Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid

De procedure visualiseert de hyperproductie van CAG type vier secretiesysteem pii, die optreedt onder omstandigheden van ijzerbeperking, eerst kweek h pylori onder omstandigheden van ijzerbeperking. De tweede stap is om h pylori co-te kweken met maag-epitheliale cellen. Vervolgens worden de co-cultuur monsters verwerkt voor rasterelektronenmicroscopie.

Uiteindelijk wordt hoge resolutie rasterelektronenmicroscopie gebruikt om verhoogde CAG type vier secretiesysteem pi oogproductie onder omstandigheden van ijzerbeperking te tonen. De techniek in dit manuscript is belangrijk voor h pylori gerelateerde ziekten zoals maagkanker omdat het CAG type vier secretiesysteem geassocieerd is met een verhoogd risico op negatieve ziekteresultaten. Zodoende kan een beter begrip van de regulering van dit belangrijke bacteriële oppervlak nieuwe chemotherapeutische doelen onthullen. Het voordeel van hoge resolutie rasterelektronenmicroscopie versus bestaande methoden zoals fluorescentiemicroscopie is dat individuele type vier secretie pill I kan worden gevisualiseerd. Personen die nieuw zijn in deze methode van elektronenmicroscopie hebben problemen met de procedure, specifiek de natte chemie omdat het zorgvuldige timing en een delicate hand vereist Op bloed. Agar platen groeien.

H Pylori PMs, S one bacteriën, en zijn isogene CAG e mutant, die een functionerend type vier secretiesysteem mist. Inoculeer culturen en gemodificeerd Ella bouillon gesupplementeerd met cholesterol om overnacht te groeien. Zaai vervolgens een GS menselijke maag-epitheliale cellen op polylysine behandelde deksels in 12 welborden voor variërende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid.

Verdun de h pylori tot een optische dichtheid 600 van 0,3 in gemodificeerde bru bouillon alleen. Media bevattende 100 micromolars van ijzerchloride, 200 micromolars van de synthetische ijzerchelator dipper of 200 micro van dipper plus 200 micromolars van ijzerchloride cultuur. De monsters gedurende vier uur centrifugeren nu de bacteriën bij 1000 Gs en Resus suspendeer de pellets in een gelijk volume vers gemodificeerd bru bouillon gesupplementeerd met cholesterol.

Meet de bacteriedichtheid. Infecteer vervolgens de epitheliale cellen met de h pylori bij een infectiviteitsmultipliciteit van 20 tot één. Voer seriële verdunningen uit en plateer de bacteriecellen op bloedagarplaten.

Om de levensvatbaarheid van bacteriecellen te beoordelen, plaats de co-culturen gedurende vier uur in de celcultuur incubator. Decanteer het supernatant van de h pylori I en a GS co-culturen. Was de aanhechtende cellen voorzichtig drie keer met 0,05 molare natriumcoate buffer.

Fixeer vervolgens de monsters gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de monsters drie keer met 0,05 molare natriumca coate buffer. Voeg voor een secundaire fixatie 0,1% osmium tetroxide toe in 0,05 molare natriumca coate buffer in twee opeenvolgende 10 minuten fixatie stappen.

Na drie wasbeurten, dehydrateer de monsters met verhoogde concentraties ethanol. Plaats de monsters in een kritische punt droogmachine, vul vervolgens de kamer met vloeibaar kooldioxide. Ethanol wordt uit de kamer gepompt en de kamer wordt opnieuw gevuld met vloeibaar kooldioxide.

De monster wordt vervolgens naar het kritische punt van 31,1 graden Celsius en 1073 PSI genomen, monteer nu de deksels op aluminium SEM monsterstubs en schilder een dunne lijn colloïdaal zilver aan de monsterrand voor aarding. Tijdens SEM-beeldvorming, bedek de monsters met vijf nanometer goud palladium om het secundaire elektronensignaal en de randeffect van het monster te verhogen. Gebruik een sputtercoat machine. Onderzoek de monsters met een veld emissie kanon rasterelektronenmicroscoop beeld in een hoog vacuüm modus op een werkafstand van vijf tot 10 millimeter.

Stel de versnellingsspanning in op vijf kilovolt. Stel vervolgens de spotgrootte in op twee tot 2,5. Kantel nu het monster tussen 15 tot 25 graden om een beter zicht op de hostpathogeen interface voor hoge vergroting te bereiken.

Prioriteer de beeldvorming van bacteriën die zich hechten aan de randen van de epitheliale cellen voor PI leven verwarmende bacteriën verrijkt in hostpathogeen interacties. Open de micrografie bestanden in Image J software. Identificeer pi li als structuren die zich vormen tussen de bacteriecel en gastheercel met een uniforme breedte van 10 tot 13 nanometer en een lengte van 60 tot 150 nanometer.

Kalibreer het meetgereedschap door een lijn te tekenen met het rechtlijnige gereedschap en klik vervolgens op het analysetabblad in het vervolgkeuzemenu. Selecteer schaal instellen en voer de vergrotingsbalk waarde in onder bekende afstand en stel de lengte-eenheid in op de nanometer. Klik vervolgens op OK.

Gebruik nu een rechtlijnig gereedschap om over de lengte of breedte van de piloten te tekenen en druk vervolgens op controle M om elke piloten te meten en de gemeten waarden op te nemen in een spreadsheetprogramma. Gebruik eerder vastgestelde lengte- en breedteparameters om functies die niet passen in het profiel van CAG type vier secretiesysteem te negeren. Kwantificeer vervolgens het aantal PI I op basis van waarden die statistisch geanalyseerd zijn binnen het bereik, een kwantificering van de PI LI met behulp van een tweezijdige student T-test.

In dit experiment werden h pylori gekweekt onder ijzergedepleteerde omstandigheden met behulp van de synthetische chelator dip parital bij concentraties die de groei niet significant remmen. De bacteriën produceerden talrijke CAG type vier secretiesysteem PII bij co-cultuur met humane maagcellen. Omgekeerd, wanneer een exogene bron van voedingsijzer aanwezig is, wordt de vorming van CAG type vier secretiesysteem PII geremd.

Kwantificering van de PII op de hostpathogeen interface geeft aan dat in omstandigheden van ijzerrestrictie, h pylori een tweevoudige toename vertoont in CAG type vier secretiesysteem PI oog, het percentage pileated cellen neemt toe met 11% vergeleken met cellen die in medium alleen zijn gekweekt. Interessant is dat hoewel de activiteit van het CAG type vier secretiesysteem gemeten door host IL acht secretie is verbeterd onder omstandigheden van ijzerrestrictie en onderdrukt onder omstandigheden van overmatige ijzerbeschikbaarheid, blijven de PI LI afmetingen consistent onder alle omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid. In overeenstemming met