Name: Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Leer de formatie van remmende GABAergische synapsen in een co-cultuurmodel met embryonale medium spiny neuronen en HEK293-cellen die GABA A-receptoren expresseren. Deze methode maakt visualisatie van synaptische contacten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag financiële steun van de MRC UK (G0800498) erkennen. We willen ook graag professor JM Fritschy, Universiteit van Zürich, bedanken voor het verstrekken van de GABA A -R subunit-specifieke γ2 antilichaam en Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, voor het verstrekken van de pcDNA 3.1 (+) expressie vectoren die de resistentie tegen antibiotica genen voor de productie van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen.

<ol><li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li>
<li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA+excitatory%2Finhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li>
<li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pharmacology%2C+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li>
<li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+action%3A+opening+of+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li>
<li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy%2C+cleft+palate%2C+and+hypersensitive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li>
<li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li>
<li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptor+diversity+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li>
<li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li>
<li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid%28A%29+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li>
<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li>
<li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li>
<li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gamma+2+subunit+of+GABA%28A%29+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li>
<li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+GABAA+receptors%3A+form%2C+pharmacology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li>
<li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li>
<li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li>
<li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA%28A%29+receptors+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li>
<li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li>
<li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha%282%29-subunit-containing+GABA%28A%29+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li>
<li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organizing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li>
<li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation%2C+maturation%2C+and+function+of+vertebrate+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li>
<li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVentimiglia%2C+R+%22Culturing+nerve+cells%3A+Rat+striatal+neurons+in+low-density%2C+serum-free+culture%22">Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture</a>. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+GABA%28A%29+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li>
<li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain%3A+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li>
<li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li>
<li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reports%22%5BJournal%5D)">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li>
<li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li>
<li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li>
<li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hoewel dit protocol is technisch moeilijk uit te voeren, zijn er verschillende kritische stappen die moeten worden gevolgd om de meest nauwkeurige en herhaalbare co-cultuur assays bereiken. Ten eerste moet kweekmedium stekelige neuronen worden gezaaid met een optimale dichtheid. Als gezaaid te dun, neuronen hebben de neiging om heel langzaam te ontwikkelen en overleving is sterk verminderd. Anderzijds, indien geënt te dicht, neuronen neiging te aggregeren waarop de analyse van contacten met HEK293 cellen compromitteert. Ten tweede wordt aanbevolen tijdelijk drukken een fluorescerende reporter, GFP of mCherry in HEK293 cellen die stabiel tot expressie GABA A Rs vóór platting ze in de co-cultuur. Dit maakt een betrouwbare herkenning van HEK293-cellen, die kunnen worden aangetast door gelijkenis in vorm en grootte van deze cellen en zeldzame overleven glia cel van neuronale kweken. De efficiënte transfectie met GFP of mCherry cDNA bereiken, HEK293 cellijnen moeten in de exponentiële groeifase engeënt op de juiste dichtheid in 6-well platen. Spaarzame seeding gevolgd door transfectie zal veroorzaken cellen slecht groeien, terwijl de over-seeding wordt voorkomen dat de cellen van het opnemen van de cDNA. Idealiter moeten de cellen worden gezaaid zodat ze tussen 70-90% confluent op de dag van transfectie. Ten derde moet transfectie worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt, zoals sommige cellijnen gevoeliger zijn dan de anderen. Dit komt omdat constitutieve GABAA-R expressie in HEK293 cellen vermindert celoverleving en het vermogen van cellen om te herstellen na transfectie. Bovendien overleving afhankelijk van het type van GABA A Rs expressie in HEK293-cellen, met enkele cellijnen significant gevoeliger dan de andere. Transfectie met behulp van liposomaal reagens een optimale methode voor het uitdrukken van vreemde eiwitten in snel groeiende cellijnen, die zowel de hoge transfectie-efficiëntie en het niveau van expressie. Echter, dit reagens veroorzaakt te veel schade langzaam groeiende cellijnen voordie we regelmatig een niet-liposomale transfectie reagens. Dit werkt op dezelfde manier als de liposomale reagens, maar de hoeveelheid DNA die nodig is voor efficiënte transfectie aanzienlijk verminderd. Dit maakt een grotere celoverleving (ongeveer 80-90%, vergeleken met 60% met liposomaal reagens) maar met lagere transfectie efficiëntie (60%). Tenslotte het aantal controle HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengende cellen toegevoegd aan neuronale kweken moet worden geoptimaliseerd. Toevoegen van te weinig cellen compromitteert de succesvolle analyse van de contacten tussen HEK293 cellen en neuronen, omdat ze zeer zeldzaam geworden. Omgekeerd, het toevoegen van te veel HEK293 cellen veroorzaakt neuronale celdood binnen enkele uren. Embryonale medium stekelige neuron culturen moet idealiter worden bereid met striataal weefsel ontleed uit embryonale leeftijd 15 - 17. Toch gebeurt het vaak dat de embryo&#39;s zijn iets jonger of ouder zijn dan de optimale leeftijd. In dit geval, het aantal neuronen in cultuur geëntmoeten worden gevarieerd. Weefsel dat is jonger dan E15 moet worden geënt op een iets lagere dichtheid, terwijl weefsel dat ouder is dan E17 moet worden gezaaid met een hogere dichtheid, optimale celoverleving toestaan. Bovendien kan cytosinearabinoside (Ara-C) worden toegevoegd aan oudere kweken groei van glia, die meer overvloedig in oudere weefsel voorkomen. Bij het maken van co-culturen, is het belangrijk om het optimale aantal getransfecteerde HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengen plaat, zoals hierboven vermeld. Echter, kan het nodig zijn om dit te bepalen voor elke cellijn, vanwege verschillen in overleving. Typisch 30.000 cellen in een maximaal volume van 50 ul worden toegevoegd aan elk putje van een 24-putjes, die reeds bevat 500 ul neuronale kweekmedium, aangezien dit ervoor zorgt dat het geconditioneerde medium neuronale niet te veel wordt verdund en dat de voorwaarden binnen elk putje vrij constant blijft, bv </em&gt; De concentratie van groeifactoren. Volumes toevoegen van meer dan 50 pi aan elk putje zou in het algemeen de dood van de neuronen. Een van de grote nadelen van de co-cultuur techniek is dat de neuronale culturen gemaakt van gedissocieerde cellen gekweekt als een monolaag, waardoor de neuronen zijn verwijderd uit hun normale micro en kunnen hun normale anatomische structuur vaststellen. Derhalve missen zij de juiste verbindingen, ingangen en afgescheiden moleculen van andere cellen die de eerste stadia van synapsen ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in vivo medium stekelige neuronen dicht geïnnerveerd door glutamaat input van de cortex, thalamus en andere hersengebieden 34 echter in onze neuronale kweken glutamaat synapsen behoren niet omdat deze ingangen worden beschadigd tijdens dissectie van de striatale weefsels. Hoe de afwezigheid van functionele glutamatergische synapsen in gekweekte medium stekelige neuronen affsp hun vermogen om GABA-erge synapsen met elkaar en / of HEK293 cellen die GABAA-Rs vormen blijft een open vraag. Deze vraag kan gemakkelijk worden opgelost door het kweken medium stekelige neuronen met corticale neuronen glutamaat zodat hij met functionele synapsen 35 vóór de toevoeging van HEK293 cellen vormen. Een alternatieve benadering zou zijn om een ​​co-cultuurmodel te ontwerpen gebaseerd op organotypische slice cultures, die enkele van de cytoarchitecture die belangrijk zijn voor rijping en synapsvorming kunnen handhaven. Echter, organotypische slice culturen hebben dichte en heterogene neuropil waarop de analyse hier uitgevoerd in gevaar kunnen brengen. Een ander belangrijk nadeel van het gebruik van co-cultuur assays is dat GABA A Rs uitgedrukt op het oppervlak van HEK293 cellen niet gegroepeerd zoals in neuronen, maar dit blijkt niet noodzakelijk synapsvorming gegeven een voldoende hoge oppervlakte-expressie 30 worden. Bijvoorbeeld, in de rOdent hersenen en in hippocampale culturen, α1 de GABAA-subeenheid R wordt in de meeste GABAerge synapsen alle postsynaptische domeinen van pyramidale cellen. Echter, de α2 specifiek in een subset van synapsen op de somata en dendrieten maar is sterk verrijkt in de axon eerste segment, zoals geopenbaard door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie 36. Aangezien synapsvorming in de co-cultuur nog betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd 30, suggereert dit dat de dichtheid van GABA A Rs op het celoppervlak van HEK293 cellen vergelijkbaar met of zelfs hoger dan de dichtheid van deze receptoren in synaptische kan clusters in neuronen. Dit kan verklaren, althans gedeeltelijk, waarom synaptische adhesie-eiwitten, zoals neuroligin en postsynaptische dichtheid eiwitten, zoals gephyrin, niet noodzakelijk synapsvorming in de co-cultuur, wanneer het geschikt geassembleerde GABAA-R aanwezig zijn in voldoende dichtheid. Het is goed gedocumenteerd dat GABA A R structureel en functioneel heterogene, en dat de receptor subunit samenstelling bepaalt de subcellulaire lokalisatie en farmacologische eigenschappen. Bijvoorbeeld wordt de opname van 2 subeenheden bekend als een voorwaarde voor de synaptische lokalisatie van GABA A Rs terwijl de subeenheid vrijwel uitsluitend aanwezig in extrasynaptic GABAA-Rs. De receptoren die nemen alleen αβ combinaties worden ook gedacht aan voornamelijk worden gelokaliseerd aan de extrasynaptic domeinen 12- 14. Of dit specificiteit wordt gehandhaafd in onze co-kweeksysteem kan eenvoudig worden getest door tijdelijk transfecteren 2 of subeenheid cDNAs in HEK293-cellijnen die stabiel α en β-subeenheden, alvorens ze toe te voegen aan neuronale culturen. Onze voorlopige experimenten met deze benadering suggereren dat synaptische contacten gemakkelijk worden alleen gevormd in aanwezigheid van de 2 subunit, wat aangeeft dat de specificity waargenomen in vivo waarschijnlijk in vitro te behouden (gegevens niet getoond). Bovendien worden GABAA Rs waarin verschillende α subeenheden selectief gelokaliseerd synaptische contacten gevormd met specifieke soorten presynaptische neuronen. Bijvoorbeeld, in de globus pallidus, de α1-GABA A R&#39;s meestal aangetroffen striatopallidal (str-GP) en palliopallidal (GP-GP) synapsen, die zich op dendrieten en somatische gebieden van het medium stekelige neuronen, respectievelijk. De α3-GABA A R&#39;s zijn gevestigd in perisomatic regio van medium stekelige neuronen en in contact komen met de plaatselijke huisarts axon collateralen, terwijl de α2-GABA A R&#39;s bevinden zich aan distale dendrieten van deze neuronen en vooral gecontacteerd door de input van het striatum 32. Expressie van specifieke α subeenheden in verschillende synapsen en in verschillende neuronale compartimenten is ook aangetoond in andere hersengebieden zoals hippocampus 21 en neocortex 18,20. Deze bevindingen doen de vraag hoe de specifieke remmende synapsen zijn gevormd in de hersenen. Heeft de hechting van een specifiek type van presynaptische terminal induceren de invoeging van specifieke GABA A R subtypen in de punten van contact? Zijn de receptoren verhandeld specifieke subcellulaire locaties volgens hun subunit samenstelling, waarbij de plasmamembraan insertie is een voorwaarde voor de adhesie van axonale terminals bepaalde oorsprong? Tot op heden zijn deze vragen onbeantwoord. Het gebruik van verlaagde modelsystemen zoals de co-cultuurmodel systeem, kunnen we beginnen beantwoorden van deze complexe vragen omdat het systeem lastig om transfectie van DNA constructen en toepassing van reagentia en, belangrijker, is het geschikt voor live cell beeldverwerkingsanalyses 30. Dus, door dit modelsysteem we beginnen testen van de rol van individuele moleculen, waaronder verschillende soorten GABA A Rs, weetn aanwezig te zijn bij synaptische contacten zijn. Een ander voordeel is dat synapsen in dit modelsysteem vorm snel, binnen enkele minuten tot uren, waardoor de duur van de experimenten. Vergelijkbare co-cultuurmodel systemen succesvol gebruikt in het verleden om te screenen op de nieuwe synaptogenic moleculen 27,37,38. Begrijpen hoe het centrale zenuwstelsel ontwikkelt, rijpt en vormen verbindingen tussen neuronen zo ingewikkeld om de controle, bijvoorbeeld, gedrag of cognitie, is van fundamenteel belang. Deze afstand doel alleen bereikt door afbakening van de moleculaire mechanismen die de stappen van herkenning en cel-cel communicatie regelen tijdens de ontwikkeling. Vanwege enorme complexiteit, kan de moleculaire details van deze meervoudige cellulaire interacties momenteel bestudeerd worden met precisie slechts in verminderde systemen. De mogelijkheid om de complexiteit van deze systemen verhogen door expressie meervoudige combinaties van eiwitten en bestuderen hoeze interageren heeft een aantal voordelen in vergelijking met bijvoorbeeld genetische deletie benaderingen. Dit is omdat nauwkeurige interpretatie van de effecten van een enkel gen deletie wordt vaak aangetast door veranderingen geassocieerd compenserende mechanismen maskeren van de effecten van oorspronkelijke laesies, vooral in de zich ontwikkelende hersenen. De eenvoudige maar informatieve co-cultuur techniek beschreven is toegestaan ​​een ontdekking van de structurele rol van GABA A Rs in synapsvorming en opende de mogelijkheid te onderzoeken hoe GABA A Rs en andere celadhesie moleculen en / of synaptische matrixeiwitten met elkaar tijdens synaptogenese. Synaptische matrixeiwitten van bijzonder belang omdat zij onlangs aangetoond een belangrijke rol bij de glutamaterge synapsvorming 39 spelen. Verdere ontwikkeling van co-cultuur modellen is belangrijk omdat ze de potentie hebben om onze kennis van de moleculaire mechanismen die leiden de &#39;normale &amp; vooruit# 8217; hersenontwikkeling en verhogen ons begrip van deze mechanismen worden veranderd in veel neurologische aandoeningen, zoals epilepsie, schizofrenie, autisme spectrum stoornissen en vele anderen.

GABA is een van de oudste neurotransmitters in de embryonale hersenen, vóór de meest voorkomende excitatoire neurotransmitter glutamaat 1. Tijdens de ontwikkeling, GABA depolariseert en prikkelt onvolwassen neuronen spelen een belangrijke rol in de regulering van celproliferatie, migratie en vorming van neuronale netwerken zonder induceren excitotoxiciteit. In de volwassen hersenen, is de omkeringspotentiaal voor GABAA-receptor kanalen verschoven naar meer negatieve potentialen door een afname in de intracellulaire concentratie van chloride. Deze verschuiving wordt veroorzaakt door de up-regulatie van de kalium-chloride co-transporter (KCC2), die chloride transporteert uit de cel, en, in parallel, down-regulatie van de natrium-kalium-chloride transporter (NKCC1), die heeft het tegenovergestelde effect 2. In de hersenen, GABA voornamelijk bindt aan zowel GABA A of B GABA receptoren snelle of langzame synaptische remming bemiddelen, respectievely. GABAA-Rs zijn een klasse van receptors ook bekend als heteropentamere ionotrope of ligand-gated Cys-lus ionkanalen. Twee moleculen van GABA zijn vereist voor de activering van de receptor, dat doorlaatbaar is voor chloride-ionen en in mindere mate, bicarbonaat ionen. De toename chloride conductantie vermindert de doeltreffendheid van depolariserende, prikkelende gebeurtenissen activeren het postsynaptische neuron 3. Structurele diversiteit van GABA A Rs is al lang erkend als een belangrijke factor in het bepalen van hun breed scala aan functionele en farmacologische eigenschappen. Inheemse GABA A Rs zijn hetero-pentameren samengesteld uit subeenheden met meerdere isovormen ingedeeld: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π en θ 3, met een gemeenschappelijke transmembraan topologie omvattende een groot N-terminaal extracellulair domein, vier transmembraandomeinen (TM), en een grote intracellulaire domein van TM 3 en 4 4. Deβ3 en γ2 subeenheden zijn essentieel voor synaptische inhibitie en organisme overleven, omdat muizen met genetische verwijdering van deze subeenheden na de geboorte sterven 5,6. Daarentegen individuele isovormen van α subeenheid zijn belangrijk voor de functie van specifieke synaptische verbindingen in de hersenen geassocieerd met verschillende gedragingen zoals angst, sedatie, opwinding, en anderen, maar zijn niet individueel, essentieel voor het leven 7-9. GABAA-Rs zijn de belangrijkste plaatsen van werking voor verschillende geneesmiddelen met krachtige kalmerend, hypnotische, anxiolytische en anticonvulsieve effecten, zoals benzodiazepinen, barbituraten, neurosteroids en anesthetica 7,10,11. Synaptische GABA A Rs bevatten typisch een γ2 subeenheid, twee β subeenheden (meestal β2 en β3) en twee α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 12,13. De overheersende klasse van extra-synaptische receptoren bevat de δ subunit in combinatietwee α subeenheden (α4 of α6) en twee β subeenheden (β2 of β3) 14. Subcellulaire lokalisatie van GABA A Rs tot de neuronen, dendrieten of soma, en insertie in de plasmamembraan zijn afhankelijk van de aanwezigheid van β-subeenheden 15,16. Echter, selectieve opname van verschillende GABA A R subtypes in verschillende typen synapsen goed correleert met de aanwezigheid van specifieke α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 7,17,18. Belangrijk deletie van α1 en α2 subeenheid van muizen veroorzaakt ultrastructurele veranderingen op remmende synapsen 19. Dit suggereert dat GABA RS zelf kan een directe rol spelen bij het ​​reguleren synapsvorming. Aanwijzingen dat GABAerge synaps ontwikkeling een nauwkeurig gecoördineerd reeks gebeurtenissen, waarbij zowel de neuronale doelen gecontacteerd door verschillende soorten remmende axonen en de receptoren die piekt aanelke klasse van remmende synapsen zijn selectief en functioneel afgestemd 17,20-22. Dit fundamentele beginsel van specificiteit bij GABAergic synapsen werpt de vraag op hoe de pre- en postsynaptische partners herkennen elkaar tijdens de inleiding van synaptische contacten. In vitro co-kweek tests met succes toegepast op sommige van de mechanismen van synapsvorming bestuderen en de rol van individuele synaptische spleet-spanning eiwitten testen in dit proces. Een van de gemeenschappelijke trans-synaptische interactie eiwit combinaties die bi-directioneel te synaps vorming en rijping bemiddelen functioneren, zijn de neurexins (Nrxns) en neuroligins (NLS). Nrxns zijn presynaptische eiwitten die alternatieve splicing vertonen in hun laminine-neurexin-geslachtshormoon bindend eiwit domeinen die tot verschillende isovormen 23. Terwijl de Nrxns ook interactie met andere eiwitten, zijn NLS gedacht om hun alomtegenwoordige postsynaptische pa zijnRTNERS 24. Samen vormen deze eiwitten bijdragen aan het vasthouden van de presynaptische en postsynaptische membranen in nauwe en rigide appositie 25. De twee meest voorkomende isovormen NL-1 en NL-2 die aanwezig prikkelende en remmende synapsen, respectievelijk 26 zijn. Een van de eerste co-cultuurmodel systemen, die trans-synaptisch eiwit interacties te onderzoeken, toegepast verschillende soorten niet-neuronale cellen, meestal onsterfelijke cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK) 293-cellen tot overexpressie NL- 2. Wanneer deze cellen werden gekweekt met pontine neuronen, werd een accumulatie van presynaptische eiwitten in de nabijheid van het oppervlak van de HEK cellen waargenomen, wat aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten. Toevoeging van oplosbaar β-neurexin deze co-kweken remde de vorming van contacten, suggereert dat trans-synaptische interacties tussen Nrxns en NLS nodig synaptische contact wordt 27 zijn. Bovendien transiënte expressievan β-neurexin in COS (C V-1 (mensaap) in O rigin, en het dragen van de S V40 genetisch materiaal) cellen samen gekweekt met gedissocieerde hippocampus Glu en GABA-erge neuronen geïnduceerde expressie van de postsynaptische eiwit gephryin en van GABA A R subeenheden γ2 en α2 bij raakpunten tussen deze twee cellen vormen 28. Een ander voorbeeld van een co-cultuurmodel gebruikt synapsvorming studie betrokken HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met GABA A R subeenheden α2 / β3 / γ2 en NL-2, en een gemengde populatie van neuronen van de hypothalamus 29. De conclusie dat de expressie van NL-2 is een absolute vereiste voor de vorming van remmende synapsen. Echter, in de laatste co-cultuur onderzoek stabiel getransfecteerd α1 / β2 / γ2 GABAA Rs in HEK293 cellen bleken voldoende functionele synapsen te induceren wanneer samen gekweekt met GABAerge medium stekelige neuronen, zonder extra trans-synaptische of postsynaptische adhesie-eiwitten. Echter, een belangrijke verhoging van synapsvorming en kracht waargenomen wanneer NL-2 werd co-expressie gebracht met GABAA-Rs 30. Dit geeft aan dat de co-cultuurmodel systeem heeft voordelen boven eerder beschreven modelsystemen, meest duidelijk een verhoogde gevoeligheid en betrouwbaarheid van synaptische contacten detectie. Twee belangrijke factoren die bijdragen aan de algehele verbetering in detectie van synaptische contacten: i) het gebruik van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen met een hoge en consistente expressie van GABA A R subeenheden op het oppervlak van afzonderlijke cellen. Deze consistentie vergemakkelijkt kwantitatieve vergelijkingen tussen verschillende co-kweekomstandigheden. ii) Het gebruik van een zuivere populatie van GABAerge medium stekelige neuronen gekweekt uit de embryonale striatum 31 verwijdert complicaties en dubbelzinnigheden door het gebruik van gemengde neuronale populaties en allows bijvoorbeeld selectie van de meest geschikte postsynaptische GABA A R die kunnen worden vergeleken met elkaar tijdens synapsvorming. Vorming van synapsen wordt dat vele trans-synaptische signalen in pre- en postsynaptische cel adhesie complexen omvatten. Door de bi-directionele aard van synaptische signalering en de enorme aantallen van celadhesie moleculen, is het moeilijk om belangrijke componenten betrokken bij synapsvorming identificeren. Aldus transfecteren van een cel adhesie eiwit in een niet-neuronale cellen (in dit geval, de twee meest voorkomende postsynaptische targets voor GABAergic medium stekelige neuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 GABA A R 32) sterk vermindert de complexiteit van trans-synaptische signalen beschikbaar bij de postsynaptische oppervlak en maakt een nauwkeurige kwantitatieve analyse van de werkzaamheid van dit eiwit bevorderen synapsvorming.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Verwarmen in waterbad op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Gevaar: irriterend</td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technologies</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Neuralbasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Verwarmen in waterbad op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selectie)</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selectie)</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selectie)</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>Stable HEK&alpha;1&beta;2&gamma;2 lijn</td><td>Sanofi-Synthelabo, Parijs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418 disulfaat zout (Geneticin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>Gevaar: irriterend</td></tr><tr><td>Phleomycine D1 (Zeocin)</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>Gevaar: toxisch, irriterend en corrosief</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Verwarmen in waterbad op 37 &deg;C voor gebruik. Gevaar: irriterend.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m Nylon Cell Strainer</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &beta;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>Gevaar: irriterend</td></tr><tr><td>Chelerend middel (Versene)</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Liposomale transfectie reagens (Lipofectamine LTX) met liposomale transfectie buffering reagens (PLUS reagens).</td><td>Life Technologies</td><td>15338-100</td><td>Alternatieve transfectie methode: Effectene Reagent</td></tr><tr><td>Niet-liposomaal transfectie reagens (Effectene reagens)</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Gereduceerd serum medium (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-Synaptotagmin antilichaam geconjugeerd aan Cy5</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-&gamma;2 GABAA receptor antilichaam</td><td>Prof. Jean Marc Fritschy</td><td>N/A</td><td>(Institut van Zürich, Zwitserland) Fritschy, JM en Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-Glutamaat Decarboxylase (GAD)65 antilichaam</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-synapsine antilichaam</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-&beta;2/3 antilichaam (BD17)</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-&alpha;1 GABAA receptor antilichaam</td><td>Professor Anne Stephenson</td><td>N/A</td><td>(UCL School of Pharmacy, Londen) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172</td></tr><tr><td>Geit anti-guinea pig geconjugeerd aan Cy5 antilichaam</td><td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa Fluor 488 antilichaam</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa Fluor 405 antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa Fluor 555 antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Montage reagens (Prolong Gold)</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>Gebruik op kamertemperatuur</td></tr></tbody></table>

remmende synapse formation in een co-cultuur model integratie gabaergic medium maxomys neuronen en hek293 cellen die stabiel gaba a receptoren

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Remmende neuronen werken in het centrale zenuwstelsel om de dynamiek en ruimte-tijdelijke coördinatie van neuronale netwerken te reguleren. GABA (γ-aminoboterzuur) is het overheersende remmende neurotransmitter in de hersenen. Het wordt vrijgegeven vanuit de presynaptische uiteinden van remmende neuronen binnen zeer gespecialiseerde intercellulaire verbindingen, bekend als synapsen, waar het zich bindt aan GABAA receptoren (GABAARs) aanwezig op het plasmamembraan van de synaps-ontvangende, postsynaptische neuronen. Activering van deze GABA-geregen ionenkanalen leidt tot een instroom van chloride, wat resulteert in postsynaptische potentiaalveranderingen die de kans verminderen dat deze neuronen actiepotentialen zullen genereren. 
Tijdens de ontwikkeling hebben verschillende typen remmende neuronen met verschillende morfologische, elektrofysiologische en neurochemische kenmerken de mogelijkheid om hun doelneuronen te herkennen en synapsen te vormen die specifieke GABAARs subtypen bevatten. Dit principe van selectieve innervatie van neuronale doelen roept de vraag op hoe de juiste synaptische partners elkaar kunnen identificeren. 
Om de onderliggende moleculaire mechanismen te verduidelijken, werd een nieuw in vitro co-cultuur modelsysteem opgezet, waarbij medium spiny GABAerge neuronen, een zeer homogene populatie neuronen geïsoleerd uit het embryonale striatum, werden gekweekt met stabiel getransfecteerde HEK293-cellijnen die verschillende GABAAR subtypen tot expressie brengen. Synapsen vormen zich snel, efficiënt en selectief in dit systeem, en zijn gemakkelijk toegankelijk voor kwantificering. Onze resultaten geven aan dat verschillende GABAAR subtypen verschillen in hun vermogen om synapsvorming te bevorderen, wat suggereert dat dit verminderde in vitro modelsysteem kan worden gebruikt om, althans gedeeltelijk, de in vivo condities te reproduceren die nodig zijn voor de herkenning van de juiste synaptische partners en vorming van specifieke synapsen. Hier worden eerst de protocollen voor het kweken van de medium spiny neuronen en het genereren van HEK293-cellijnen die GABAARs tot expressie brengen beschreven, gevolgd door gedetailleerde instructies over hoe deze twee celtypen in co-cultuur te combineren en de vorming van synaptische contacten te analyseren.

Het protocol voor deze neuron-HEK293 cel co-cultuur model systeem is volledig afgestemd op een optimale overleving van de cel mogelijk te maken. In dit systeem, vorming van synaps-achtige contacten en hun analyse berust op een stabiele en consistente expressie van alle drie de GABA A R subeenheden die assembleren tot een functionele receptor. Het is daarom belangrijk om immunocytochemische analyse gebruiken om te testen voor subeenheid expressie op het oppervlak van HEK293 cellen alvorens te voegen aan neuronale culturen. In deze experimenten celoppervlak expressie van α1, β2 en γ2 subeenheden (Figuur 1A) of α1, β3 en γ2 subeenheden (Figuur 1B), werd gedetecteerd onder gebruikmaking subunit antilichamen die binden aan het extracellulaire epitopen van deze subeenheden. Een hoge mate van co-lokalisatie tussen deze subeenheden in de HEK293 oppervlak aangetoond. Na de oppervlakte-expressie en co-lokalisatie van GABA A bevestigtR subeenheden in HEK293-cellen, co-kweken werden bereid met HEK293-cellen die α1 / β2 / γ2 GABA A R subeenheden en medium stekelige neuronen gekweekt gedurende 14 dagen (14 dagen in vitro (DIV)). Cellen in co-kweek werden gedurende 24 uur, gefixeerd en met behulp van immunocytochemie en confocale microscopie geanalyseerd. Analyse contacten aangegeven dat GAD65 positieve GABAerge axon terminals gevormd sporadisch contacten met de controle HEK293-cellen (Figuur 2A, 2B). Het aantal contacten gedetecteerd 4 uur was 7,3 ± 0,9 per HEK293 cel, en dit aantal werd verminderd tot 5,5 ± 0,5 verbindingen (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cellen 24 uur na het toevoegen van HEK293 cellen aan de gekweekte neuronen. In contrast, GAD65-positieve GABAergic axon terminals gevormd tal synaps-achtige contacten met HEK293 cellen die GABA A Rs. Het aantal contacten verkregen 4 uur na toevoeging van HEK293-cellen was 28,3 ± 4,7 per HEK293 cel en dit aantal verdere stijgingd 52,1 ± 6,3 (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cel bij 24 uur in co-kweek (Figuur 2A, 2B). Om te bepalen of deze synaps-achtige contacten waren &#39;actief&#39; ie ondersteund vesiculaire transmitter release, werd een vesikel-luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin Cy5 geconjugeerd antilichaam aan de co-kweekmedium toegevoegd na 23 uur incubatie. Dit antilichaam wordt alleen opgenomen in presynaptische zenuwuiteinden wanneer een porie vormen tussen het synaptische vesikel lumen en de extracellulaire vloeistof in de synaptische spleet tijdens neurotransmitter release. Na afgifte, de poriën sluit, waardoor de synaptotagmin Cy5-geconjugeerd fluorescerend antilichaam aan synaptotagmin in het blaasje. Op deze wijze worden alleen de vesicles actief in neurotransmitter afgifte gelabeld met het antilichaam. In deze experimenten weinig of geen contact tussen de controle HEK293 cellen en het medium stekelige zenuwuiteinden waren actieve &amp; #8217; zoals getoond door het gebrek aan co-localisatie tussen de presynaptische GAD65 / synaptotagmin fluorescentie en mCherry fluorescentie in HEK293-cellen (Figuur 3A). Daarentegen werden veel &quot;actieve&quot; contacten gevormd tussen het medium stekelige zenuwuiteinden en α1 / β2 / γ2 expressie HEK293 cellen, hetgeen blijkt uit de hoge mate van co-localisatie van GAD65 / synaptotagmin en mCherry uitgedrukt bijzonder in HEK293-cellen ( figuur 3B). Om te testen of een ander subtype van GABA A R ook kunnen bevorderen synaps-achtige formatie in vitro, hebben we samen gekweekt α1 / β3 / γ2 uiten HEK293 cellen met medium stekelige neuronen. Nogmaals, controle HEK293 cellen zelden ontvangen contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals bereiken 10,8 ± 0,48 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A links, 4B). Echter, HEK293 cellen dieα1 / β3 / γ2 GABA A Rs vorm significant meer synaps-achtige contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals van medium stekelige neuronen bereiken van 25,3 ± 0,27 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A rechts, 4B). Dit geeft aan dat α1 / β3 / γ2 GABAA-R tot expressie gebracht in HEK293-cellen kunnen ook synaptische contacten vorming bevorderen, hoewel hun vermogen lager is dan de sterkte van α1 / β2 / γ2 bevattende GABA A Rs. Deze experimenten geven aan dat de co-cultuurmodel ontwikkeld in ons laboratorium maakt kwantitatieve analyse van synaptische contacten vorming in vitro en de beoordeling van de effectiviteit van verschillende subtypes van GABAA-Rs in dit proces. Deze experimenten demonstreren verder dat GABAA-Rs, naast kritiek functionele componenten van GABAerge synapsen, kan een belangrijke rol spelenin het proces van herkenning en vorming van synaptische contacten tussen remmende neuronen en neuronale geschikte doelcellen, onafhankelijk van andere synaptische adhesie-eiwitten. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1. Immunocytochemische analyse van expressie van GABA A R α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 in HEK293 stabiele cellijnen. Antilichamen die de extracellulaire domeinen van GABA A R subeenheden werden gebruikt label receptoren tot expressie op het celoppervlak. ( A) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5) op een hoog niveau. (B) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5)subeenheden op een hoog niveau. Schaal bar:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Figuur 2. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β2 / γ2- uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) TL-etikettering van presynaptische terminals met anti-GAD65 antilichamen (in het groen) en HEK293 cellen met mCherry (in rood, links) of de GABA A R γ2 subunit (in blauw, rechts), onthulde punten van co-localisatie tussen deze markers aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten na 4 of 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B) Kwantitatieve analyse van synaps-achtige co.<html> ntacts. HEK293 cellen werden geïdentificeerd op basis van hun vorm zoals blijkt uit DIC imaging en / of mCherry expressie en het aantal contacten tussen GAD-65 positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elke optische deel van een Z-stack series (8-10) per cel met de beeldvormende software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β2 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 4 en 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM; n = 8 in elke toestand van twee onafhankelijke experimenten). Dit cijfer is gewijzigd van Fuchs et al. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <html> ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figuur 3. GABA A Rs bevorderen vorming van actieve synaptische contacten. Immunolabeling van synaps-achtige contacten gevormd na 24 uur in co-cultuur tussen medium stekelige neuron terminals positief voor GAD65 (Alexa Fluor 405 cyaan) en (A) controle HEK293 cellen, of (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 cellen, zowel tijdelijk met mCherry construct (rood). Actieve contacten worden geïdentificeerd door co-localisatie tussen de vesikel luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin antilichaam (Cy5) en GAD65 specifiek antilichaam zowel in presynaptische terminals en mCherry expressie in HEK293 cellen. Schaal bar:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> igure 4 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figuur 4. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β3 / γ2- subunit uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) Fluorescent labeling van presynaptische terminals met anti-synapsin I antilichamen (groen), en controle HEK293-cellen (links) of α1 / β3 / γ2 expressie HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met zowel mCherry (rood), geopenbaarde punten co-localisatie tussen deze markers hetgeen de vorming van synapsen-achtige contacten na 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B). Kwantitatieve analyse van de synaps-achtige contacten. HEK293-cellen werden geïdentificeerd door expressie mCherry en het aantal contacten tussen synapsin I-positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elk gedeelte van een optische Z-stapel series (8-10) per cel met behulp van imaging-software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β3 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM, n = 8-12 cellen in elke aandoening, van twee onafhankelijke experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

De moleculaire mechanismen die de coördinatie van de vorming van remmende GABA-erge synapsen tijdens ontogenie zijn grotendeels onbekend. Om deze processen te onderzoeken, hebben we een co-cultuurmodel systeem dat embryonale medium stekelige GABAerge neuronen samen gekweekt met stabiel getransfecteerde humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die functionele GABAA-receptoren omvat ontwikkeld.

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Het doel van deze procedure is om co-cultures op te zetten tussen embryonale, medium spining neuronen en HEC 2 9 3 cellen die stabiel GABA A-receptoren tot expressie brengen om de moleculaire mechanismen te bestuderen die de vorming van GABAergische synapsen in vitro reguleren. Dit wordt bereikt door eerst de stri AUM te disseceren van E 16 tot 17 ratten of muis embryo's. In de tweede stap worden de stri AAL-cellen op dekglasjes geplaatst.In een 24-well plate worden vervolgens HEC 2 9 3 cellen die stabiel GABA A-receptoren tot expressie brengen, getransfecteerd met een M cherry fluorescente indicator. In de laatste stap worden de getransfecteerde cellen gedurende 14 dagen in vitro gedurende 24 uur co-gecultiveerd met de medium spiny neuronen voordat ze worden gefixeerd. Uiteindelijk kan de vorming van synapsen tussen de twee celpopulaties worden gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie en confocale microscopie.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van vele neurologische aandoeningen, aangezien GABAergische synapsen de activiteit van neuronale cellen coördineren en verantwoordelijk zijn voor veel fundamentele structurele en functionele elementen van neuronale circuits in het centrale zenuwstelsel. Voordat u met het experiment begint, incubeert u 13 millimeter polyol lysine gecoate dekglasjes een nacht. In een 24-well plate, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met vochtigheid, aspireert u de volgende dag het overtollige polyol lysine en wast u de dekglasjes met twee wasbeurten van tien seconden en twee wasbeurten van vijf minuten in steriel water.Vervolgens incubeert u de dekglasjes een nacht in laminine onder dezelfde omstandigheden op de dag van het experiment. Plaats eerst een zwangere muis in de rugligging op een met ethanol gedesinfecteerd dissectiepad. Knijp vervolgens in de huid met een pincet en snijd rond de buik door de huid, spier en peritoneum om de inwendige organen en de baarmoeder zichtbaar te maken.Vervolgens worden de embryo's op dag 16 tot 17 uit de baarmoeder gehaald en in een petrischaal met gekoeld PBS geplaatst. Breng de embryo's over in de laminar flow-hood om de koppen in een nieuwe petrischaal met gekoeld HBSS te plaatsen en gebruik vervolgens gebogen en rechte pincetten om elke hersenen te disseceren. Verzamel de hersenen in een nieuwe petrischaal met gekoeld HBSS.Vervolgens scheidt u voor elke hersenen de twee hersenhelften en verwijdert u voorzichtig de hersenvliezen. Snijd vervolgens langs de lijn van de hippocampus en pel de cortex terug om het striatum zichtbaar te maken. Een verzadigd witte structuur aan de voorkant van de hersenhelft, dissecteer het stratum heel voorzichtig om weefsel uit de corset niet te verliezen en plaats het in een nieuwe petrischaal.Bevat gekoeld HBSS Snijd de ator in zeer kleine stukjes van één tot twee millimeter met behulp van de gebogen pincetten. Gebruik vervolgens een met vuur gepolijste pastapipet om het weefsel over te brengen in een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis. Verminder het volume van de weefselsuspensie tot een totaal van één milliliter en pipet de oplossing verder vier tot zes keer. Polijst de punt van de pipet bio tot ongeveer 30% van zijn oorspronkelijke diameter om de oplossing verder vier keer te tri rateren wanneer de oplossing homogeen lijkt. Bouw vervolgens de celslurry op door middel van een 100 micrometer nylon zeef in een steriele 50 milliliter centrifugeerbuis.Tel vervolgens zeven keer 10 tot de macht van vier cellen in 500 microliter neuronaal kweekmedium in een 24-well weefselkweekplaat. Schud de putjes van links naar rechts en incubeer vervolgens de cellen gedurende 14 dagen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Aspireer het celkweekmedium en was elk putje kortstondig twee keer met PBS om de cellen los te maken van de zes-well plaat.Voeg tripsine EDTA-oplossing toe aan elk putje en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met vochtigheid gedurende vijf minuten om de reactie te stoppen en te doven. Voeg vervolgens één milliliter celkweekmedium toe aan elk putje en breng de inhoud over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 440 keer G. Bij kamertemperatuur, verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet volledig in 500 microliter neuronaal kweekmedium door voorzichtig op en neer te pipetten. Na het tellen zaai je drie keer 10 tot de vier cellen per putje in de 24-well weefselkweekplaat met de neuronen en schud de plaat om de cellen te verspreiden. Incubeer de co-cultures gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide.In deze afbeeldingen werd celoppervlakte-expressie van de alfa een, bèta twee en gamma twee GABA AR-subeenheden of de alfa een, bèta drie en gamma twee GABA AR-subeenheden waargenomen met een hoge mate van colocaliserende op de HC 2 93 cellen. Hier. Analyse van de cel-op-cel contacten tussen de HC 2 93 cellen en de neuronale cellen na 14 dagen in vitro geeft aan dat GAD 65 positieve GABAergische Axon-terminals slechts sporadische contacten vormen met de controle HEC 2 9 3 cellen in vergelijking met de talrijke synaps-achtige contacten die worden gevormd tussen HEC 2 93 cellen die de alfa een, bèta twee gamma twee gabaa-receptoren tot expressie brengen. In deze experimenten werden alleen de blaasjes die actief betrokken waren bij de neurotransmitterafgifte gelabeld met de antisynaptoine-antilichaam-inderdaad-weergave.Als een van de contacten tussen de controle HEC 2 9 3 cellen en de medium spining neuron-terminals actief waren. Dit wordt geïllustreerd door het ontbreken van colocalisering tussen de presynaptische GAD 65 synaptische tein-fluorescentie en de mCherry-fluorescentie binnen de HEC 2 93 cellen. In tegenstelling hiermee werden veel actieve contacten gevormd tussen de mediums-binding neuron-terminals en de alfa een, bèta twee gamma twee gabaa-receptor-expresserende HEC 2 93 cellen, zoals blijkt uit een hoge mate van colocal

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een cel Sorteren gebaseerde methode voor de zuivering en cultuur van fluorescerende erge of glutamaterge neuronen uit de neocortex en Hippocampus van postnatale muizen of ratten.

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Een kant-en-klare bevroren voorraad neuronen is een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van synaptische functies. Hier introduceren we een eenvoudige primaire cultuur met lage dichtheid uit bevroren voorraad met behulp van een 96-well plaat.

Eenvoudige en reproduceerbare primaire cultuur met lage dichtheid met behulp van bevroren voorraad embryonale hippocampusneuronen

Deze studie introduceert een multischaalkader, variërend van DNA- tot eiwitfunctie en neuraal gedrag. Het presenteert een nieuwe benadering voor het onderzoeken van voorspelde pathogene mutaties in de GABA A-receptorsubeenheid, waarbij wordt verondersteld dat epileptogene mutaties en proximale mutaties, voorspeld als pathogeen, vergelijkbare effecten kunnen hebben op het CA1-piramidale neuronmodel.

Identificatie en classificatie van positiespecifieke GABA A-receptorsubeenheid missense-varianten voor hun rol in hippocampale piramidale neuronen

Leer de formatie van remmende GABAergische synapsen in een co-cultuurmodel met embryonale medium spiny neuronen en HEK293-cellen die GABA A-receptoren expresseren. Deze methode maakt visualisatie van synaptische contacten mogelijk.

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren (Video) | JoVE Journal

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA_A Receptoren

Meer video's verkennen