Name: In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer twee flowcytometrie-gebaseerde immunologische assays om T-celreacties op West-Nijlvirus te meten via dendritische cellen. Deze methoden verminderen de noodzaak van hoge bioveiligheidsfaciliteiten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies aan T.W. (R01AI072060 en R01AI099123). G. Xie werd ondersteund door een Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We danken Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) en Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) voor het verstrekken van de MyD88–/– muizen en Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) voor het verstrekken van OTII transgene muizen.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Texas Medical Branch. 1. Isolatie van DC&#39;s van niet-geïnfecteerde en-WNV geïnfecteerde muizen <ol><li> Leeftijd en sekse match 6-10 weken oud, wild-type C57BL / 6 (B6) en MyD88 - / - muizen. Te enten intraperitoneaal (ip) met 500 plaque vormende eenheid (PFU) van WNV NS4B- P38G mutant. Op dag 3 na de infectie, euthanaseren B6 en MyD88 - / - muizen met CO 2. Gebruik van niet-geïnfecteerde muizen van beide groepen als controles. Met drie muizen per groep. </li><li> Natte vacht aan de linkerkant van opgeofferd muis met behulp van 70% ethanol en weggesneden de vacht langs de linkerkant van de muis, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten. Opengesneden de lichaamsholte. Verwijder de milt met behulp van de tang. Plaats de milt in een petrischaal met RPMI. </li><li> Isoleer milt DCs met anti-CD11c magnetische parels volgensinstructies van de fabrikant. </li></ol> 2. Zuivering en Labeling van T-cellen van OTII transgene muizen <ol><li> Oogst een milt van een naïeve OTII muis zoals beschreven in stap 1.2 en homogeniseer de milt tussen de matte uiteinden van twee dia. Breng de celsuspensie aan een 15 ml conische buis, voeg RPMI-medium tot 14 ml. Laat de suspensie zitten 5 minuten en breng 13 ml aan een nieuwe 15 ml conische buis. </li><li> Isoleer milt CD4 + T-cellen met een CD4 + T cel isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Overdracht cellen in een 50 ml conische buis, twee keer wassen met PBS. Resuspendeer cellen in PBS met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 1 x 10 6 cellen per ml en voeg 0,5 umol / ml CFSE. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min, beschermd tegen licht. </li><li> Voeg 5 ml koud compleet medium (RPMI-1640 met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1/100 volantibiotica / antimycotica, 1/100 volume L-glutamine en 1 / 1,000 vol 1,000 x 2-mercaptoethanol). </li><li> Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Was de cellen eenmaal met PBS, vast 0,2 x 10 6 gelabelde CD4 + T-cellen in 2% PFA en verwerven op een flowcytometer. Gebruik dit monster naar het basale niveau van CFSE bepalen. Resuspendeer de rest van gelabelde cellen in compleet medium. </li></ol> 3. Co-cultuur OTII T-cellen met DC&#39;s van WNV-geïnfecteerde muizen <ol><li> Culture 2 x 10 5 gezuiverde CD4 + T-cellen van muizen OTII alleen of met gezuiverd DCs wild-type of MyD88 - / - muizen (2 x 10, 4) in een 24 wells plaat met of zonder OVA resten 323-339 (1 g / ml) in 1 ml compleet medium per putje. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 dagen. Oogst cellen, was twee keer in FACS-buffer (PBS met 1% FBS) en bevestig in 0,25 ml 2% PFA. Vortex onmiddellijk. </li></ol> 4. Flowcytometrieanalyse van In Vitro &lt;/ Em&gt; T Cell Priming <ol><li> Voor overname, dubbelklik op de flowcytometrie software icoon. Voor een dichtheid perceel van lineaire FSC-A versus lineaire SSC-A, kanalen te selecteren 0 tot 200.000 op FSC-A en 0 tot 200.000 op SSC-A. Maak vervolgens een poort op levende cellen (P2; zie figuur 1A). </li><li> Om de fluorescentie-intensiteit van CFSE analyseren, opent u het histogram voor de FL1 kanaal en het verwerven van 20.000 evenementen op de gated bevolking. Het opzetten van een marker op monsters voor OTII cellen alleen gekweekt (Figuur 1A). </li><li> Verwerven monsters OTII cellen samen gekweekt met wildtype DCs (Figuur 1B) of MyD88 - / - DCs (figuur 1C) op een soortgelijke wijze. </li></ol> 5. Isolatie en Stimulatie van Splenocyten voor cytokine Testen <ol><li> Infecteren B6 en MyD88 - / - muizen met WNV NS4B-P38G mutant volgens dezelfde procedure zoals beschreven in step 1.1. Op dag 30 na de infectie, re-challenge overlevende muizen met 2000 PFU van de wild-type WNV stam ip Op dagen 8 en 21 post-primaire WNV infectie of op dag 4 na secundaire infectie, euthanaseren muizen met CO 2 voor het verzamelen van de milt . OPMERKING: We gebruikten 2-3 muizen per groep voor elk tijdstip. </li><li> Voeg een enkele celsuspensie van splenocyten zoals beschreven in stap 1.2 en stap 2.2. Tellen cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in 10 ml compleet medium. </li><li> Verdun cellen met volledig medium tot 2,5 x 10 6 cellen / ml. Voeg 1 ml splenocyten in 1,5 ml micro-centrifugebuis. </li><li> CD8 + T-cellen simuleren verdunnen WNV specifiek NS4B en E peptiden (SSVWNATTA en IALTFLAV) tot 1 mg / ml in DMSO. Voor stimulatie van CD4 + T-cellen, verdund WNV specifieke NS3 en E peptiden (RRWCFDGPRTNTILE en PVGRLVTVNPFVSVA) tot 1 mg / ml in DMSO. Voeg 10 ul van peptiden aan de cellen followed met 1 pl Brefeldine A oplossing. Gebruik cellen zonder peptiden behandeling als controles. Meng de cellen. </li><li> Punch twee gaten met een 18 G naald in de dop van de buis. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 uur. </li></ol> 6. intracellulaire cytokine kleuring <ol><li> Overdracht cellen om een ​​nieuwe micro-centrifugebuis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300-400 xg en giet af supernatant. Voeg 1 ml FACS buffer, draai 5 min bij 300-400 xg en opnieuw te schorten cellen door pipetteren met 120 ul FACS buffer. </li><li> Voeg 2 pi Fc blokker en incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 1 ml FACS-buffer aan elke buis. Spin 5 min bij 300-400 x g. </li><li> Re-schorten cellen in 300 ul FACS buffer en ze splitsen in drie buizen (ongeveer 0,8 x 10 6 cellen per buis). Zoals getoond in tabel 1, behouden de eerste buis van elke kweekomstandigheid voor rat IgG-PE-kleuring. Voor de tweede buis, voeg 3 ul van anti-CD4 APC CD4 peptiden behandelde cellen, 3 μl anti-CD8 FITC CD8 peptiden behandelde cellen of beide antilichamen aan cellen zonder peptiden behandeling. Gebruik de derde buis tot schadevergoeding kleuring. Voor elke cultuur staat, gebruik drie buizen van cellen gekleurd met APC-geconjugeerde CD4, FITC-geconjugeerd CD8 of PE- gelabelde CD3 antilichamen alleen (3 pi per buis) als compensatie controles voor VT1, VT2 en FL4 kanalen. </li><li> Vortex cellen kort. Vertrekken op ijs gedurende 20 minuten en bescherming tegen licht. Voeg 1,4 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en giet af supernatant. </li><li> Ageren naar cel pellet (of kort vortex) verstoren. Re-schorten cel pellet in 250 ul fixatie / permeabilisatie solutionby pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en bescherm tegen licht. </li><li> Voeg 1,2 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 300 pi FACS-buffer. OPMERKING: Op dit punt cellen kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking of in de koelkast bewaard en beschermd tegen licht for up drie dagen. </li><li> Voeg 500 pi FACS-buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 500 ul van 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g. </li><li> Re-schorten cellen in 100 ul 1x Perm / Wash, voeg 3,5 ul anti-IFNy-PE aan de buis eerder toegevoegde met antilichamen voor CD4 en / of CD8 T-cel markers in stap 6.3 en 3.5 pi rat IgG-PE in de buis voorbehouden voor IgG controle gedurende 25 min op ijs en bescherming tegen licht. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g. Herhaal de wasstap door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer. </li><li> Spin 5 min bij 300-400 xg en decanteer supernatant. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml van FACS buffer en opnieuw op te schorten in 400 pi van FACS-buffer voor de definitieve overname. </li></ol> 7. Flowcytometrieanalyse van intracellulaire cytokine kleuring <ol><li> Gebruik dezelfde overname instellingen als in stap 4.1. Create een poort op levende cellen (P2; zie figuur 2A). Stel de spanningen met de compensatie buizen voor elke groep. </li><li> Open twee nieuwe puntdiagrammen, een tot gegevens die zijn verzameld voor FL1 vs weer te geven. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), en de andere is om gegevens verzameld FL4 vs weergegeven. VT2 (CD4 vs. IFN-γ). Verwerven 50.000 evenementen voor de gated bevolking van elk monster. </li></ol>

<ol><li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li>
<li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li>
<li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li>
<li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li>
<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vgamma4%2B+T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

WNV is een BL3 pathogeen. Vanwege veiligheidsvoorschriften, worden immunologische tests met WNV besmette monsters vaak beperkt door de beschikbaarheid van apparatuur op BL3 faciliteiten of meer langdurig en vervelend om te presteren. In een recente studie, gebruikten we twee stroomcytometrie gebaseerde methoden om celgemedieerde immuunresponsen bestuderen gedurende WNV infectie 5. In beide assays werden WNV-geïnfecteerde cellen behandeld met 1-2% PFA rechtstreeks of fixatie / permeabilisatie oplossing met 4% ...

West-Nijlvirus (WNV), een neurotropisch, plus-voelde flavivirus, is een opkomende bedreiging voor de volksgezondheid. Op dit moment zijn er geen vaccins zijn goedgekeurd voor menselijk gebruik 1. Een verzwakte WNV stam, die een P38G substitutie in het niet-structurele (NS) 4B eiwit, bekend geen letaliteit bij muizen maar hogere aangeboren cytokinen en T cel responsen in muizen dan wildtype WNV NY99 stam 2 induceren. Muizen geïmmuniseerd met de NS4B-P38G mutant werden allemaal beschermd tegen een secundaire uitdaging met dodelijke wild-type WNV. Dit suggereert dat de NS4B-P38G mutant geschikte kenmerken voor een ideaal vaccin kandidaat. De mechanismen waarmee de NS4B-P38G mutant induceert hoge beschermende adaptieve immuniteit is nog niet duidelijk begrepen. Toll-like receptoren (TLR&#39;s), die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen, spelen een essentiële rol in de initiatie van aangeboren immuniteit tegen virale infectie. De kern TLR signaalweg maakt gebruik van myeloïde differentiatie primaire reactie gene 88 (MyD88) als de primaire adapter 3,4. In een recente studie werd MyD88 signalering blijkt een belangrijke rol in de ontwikkeling van celgemedieerde immuniteit spelen tijdens WNV NS4B- P38G mutante infectie bij muizen 5. Dendritische cellen (DCs) zijn één van de belangrijkste antigeen presenterende cellen vertonen de unieke capaciteit tijdens virale infectie 6,7 primaire T-cel responsen leiden. CD4 + en CD8 + T-cellen dragen bij tot langdurige beschermende immuniteit en zijn belangrijk voor gastheer overleven na wildtype WNV infectie 8,9. Twee immunologische assays werden bij dit onderzoek naar de functie van deze cellen in de NS4B-P38G mutant geïnfecteerde muizen te beoordelen. Eerst werd een in vitro T-cel priming assay gebruikt ter vergelijking de antigenpresenterende vermogen van DCs van WNV-geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen. Om de gevoeligheid van de assay, naïeve CD4 &lt;vergrotensup&gt; + T-cellen werden geïsoleerd uit OTII transgene muizen, die een Vα2 / Vβ5 TCR specifiek voor de kip ovalbumine (OVA) peptide uitdrukken 323 - 339. DC&#39;s van WNV geïnfecteerde muizen werden gezuiverd, en co-gekweekt met carboxyfluoresceïne succinimidyl Pasen (CFSE ) -gemerkte CD4 + T-cellen in aanwezigheid van OVA-peptide. Na 5 dagen van co-kweek werden de cellen geoogst en met paraformaldehyde (PFA) vastgesteld en door flow cytometrie geanalyseerd. Proliferatieve assays zijn vanouds door incorporatie van 5-broom-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) of getritieerd thymine deoxyriboside (3 HTdr) 10 uitgevoerd. Toch zijn deze testen zijn ofwel radioactief en / of die bijzondere apparatuur in bioveiligheidsniveau (BL) 3 faciliteiten waar WNV studies worden uitgevoerd. De flowcytometrische analyse van lymfocyt proliferatie door seriële halvering van de fluorescentie-intensiteit van de vitale kleurstof CFSE geworden vaker gebruikt in immunologische assays de kleurstof stabieleren gelijkmatig opgenomen in cellen, gemakkelijk gedetecteerd door flow cytometrie en is nonradioactive 11. De test heeft ook de mogelijkheid om het aantal celdelingen beoordelen. Een groot voordeel van deze assay in WNV studies is dat fixatie van de geïnfecteerde cellen met 1-2% PFA WNV 12, die monsterverzameling mogelijk maakt met een flowcytometer in BL2 laboratorium kunnen inactiveren. Vervolgens werd een gemodificeerd intracellulaire cytokine kleuring (ICS) procedure gebruikt om de rol van MyD88 signalering in regulatie van WNV specifieke T cel responsen in NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde muizen te bestuderen. In deze test werden splenocyten geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen behandeld in vitro met WNV specifieke peptiden. Brefeldine A werd toegevoegd aan de cytokinen in de cel behouden. Na 5 uur incubatie werden cellen geoogst, gewassen en gekleurd voor T cel subsets. Cellen werden vervolgens gefixeerd in PFA, gepermeabiliseerd en gekleurd voor interferon (IFN) -γ en geanalyseerd met flow cytometrie.Zoals bij andere flowcytometrie gebaseerde bepaling, wanneer de cellen worden behandeld met fixatie en permeabilisatie buffer met PFA, geïnfecteerde monsters kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking en analyse. In verschillende gepubliceerde studies, hebben we gebruik ICS T celeffectorfuncties meten WNV-geïnfecteerde muizen 13,14. Hoewel het goed gevestigd, een belangrijk nadeel van deze test is dat de procedure zeer langdurig en tijdrovend wanneer deze binnen BL3 voorzieningen kunnen zijn. Hier werd een micro-centrifugebuis ICS-methode getoond haalbaarder, gemakkelijker te gaan en minder tijdrovend wanneer deze binnen een BL3 laboratorium zijn.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>opwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>anti-CD11c magnetische kralen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>volg de instructies van de fabrikant&rsquo;s</td></tr><tr><td>anti-CD4 magnetische kralen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>volg de instructies van de fabrikant&rsquo;s</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>OVA residu 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptiden</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A oplossing</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd CD4</td><td>e-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd CD8</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Fixatie/Permeabilisatie Oplossing</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilisatie/wasbuffer</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Accuri flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro analyse van myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op west nile virus mutantstam infectie

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Een verzwakt West Nile virus (WNV), een niet-structurele (NS) 4B-P38G mutant geïnduceerde hogere aangeboren cytokine en T cel responsen dan het wildtype WNV bij muizen. Onlangs, myeloïde differentiatie factor 88 (MyD88) signalering werd getoond belangrijk voor initiële T-cel priming en geheugen T-cel ontwikkeling te zijn tijdens WNV NS4B-P38G mutant infectie. In deze studie twee stroomcytometrie-gebaseerde methoden - een in vitro T-cel priming assay en een intracellulaire cytokine kleuring (ICS) - werden gebruikt om dendritische cellen (DCs) en T celfuncties beoordelen. In de T-cel priming test werd celproliferatie geanalyseerd door flow cytometrie na co-cultuur van DCs uit beide groepen muizen met carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) - gelabelde CD4 + T-cellen van OTII transgene muizen. Deze aanpak gaf een nauwkeurige bepaling van het percentage prolifererende CD4 + T-cellen met aanzienlijk verbeterde algehele gevoeligheid dan de traditieal assays met radioactieve reagentia. Een microcentrifugebuis werd gebruikt in zowel celkweek en cytokine kleuringen van de ICS protocol. Vergeleken met de traditionele weefselkweek-plate-gebaseerd systeem, deze aangepaste procedure was makkelijker om te presteren op de bioveiligheid niveau (BL) 3 faciliteiten. Bovendien werden WNV- geïnfecteerde cellen behandeld met paraformaldehyde in beide assays, die verdere analyse buiten BL3 faciliteiten ingeschakeld. Kortom, kunnen deze in vitro immunologische assays worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen in WNV infectie efficiënt beoordelen.

In de T-cel priming test CFSE gelabelde CD4 + T-cellen werden gekweekt met gezuiverd DCs uit de NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen in de aanwezigheid of afwezigheid van OVA-peptiden. Gelabelde T cellen alleen gekweekt met of zonder OVA gedurende 5 dagen werden als negatieve controles. Zoals getoond in figuur 1A, zijn de totale T-cellen gated voor analyse van de fluorescentie-intensiteit op het FL1 kanaal. De markering is ingesteld gebaseerd op de vers gem...

Twee op flowcytometrie gebaseerde methoden – een in vitro T-cel priming test en intracellulaire cytokine kleuring werden gebruikt om de antigeenpresenterende capaciteit van dendritische cellen en antigeenspecifieke T-celreacties op een West Nile-virus mutant infectie bij muizen te meten.

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Het algemene doel van dit onderzoek is om twee op flowcytometrie gebaseerde immunologische assays te introduceren voor het meten van de celgemedieerde immuunrespons op West-Nijlvirusinfectie in de in vitro T-celprimering assay dendritische cellen, of dc's gezuiverd uit met West-Nijlvirus geïnfecteerde muizen. Een co-cultuur met naïeve CFSE-gelabelde T-cellen gezuiverd uit OT twee transgene muizen in de aanwezigheid van ova-peptide. De proliferatierespons van de T-cellen wordt vervolgens geanalyseerd door flowcytometrie in een bioveiligheidslaboratorium van niveau twee in de gemodificeerde intracellulaire cytokinekleuring assay PLE cyten van met West-Nijlvirus geïnfecteerde muizen, A gestimuleerd ex vivo met West-Nijl specifieke peptiden in een microcentrifugebuisje en vervolgens de cel duurzaam voor intracellulaire cytokine productie en geanalyseerd in de buis door flowcytometrie in het bioveiligheidsniveau twee laboratorium.Uiteindelijk kunnen deze methoden worden gebruikt om de rol van specifieke signaalroutes in de activering van T-cellen bij met West-Nijlvirus geïnfecteerde dieren te onderzoeken, en ze verminderen aanzienlijk de prestatietijd binnen bioveiligheidsniveau drie faciliteiten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de westerse N-viruscellulaire immuniteit, kan deze ook worden toegepast op andere bioveiligheidsniveau drie pathogenen voor de in vitro T-celprimering assay. Begin met het isoleren van splenische dendritische cellen van wild type C 57 zwarte zes A, my D acht acht knock-out muizen geïnoculeerd met West-Nijlvirus en controle niet-geïnfecteerde dieren met anti CD 11 C magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.Vervolgens om de T-cellen te isoleren, homogeniseer de milt die is verwijderd uit een OT twee muis met de bevroren uiteinden van twee slides, breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis, voeg vervolgens RPMI-medium toe tot een eindvolume van 40 milliliter. Laat de cellen vijf minuten bezinken en breng vervolgens 30 milliliter van de bovenste naar een nieuwe 50 milliliter conische buis. Gebruik vervolgens een CD vier positieve T-cel isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant om de CD vier positieve T-cellen te sorteren en breng vervolgens de verzamelde cellen over in een 50 milliliter conische buis gevolgd door twee wasbeurten in PBS Na de tweede wasbeurt, incubeer de cellen in PBS met 0,5% bovine serum albumine bij een tijd van zes cellen per milliliter en 0,5 micromolar per milliliter CFSE bij 37 graden Celsius beschermd tegen licht na 10 minuten, incubeer de cellen in vijf milliliters koud, compleet medium op ijs gedurende vijf minuten.Vervolgens, na nog een PBS-wasbeurt, fixeer 0,2 keer 10 tot de zes CFSE-gelabelde CD vier positieve T-cellen in 2%PFA en bepaal de basale expressie van CFSE van de T-cel door flowcytometrie. Resuspendeer de rest van de CFSE-gelabelde cellen, onvolledig, medium en kweek vervolgens twee keer 10 tot de vijf gezuiverde ot twee CD vier positieve T-cellen alleen of met twee keer 10 tot de vier gezuiverde wild-type of my D acht acht knock-out dc's in een 24-wellsplaat met of zonder een microgram per milliliter over residue 3 23 3 39 in één milliliter compleet medium per putje bij 37 graden Celsius na vijf dagen, oogst de cellen en was ze twee keer in facts buffer en fixeer de pellets in 0,25 milliliter 2%PFA en vortex de monsters onmiddellijk voor flowcytometriegegevensverwerving. Dubbelklik op de flowcytometriesoftware en selecteer kanalen nul tot 200.000 op forward scatter en nul tot 200.000 op side scatter om een dichtheidsplot te genereren.Maak vervolgens een poort op de levende putjes om de fluorescentie-intensiteit van de CFSE te analyseren. Open de histogram voor het FL een kanaal en verwerf 20.000 gebeurtenissen op de poortgehele populatie. Stel vervolgens een marker op de steekproeven voor de OT twee cellen die alleen zijn gekweekt.Verwerf gegevens voor de OT twee cellen co-cultuur met wild-type of my D acht acht knock-out dc's op een vergelijkbare manier voor de intracellulaire cytokinekleuring assay. Na het genereren van een enkele celsuspensie van milten geoogst uit met West-Nijlvirus geïnfecteerde muizen op de juiste tijdstippen tel de cellen en verdun ze vervolgens met compleet medium tot een 2,5 keer centi van de zes cellen per milliliter concentratie. Eloqua vervolgens één milliliter van de cyten in een 1,5 milliliter microcentribuisje.En om de CD acht positieve T-cellen te stimuleren, voeg 10 microliter vers verdunde Western-specifieke peptiden toe gevolgd door één microliter veld. In een oplossing, meng de celsuspensies voorzichtig en prik vervolgens twee gaten in de dop van de buis met een 18 gauge naald en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf uur. Na de overbrenging van de cellen in een nieuw microcentrifugebuisje en draai ze naar beneden na een wasbeurt van één milliliter faxbuffer, resuspendeer de tweede pellet in 120 microliters faxbuffer.Blokkeer vervolgens de niet-specifieke bindingsplaatsen met FC-blok en label de buizen met de geschikte experimentele en controleantilichamen zoals beschreven in de tabel. Incubeer vervolgens de cellen in fixatie- en permeabilisatiebuffer en breng vervolgens de cellen over naar een bioveiligheidsniveau twee laboratorium voor labeling met controle of anti-interferon gamma antilichamen volgens de tabel. Om de intracellulaire cytokineproductie te meten, stel een voorwaartse bijzijde scatter plot in zoals zojuist gedemonstreerd en poort vervolgens de levende cellen met behulp van de compensatiebuizen om de spanningen indien nodig aan te passen.Maak één stipplot om de verzamelde gegevens weer te geven voor de CD acht positieve versus interferon gamma positieve cellen, gevolgd door een andere voor de CD vier positieve versus interferon gamma positieve cellen en verwerf 50.000 gebeurtenissen voor de poortgehele populatie van elk monster. In dit experiment werden de totale C-cellen gepoort om de basale T-celproliferatiesnelheid te bepalen. In afwezigheid van co-cultuur met dc's.Toen de T-cellen werden geco-cultuurd met DC geïsoleerd uit met West-Nijlvirus geïnfecteerde dieren, vertoonden de CFSE-positieve T-cellen een 87% proliferatie. CFSE-ge

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

γ-herpesvirussen (γ-HVS) het vaststellen van een leven lang persistentie in hun gastheer. Infectie van muizen met γ-HV68 biedt een genetisch...

Meting van γHV68 infectie in Muizen

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

Leer twee flowcytometrie-gebaseerde immunologische assays om T-celreacties op West-Nijlvirus te meten via dendritische cellen. Deze methoden verminderen de noodzaak van hoge bioveiligheidsfaciliteiten.

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

Meer video's verkennen