Name: Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer hoe je het Cag-T4SS secretiesysteem van Helicobacter pylori visualiseert met hoogresolutie elektronenmicroscopie. Deze methode toont hoe ijzerbeschikbaarheid de productie van pili beïnvloedt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 en de CTSA award UL1TR000445 van het National Center for Advancing Translational Sciences. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Center for Advancing Translational Sciences of de National Institutes of Health. Scanning electron microscopy experimenten werden deels uitgevoerd met behulp van de VUMC Cell Imaging Shared Resource, ondersteund door NIH-grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 en EY08126.

1. H. pylori Groei in diverse omstandigheden van de beschikbaarheid van ijzer en co-cultuur met Human maagepitheelcellen <ol><li> Selecteer H. pylori stam PMSS1 voor deze studies aangezien het een intact cag pathogeniteit eiland en drukt een soort werking IV secretiesysteem. Ook gebruik maken van een isogene kooi mutant (PMSSI Δ kooi) als negatieve controle. Groeien bacteriën op TSA-platen aangevuld met 5% schapenbloed (agarplaten) gedurende 24 uur bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2. OPMERKING: Bereid reagentia en assembleren materialen zoals beschreven in de materialen en apparatuur Table. Eindconcentraties voor elk reagens wordt tussen haakjes weergegeven. </li><li> Schraap bacteriën uit de plaat met behulp van een steriel wattenstaafje en te enten in gewijzigde Brucella bouillon bereid uit componenten (zie materialen en apparatuur tabel) en aangevuld met cholesterol. Incubeer culturen overnacht bij 37° C in kamerlucht aangevuld met 5% CO2 met schudden bij 200 omwentelingen per minuut (rpm). OPMERKING: Cholesterol wordt gebruikt in plaats van foetaal runderserum omdat dat serum complex; met talrijke bronnen van voedingsstoffen ijzer zoals heem die variabiliteit in resultaten veroorzaakt. </li><li> Op de dag van bacteriële kweken, zaad AGS menselijke maagepitheelcellen (ATCC CRL-1739) op met poly-D-lysine behandelde dekglaasjes in platen met 12 putjes (ongeveer 1 x 10 5 cellen per putje). </li><li> De volgende dag, verdund bacterieculturen tot een OD600 van 0,3 in gewijzigde Brucella bouillon alleen of gesupplementeerd met 100 pM FeCl3, 200 uM dipyridyl (een synthetisch ijzercheleringsmiddel), of 200 uM dipyridyl plus 250 pM FeCl3. Incubeer deze kweken gedurende 4 uur bij 37 ° C in kamerlucht aangevuld met 5% CO2 met schudden bij 200 rpm. </li><li> Centrifuge bacteriën op 1000 xg om cellen te verzamelen en bovenstaande vloeistoffen te verwijderen voordat resuspenderen in een gelijk volume verse gemodificeerde Brucella-bouillon aangevuld met cholesterol. Meet OD600 van de cultuur (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 cellen / ml) en bacteriën aan de epitheelcellen in een multipliciteit van infectie (MOI) van 20: 1. Voer seriële verdunningen en plaat bacteriële cellen op bloed agar platen om bacteriële levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. </li><li> Incubeer H. pylori en AGS menselijke maagepitheelcellen co-kweken gedurende 4 uur bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2 in rusttoestand voor het uitvoeren scanning elektronenmicroscopie (SEM) monstervoorbereiding. </li></ol> 2. SEM Monstervoorbereiding naar Visualiseer H. pylori Cag-T4SS Pili <ol><li> Verwijder H. pylori en AGS co-culturen uit de incubator en decanteren kweeksupernatans (sparen voor IL-8 ELISA). Voorzichtig driemaal met 0,05 M natriumcacodylaat (pH 7,4). Fix monsters gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur in een oplossing van 2,0% paraformaldehyde, 2,5% Glutaaraldehyde en 0,05 M natriumcacodylaat buffer. Na primaire fixatie, wassen monsters driemaal met 0,05 M natriumcacodylaat buffer. </li><li> Voer secundaire fixatie met behulp van 0,1% osmiumtetroxide in 0,05 M natriumcacodylaat buffer in twee opeenvolgende 10 min fixatie stappen. Na de middelbare fixatie, wassen monsters drie keer met 0,05 M natriumcacodylaat buffer. </li><li> Na primaire en secundaire fixatie, gedehydreerd monsters door opeenvolgende wassen met toenemende concentraties ethanol volgens tabel 1. </li><li> Na ethanol uitdroging, voeren drie opeenvolgende wasbeurten van vloeibare kooldioxide. Dan droge monsters op een kritiek punt met behulp van een kritisch punt droger bij een temperatuur van 31,1 ° C en een druk van 1073 psi. </li><li> Mount coverslips op aluminium SEM monster stubs en schilderen met een dunne lijn van colloïdaal zilver op het monster rand om passende aarding te realiseren en te voorkomen dat het opladen tijdens SEM beeldvorming. </li><li> Coat monsters met 5 nm vangoud-palladium met een sputter jas machine monster secundaire elektron signaal en edge-effect te vergroten. </li></ol> 3. Imaging Parameters voor hoge resolutie SEM Analyses <ol><li> Bekijk monsters met een Field-Emission Gun Scanning Electron Microscope (FEG-SEM). </li><li> Beeld in een hoog vacuüm modus bij een werkafstand van 5-10 mm. </li><li> Stel de versnellingsspanning 5 kV. </li><li> Stel spotgrootte naar 2-2,5. </li><li> Kantel het monster tussen de 15-25 graden om een ​​beter beeld van de gastheer-pathogeen-interface te bereiken. </li><li> Prioriteit afbeelden bacteriën aanhanger van de randen van de epitheelcellen voor sterk vergrotende bekijken, aangezien deze gebieden van gastheer-pathogeen interactie aanrijking-pili bacteriën. </li></ol> 4. Statistische analyses te evalueren Pili Quantificaties <ol><li> Analyseer H. pylori Cag-T4SS pili behulp ImageJ software om aantal pili / cel evenals procent van de cellen te kwantificeren tentoonstellen van de piliated phenotype per onderstaande instructies. </li><li> Open microfoto bestanden ImageJ software. Identificeer pili als structuren gevormd tussen de bacteriële cel en gastheercel met uniforme breedte (10-13 nm) en lengte (60-150 nm). OPMERKING: De pilus structuur aanwezig WT bacteriestammen, maar afwezig isogene stammen zoals Δ kooi mutante stammen, die een inactivering in het gen coderend voor het ATPase belangrijkste krachten die type IV secretie pilusassemblage haven is. </li><li> Kalibreer het meetinstrument door een lijn te trekken met de rechte lijn gereedschap en vervolgens te klikken op de tab &quot;Analyseren&quot;. Selecteer &quot;Set Schaal&quot; uit het dropdown menu en voer de vergroting bar waarde in het vakje &quot;bekende afstand&quot; en stel de lengte-eenheid om de juiste instelling (nm). Klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Meet Cag-T4SS pili volgens de lineaire tool om te tekenen over de lengte of de breedte van de pilus en druk op &quot;Ctrl-M&quot; aan elke pilus meten. Houd u een dialoogvenster met de gemeten waarden. Noteer deze waarden of kopiëren en plakken in een spreadsheet programma. </li><li> Gebruik de lengte en breedte parameters eerder 24, veronachtzaming kenmerken die niet in het profiel passen CAG-T4SS opgericht. Kwantificeren dan het aantal pili gebaseerd op waarden die binnen de 10-13 nm breedte en 60-150 nm lengte afgrenzingsprocedures. </li><li> Analyseer de kwantificering van pili statistisch door tweezijdige Student t-test met behulp van GraphPad Prism software. </li></ol> 5. Optioneel: Evaluatie van IL-8 secretie te correleren met Pilus Production <ol><li> Middels supernatanten van Stap 2.1 Voer een IL-8 ELISA instructies van de fabrikant met de kit (zie Materialen en uitrusting tabel). </li><li> Analyseer de IL-8 uitgescheiden door gastheercellen en bereken het percentage IL-8-inductie ten opzichte van WT PMSS1 alleen in medium gekweekt. Uitvoeren van statistische analyse met behulp van een tweezijdige Student t-test met behulp van GraphPad Prism zoftware. </li></ol>

<ol><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori%27s+helical+shape+and+stomach+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li>
<li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li>
<li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li>
<li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li>
<li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li>
<li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li>
<li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li>
<li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).</li>
<li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li>
<li>Cover, T. L., Peek, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li>
<li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gastric+IL-1%CE%B2+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420(2013).</li>
<li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li>
<li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li>
<li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li>
<li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li>
<li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li>
<li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li>
<li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li>
<li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

IJzer is een essentieel micronutriënt voor de meeste levensvormen, waaronder bacteriële pathogenen. In een poging om de levensvatbaarheid van binnendringende micro-organismen te beperken, gewervelde gastheren afzonderen voedingsstof ijzer in een proces dat bekend staat als &quot;nutritionele immuniteit&quot; 18. In reactie daarop bacteriële pathogenen ontwikkeld ijzer gebruiken als een globale signaalmolecule hun omgeving waarnemen en regelen de uitwerking van virulentie functies zoals ijzer acquisitie system...

H. pylori-infectie is een belangrijk risicofactor voor maagkanker1. De ziekteverloop varieert echter en hangt af van talrijke factoren, zoals de genetische aanleg van de gastheer, de genetische diversiteit van H. pylori-stammen en omgevingselementen zoals het dieet van de gastheer11. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat er een correlatie bestaat tussen H. pylori-infectie, ijzertekort (gemeten door verlaagde bloedferritine en hemoglobineconcentraties) en verhoogde productie van pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-8-secretie, die uiteindelijk leidt tot verhoogde progressie van de maagaandoening12. Acute H. pylori-infectie is ook geassocieerd met hypochlorhydrie, wat de mogelijkheid van de gastheer om voedingsijzer te absorberen belemmert, en uiteindelijk leidt tot veranderingen in de ijzerhomeostase13. Deze klinische bevindingen suggereren dat de beschikbaarheid van ijzer binnen de maagsfeer een belangrijke factor kan zijn in het ziekteverloop. In feite hebben diermodellen van H. pylori-infectie aangetoond dat een lage consumptie van dieetijzer maagaandoeningen verergert14. De verlaagde ijzerniveaus bij deze dieren vereisen dat H. pylori een ijzer-acquisitiereactie induceert om het ijzer te verkrijgen dat nodig is voor bacteriële replicatie. H. pylori heeft de capaciteit om het ijzertransport binnen gastheercellen te verstoren om bacteriële replicatie op een CagA-afhankelijke manier te faciliteren15. Interessant is dat het cag-pathogeniciteits-eiland is aangetoond dat het wordt gereguleerd door het ijzer-responsieve transcriptiefactor Fur16,17. Verder worden Cag+-stammen geassocieerd met verhoogde ontsteking en maagaandoeningen zoals kanker1. Deze bevindingen ondersteunen een model waarbij H. pylori de expressie van Cag-T4SS verandert in een poging om ijzer te verkrijgen van gastheercellen die zich in een ijzer-arme omgeving bevinden, wat resulteert in verergerde ziekteverlopen. 
Twee factoren die ontsteking en morbiditeit verhogen zijn Cag-expressie en een lage inname van dieetijzer. Deze feiten ondersteunen de hypothese dat verminderde ijzerbeschikbaarheid de productie van Cag-T4SS-pili op het gastheer-pathogeen-interface verhoogt, wat resulteert in ernstigere maagaandoeningen11-14. Het doel van de methode die in dit manuscript wordt gepresenteerd, is om de rol van het micronutriënt ijzer in de regulatie van de biogenesis van de Cag-T4SS-pilus te bepalen. In eerder werk hebben we twee benaderingen gebruikt om een ijzer-afhankelijke toename in Cag-T4SS-expressie waar te nemen. Ten eerste werden output-stammen van dieren die op een hoog en een laag ijzerdieet werden gehouden geanalyseerd en onthulden dat output-stammen met een laag ijzerdieet meer Cag-T4SS-pili produceerden dan stammen met een hoog ijzerdieet14. Ten tweede resulteerde het kweken van de H. pylori 7.13-stam in vitro in ijzerrijke omstandigheden in verminderde pilusvorming, terwijl cellen die in aanwezigheid van een ijzerchelator werden gekweekt significant meer pili produceerden.
We hebben doorgegaan met het onderzoeken van de ijzer-afhankelijke regulatie van het Cag-T4SS-pili-fenotype en bieden het volgende geoptimaliseerde protocol en representatieve resultaten aan die werden uitgevoerd met een extra Helicobacter pylori-stam, PMSS1. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze techniek was om verhoogde Cag-T4SS-activiteit onder omstandigheden van ijzerbeperking te correleren met verhoogde Cag-T4SS-pilusvorming. De bredere implicatie en toepassing van deze techniek zullen geoptimaliseerde kweekcondities opleveren die resulteren in verhoogde productie van de Cag-T4SS-pili. Deze assay zal nuttig zijn voor onderzoekers die de samenstelling en architectuur van de Cag-T4SS willen bepalen door verrijking voor dit belangrijke bacteriële oppervlaktekenmerk. De monstervoorbereiding en visualisatie door veld-emissiekan elektronenmicroscopie heeft talrijke voordelen ten opzichte van alternatieve technieken zoals lichtmicroscopiemethoden om de Cag-T4SS te visualiseren en zal geschikt zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de regulatie van dit orgaan10.

<table><tbody><tr><td>Gemodificeerde brucella bouillon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton van caseïne (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>Peptische digestie van dierlijk weefsel (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract (2 g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (1 g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (5 g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250X) (4 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>Ferric chloride (100 of 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dipyridyl (200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gemodificeerde RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (100 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Bereiding voor elektronenmicroscopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (2,0% waterig)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde (2,5% waterig)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylate (0,05 M)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (0,1% waterig)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (absoluut)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Colloïdaal zilververf</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>SEM-steekproefstubs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>Evaluatie van IL-8-secretie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 ELISA-kit</td><td>R&amp;D Systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge resolutie elektronenmicroscopie van de helicobacter pylori cag type iv afscheiding system pili geproduceerd in wisselende omstandigheden van iron beschikbaarheid

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is een spiraalvormig, gramnegatief bacterium dat de menselijke maag van de helft van de wereldbevolking koloniseert1,2. H. pylori is de primaire oorzaak van maagkanker, de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd3. Een virulentiefactor die is geassocieerd met een verhoogd risico op maagaandoeningen, is het Cag-pathogeniciteits-eiland, een 40-kb gebied binnen het chromosoom van H. pylori dat codeert voor een type IV-secretiesysteem en de cognate effectormolecuul, CagA4,5. De Cag-T4SS is verantwoordelijk voor het transporteren van CagA en peptidoglycaan naar gasthercepitheelcellen5,6. De activiteit van de Cag-T4SS resulteert in talrijke veranderingen in de biologie van gasthercelten, waaronder upregulatie van cytokine-expressie, activering van pro-inflammatoire paden, cytoskeletaal hermodellering, en inductie van oncogeen celsignaleringsnetwerken5-8. De Cag-T4SS is een macromoleculair apparaat dat bestaat uit sub-assemblagecomponenten die de binnen- en buitenmembraan overspannen en zich naar buiten uitstrekken vanuit de cel in de extracellulaire ruimte. Het extracellulaire deel van de Cag-T4SS wordt de “pilus” genoemd5. Talrijke studies hebben aangetoond dat de Cag-T4SS-pilia worden gevormd op het gastheer-pathogeen-interface9,10. De omgevingskenmerken die de biogenese van dit belangrijke orgaan regelen, blijven echter grotendeels onduidelijk. Onlangs hebben we gerapporteerd dat omstandigheden van lage ijzerbeschikbaarheid de Cag-T4SS-activiteit en pilus-biogenese verhoogden. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om H. pylori te kweken onder verschillende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid voorafgaand aan co-cultuur met menselijke maagepitheelcellen. Verder presenteren we het uitgebreide protocol voor visualisatie van het hyper-piliated fenotype dat wordt vertoond onder ijzerbeperkte omstandigheden door middel van hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie analyses.

In dit rapport hebben we aangetoond dat de voorwaarden van wisselende beschikbaarheid van ijzer hebben de capaciteit om te moduleren H. pylori Cag-T4SS pilus biogenese bij de gastheer-pathogeen-interface. Wanneer gekweekt in medium alleen, H. pylori vormt een gemiddelde van 3 pili / cel. Toen H. pylori wordt gekweekt in ijzer afbrekende omstandigheden (de synthetische chelator dipyridyl) die sub-remmend bacteriegroei (figuur 1), de bacteriën talrijke Cag-T4SS pili (~ 7 pili / ...

Hier beschrijven we een methode om het oncogene bacteriële orgaantje, bekend als het Cag Type IV Secretie Systeem (Cag-T4SS), te visualiseren. We ontdekken dat de Cag-T4SS differentieel wordt geproduceerd op het oppervlak van H. pylori als reactie op wisselende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid.

Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

De procedure visualiseert de hyperproductie van CAG type vier secretiesysteem pii, die optreedt onder omstandigheden van ijzerbeperking, eerst kweek h pylori onder omstandigheden van ijzerbeperking. De tweede stap is om h pylori co-te kweken met maag-epitheliale cellen. Vervolgens worden de co-cultuur monsters verwerkt voor rasterelektronenmicroscopie.Uiteindelijk wordt hoge resolutie rasterelektronenmicroscopie gebruikt om verhoogde CAG type vier secretiesysteem pi oogproductie onder omstandigheden van ijzerbeperking te tonen. De techniek in dit manuscript is belangrijk voor h pylori gerelateerde ziekten zoals maagkanker omdat het CAG type vier secretiesysteem geassocieerd is met een verhoogd risico op negatieve ziekteresultaten. Zodoende kan een beter begrip van de regulering van dit belangrijke bacteriële oppervlak nieuwe chemotherapeutische doelen onthullen. Het voordeel van hoge resolutie rasterelektronenmicroscopie versus bestaande methoden zoals fluorescentiemicroscopie is dat individuele type vier secretie pill I kan worden gevisualiseerd. Personen die nieuw zijn in deze methode van elektronenmicroscopie hebben problemen met de procedure, specifiek de natte chemie omdat het zorgvuldige timing en een delicate hand vereist Op bloed. Agar platen groeien.H Pylori PMs, S one bacteriën, en zijn isogene CAG e mutant, die een functionerend type vier secretiesysteem mist. Inoculeer culturen en gemodificeerd Ella bouillon gesupplementeerd met cholesterol om overnacht te groeien. Zaai vervolgens een GS menselijke maag-epitheliale cellen op polylysine behandelde deksels in 12 welborden voor variërende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid.Verdun de h pylori tot een optische dichtheid 600 van 0,3 in gemodificeerde bru bouillon alleen. Media bevattende 100 micromolars van ijzerchloride, 200 micromolars van de synthetische ijzerchelator dipper of 200 micro van dipper plus 200 micromolars van ijzerchloride cultuur. De monsters gedurende vier uur centrifugeren nu de bacteriën bij 1000 Gs en Resus suspendeer de pellets in een gelijk volume vers gemodificeerd bru bouillon gesupplementeerd met cholesterol.Meet de bacteriedichtheid. Infecteer vervolgens de epitheliale cellen met de h pylori bij een infectiviteitsmultipliciteit van 20 tot één. Voer seriële verdunningen uit en plateer de bacteriecellen op bloedagarplaten.Om de levensvatbaarheid van bacteriecellen te beoordelen, plaats de co-culturen gedurende vier uur in de celcultuur incubator. Decanteer het supernatant van de h pylori I en a GS co-culturen. Was de aanhechtende cellen voorzichtig drie keer met 0,05 molare natriumcoate buffer.Fixeer vervolgens de monsters gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de monsters drie keer met 0,05 molare natriumca coate buffer. Voeg voor een secundaire fixatie 0,1% osmium tetroxide toe in 0,05 molare natriumca coate buffer in twee opeenvolgende 10 minuten fixatie stappen.Na drie wasbeurten, dehydrateer de monsters met verhoogde concentraties ethanol. Plaats de monsters in een kritische punt droogmachine, vul vervolgens de kamer met vloeibaar kooldioxide. Ethanol wordt uit de kamer gepompt en de kamer wordt opnieuw gevuld met vloeibaar kooldioxide.De monster wordt vervolgens naar het kritische punt van 31,1 graden Celsius en 1073 PSI genomen, monteer nu de deksels op aluminium SEM monsterstubs en schilder een dunne lijn colloïdaal zilver aan de monsterrand voor aarding. Tijdens SEM-beeldvorming, bedek de monsters met vijf nanometer goud palladium om het secundaire elektronensignaal en de randeffect van het monster te verhogen. Gebruik een sputtercoat machine. Onderzoek de monsters met een veld emissie kanon rasterelektronenmicroscoop beeld in een hoog vacuüm modus op een werkafstand van vijf tot 10 millimeter.Stel de versnellingsspanning in op vijf kilovolt. Stel vervolgens de spotgrootte in op twee tot 2,5. Kantel nu het monster tussen 15 tot 25 graden om een beter zicht op de hostpathogeen interface voor hoge vergroting te bereiken.Prioriteer de beeldvorming van bacteriën die zich hechten aan de randen van de epitheliale cellen voor PI leven verwarmende bacteriën verrijkt in hostpathogeen interacties. Open de micrografie bestanden in Image J software. Identificeer pi li als structuren die zich vormen tussen de bacteriecel en gastheercel met een uniforme breedte van 10 tot 13 nanometer en een lengte van 60 tot 150 nanometer.Kalibreer het meetgereedschap door een lijn te tekenen met het rechtlijnige gereedschap en klik vervolgens op het analysetabblad in het vervolgkeuzemenu. Selecteer schaal instellen en voer de vergrotingsbalk waarde in onder bekende afstand en stel de lengte-eenheid in op de nanometer. Klik vervolgens op OK.Gebruik nu een rechtlijnig gereedschap om over de lengte of breedte van de piloten te tekenen en druk vervolgens op controle M om elke piloten te meten en de gemeten waarden op te nemen in een spreadsheetprogramma. Gebruik eerder vastgestelde lengte- en breedteparameters om functies die niet passen in het profiel van CAG type vier secretiesysteem te negeren. Kwantificeer vervolgens het aantal PI I op basis van waarden die statistisch geanalyseerd zijn binnen het bereik, een kwantificering van de PI LI met behulp van een tweezijdige student T-test.In dit experiment werden h pylori gekweekt onder ijzergedepleteerde omstandigheden met behulp van de synthetische chelator dip parital bij concentraties die de groei niet significant remmen. De bacteriën produceerden talrijke CAG type vier secretiesysteem PII bij co-cultuur met humane maagcellen. Omgekeerd, wanneer een exogene bron van voedingsijzer aanwezig is, wordt de vorming van CAG type vier secretiesysteem PII geremd.Kwantificering van de PII op de hostpathogeen interface geeft aan dat in omstandigheden van ijzerrestrictie, h pylori een tweevoudige toename vertoont in CAG type vier secretiesysteem PI oog, het percentage pileated cellen neemt toe met 11% vergeleken met cellen die in medium alleen zijn gekweekt. Interessant is dat hoewel de activiteit van het CAG type vier secretiesysteem gemeten door host IL acht secretie is verbeterd onder omstandigheden van ijzerrestrictie en onderdrukt onder omstandigheden van overmatige ijzerbeschikbaarheid, blijven de PI LI afmetingen consistent onder alle omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid. In overeenstemming met

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Muizen vertegenwoordigen een onschatbare waarde in vivo -model om te studeren van besmetting en ziekten veroorzaakt door gastro-intestinale micro-organismen. Hier beschrijven we de methoden gebruikt bij het bestuderen van bacteriële kolonisatie en histopathologische veranderingen in muismodellen van Helicobacter pylori-gerelateerde ziekte.

Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Leer hoe je het Cag-T4SS secretiesysteem van Helicobacter pylori visualiseert met hoogresolutie elektronenmicroscopie. Deze methode toont hoe ijzerbeschikbaarheid de productie van pili beïnvloedt.

Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid (Video) | JoVE Journal

Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid

Meer video's verkennen