieve remmer PAD4 ontdekken.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technologies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>All Buffer Salts&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Koopbaar bij Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; enz.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&nbsp;</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td>10599</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell platen (96 en 384)</td><td></td><td></td><td>Koopbaar bij Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td></tr></tbody></table>

fluorescentie gebaseerde monitoring van pad4 activiteit via een pro-fluorescentie substrate analog

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translationele modificaties kunnen leiden tot veranderde functionele toestanden van eiwitten door het verhogen van covalente variaties op de zijketens van veel eiwitsubstraten. De histonstaarten vertegenwoordigen een van de meest zwaar gemodificeerde gebieden binnen alle menselijke eiwitten. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) is getoond om arginineresiduen om te zetten in het niet-genetisch gecodeerde citrullineresidu. Weinig tot nu toe beschreven assays zijn operationeel eenvoudig met voldoende gevoeligheid. Daarom heeft het ontbreken van adequate assays waarschijnlijk bijgedragen aan de afwezigheid van krachtige niet-covalente PAD4-remmers. Hierin wordt een nieuwe fluorescentie-gebaseerde assay beschreven die het mogelijk maakt om de PAD4-activiteit te monitoren. Een pro-fluorescente substraatanaloge werd ontworpen om de enzymatische activiteit van PAD4 te koppelen aan fluorescentiebevrijding bij toevoeging van de protease trypsine. Het werd aangetoond dat de assay compatibel is met omstandigheden voor grootschalige screenings en een sterk signaal-ruisverhouding heeft. Verder kan de assay ook worden uitgevoerd met ruwe cellysaten die overgeexpresseerd PAD4 bevatten.

Aanvankelijk werd aangetoond dat ZRcoum kunnen over de activiteit van PAD4 in een 96-well plaat formaat. Putjes werden geïncubeerd met het substraat ZRcoum en in de aanwezigheid / afwezigheid van PAD4. Na een incubatieperiode van 45 min bij 37 ° C, werd de fluorescentie gemeten met een 340/40 - 475/15 nm filter (Figuur 2A). Zoals verwacht bleven fluorescentie vanaf de fluorofoor binnen ZRcoum (of citrullinated ZRcoum) bleef in de vergre...

PAD4 is een enzym dat verantwoordelijk is voor de omzetting van peptidyl-arginine naar peptidyl-citruline. Dysregulatie van PAD4 is geassocieerd met een aantal menselijke ziekten. Er wordt een eenvoudig en compatibel met hoge doorvoer, op fluorescentie gebaseerde PAD4-assay beschreven.

Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om kwantitatieve informatie te verkrijgen over het activiteitsniveau van pad vier in een gemakkelijk te reproduceren assay met behulp van fluorescentie. Dit wordt bereikt door incubatie van pad vier met het design substraat analoog ZR Co. Het eiwit wordt geïncubeerd bij kamertemperatuur of 37 graden Celsius om de omzetting van het argininederivaat in het Citraline-product mogelijk te maken, wat resulteert in een covalente modificatie van het substraat. Vervolgens wordt trypsine aan de oplossing toegevoegd om het verschil in fluorescentiesignalen te genereren.De resultaten tonen aan dat de toevoeging van actieve pad vier aan een oplossing met het prof. Fluorescente substraat leidt tot een covalente verandering op basis van de verminderde gevoeligheid voor trypsine en daarom de lagere fluorescentiesignalen. Het belangrijkste voordeel van onze techniek boven bestaande technieken, zoals degene die kijkt naar de vrijlating van het vluchtige ammoniakbijproduct, is dat we de modificatie van het substraat monitoren met behulp van fluorescentie.Het demonstreren van deze techniek zal Mary Saki en Jonathan Fiera zijn voor mijn laboratorium Om met pad vier te werken, transformeer eerst het pgx-plasmide dat pad 4G ST-fusie bevat in chemisch competente E coli-cellen voor pad vier-eiwitexpressie alle cellen op ijs. Ten tweede, meng de derde cellen met één microliter van het PGX-plasmide dat het pad vier-gen bevat in een vijf milliliter kweekbuisje. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs en schud het elke twee minuten voorzichtig.Vervolgens shock de cellen gedurende 40 seconden bij 42 graden Celsius. Direct daarna plaats je het cellen-plasmide-mengsel terug op ijs gedurende twee minuten, zodat de cellen kunnen herstellen. Voeg nu één milliliter steriele LB toe en houd de cellen nog een minuut gekoeld.Vervolgens incubeer je de cellen een uur bij 37 graden Celsius. Zet ze na de incubatie op 250 RPM en pipet je 75 microliter van de getransformeerde cellen op een ampicilline-resistente agarplaat en incubeer de plaat gedurende 15 uur bij 37 graden Celsius. Bewaar deze plaat bij vier graden Celsius.Transfer een kolonie van transformeercellen naar vijf milliliter LB met ampicilline. Plaats het buisje in een incubator en schud het een nacht door op 37 graden Celsius. De volgende dag.Transfer de vijf milliliter startercultuur naar een liter van STO L LB met één x ampicilline tri. Controleer de OD 600 van de cellen terwijl ze groeien bij 37 graden Celsius. Wanneer hun absorptie 0,3 bereikt.Breng de kolf over naar een ruimte van 16 graden Celsius en blijf schudden. Blijf de OD van de groei controleren. Wanneer de OD van de cultuur 0,6 bereikt.Induceer de cellen met 0,3 millimolair isopropyl THAG GTO. Laat de cellen 15 uur schudden bij 16 graden Celsius. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de groeitemperatuur op 16 graden Celsius staat voordat je begint met inductie met IPTG.De volgende dag scheid je de cellen door centrifugatie bij 4.000 G gedurende 20 minuten bij nul graden Celsius of de SUP-agent en bewaar de celpellet bij min 80 graden Celsius om het pad te verzamelen. Vier eiwit resuspendeer de transformeercelpellet in buffer met EOL fenol, methyl suen fluoride en dihi drie etol. Daarna behandel je de cellen door sonicatie gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, volgend op centrifugatie van de lysaten bij 20.000 keer G gedurende 20 minuten en bij nul graden Celsius.Verzamel de supernatanten en incubeer ze gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met glutathion aeros-kralen. Laat de supernatanten van de GST-kralen druppelen na het verzamelen van de flow-through. Was de kralen vier keer met 25 milliliter PBS bij vier graden Celsius.Vervolgens eluteer je het pad vier-eiwit van de kralen met behulp van 10 milliliter elucian-buffer. Concentreer pad vier in de elucian-buffer met behulp van centrifugeerbuisjes met een molecuulgewicht van 100 K. Ten slotte Eloqua het gezuiverde pad vier-eiwit in volumes van 200 microliter voor opslag bij min 80 graden Celsius. Bereid voor deze procedure 83 micromolar werkoplossing van ZR co gelabelde oplossing A. Bereid ook oplossingen B, D en de pad vier oplossing C voor. Zorg er bij het bereiden van oplossing E voor dat je mengt totdat de TRIPSIN zich oplost.Verkrijg een 384-wellplaat en wijs de notitieboek, vier controleputjes, de testputjes en de remmingsputjes toe voor pad vier plus chloor amadine. Voeg vervolgens 25 microliter van oplossing C toe aan elk testputje en 25 microliter van D aan elk controleputetje. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Na 20 minuten voeg je 10 microliter van oplossing B toe aan de remmingsputjes en wacht je nog 20 minuten. Voeg vervolgens 15 microliter van oplossing A toe aan alle putjes. Wacht vervolgens 45 minuten.Na 45 minuten voeg je 10 microliter van oplossing E toe aan alle putjes en wacht je nog 10 minuten voordat je fluorescentiemetingen doet. Gebruik uiteindelijk een multimodale lezer om de emissiegegevens te verzamelen. Zar CO werd gedurende 45 minuten geïncubeerd met en zonder pad vier zonder pad vier, de toevoeging van tripsine vrij, de Fluor en de fluorescentieniveaus nemen toe en de aanwezigheid van pad vier zar is gemodificeerd en trypsine geeft de Fluor niet vrij, waardoor de fluorescentie afneemt.De assay werd getest in platen met hoge dichtheid bij kamertemperatuur om high-throughput screeningprocedures bij kamertemperatuur mogelijk te maken. De signalen waren vrijwel onveranderd vergeleken met die verkregen bij 37 graden Celsius. De reactie verliep langzamer bij kamertemperatuur.Het werd binnen 45 minuten voltooid. De stabiliteit van de PED vier in de reactiebuffer werd vervolgens getest als hoge stabiliteit, belangrijk voor high-throughput screening gedurende een periode van 15 uur. Er werd geen enzymatische activiteitsverlies gedetecteerd.Remming van PLA vier met chloor AMADINE vertoont verwachte trends onder deze testomstandigheden bij kamertemperatuur. Om de robuustheid van de PAD vier zku-assay uit te

fluorescence-based-monitoring-pad4-activity-via-pro-fluorescence

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.

Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

De activering van de multifunctionele Ser/Thr kinase AURKA wordt gekenmerkt door zijn autofosforylering op Thr288. Fluorescerende sondes die op FRET vertrouwen, kunnen onderscheid maken tussen de inactieve en geactiveerde toestanden. Hier illustreren we enkele strategieën voor sonde-engineering, samen met een snel FRET-protocol om de kinase-activering tijdens mitose te volgen.

Real-Time Monitoring van Aurora kinase A Activatie met behulp van Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Leer een fluorescerende assay voor PAD4-activiteit met behulp van een pro-fluorescerend substraatanaloog. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor het meten van enzymatische conversie van arginine naar citrulline.

Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog

Meer video's verkennen