Een introductie tot de cellulaire en moleculaire neurowetenschappen

Van de eenvoudigste reflexen tot de meest sublieme emotionele ervaringen; ze zijn allemaal geworteld in moleculaire, genetische en cellulaire structuren in de hersenen. Als een van de nieuwste vakgebieden binnen de neurowetenschappen maakt de cellulaire en moleculaire neurowetenschap gebruik van de moleculaire biologie om te onderzoeken hoe genen, signaalmoleculen en cellulaire morfologie het zenuwstelsel beïnvloeden

Deze video presenteert baanbrekende ontdekkingen op dit gebied, behandelt kernvragen binnen het onderzoek naar cellulaire en moleculaire neurowetenschappen en laat tot slot enkele prominente methoden zien die kunnen worden toegepast om deze vragen te beantwoorden.

Laten we beginnen met een blik terug op de wetenschappelijke wortels van dit relatief jonge vakgebied.

Voordat er moleculaire technieken waren, domineerden anatomen en celbiologen de vroege geschiedenis van de neurowetenschappen.

In de jaren 30 zorgde een instroom van natuurkundigen, chemici en theoretici in de gelederen van biologen echter voor de start van de moleculaire revolutie, die culmineerde in de ontdekking van de DNA-structuur door Watson en Crick en de formalisering van het centraal dogma, dat uitlegde hoe DNA de eiwitten codeert die fungeren als de functionele eenheden van cellen. Voor het eerst waren neurowetenschappers in staat om de rol te onderzoeken die specifieke genen en eiwitten spelen in de functie van het zenuwstelsel.

In de jaren 60 was Seymour Benzer bijvoorbeeld in staat om gedragsveranderingen bij fruitvliegen te koppelen aan specifieke genetische mutaties, waarbij hij sleutelgenen identificeerde die tot expressie komen in neuronen die het gedrag, zoals voortbeweging, aansturen.

In dezelfde periode demonstreerde Eric Kandel dat complexe processen zoals leren ook een moleculaire basis hebben. Met behulp van de mariene weekdier Aplysia analyseerde hij extracten van neuronale weefsels en betrok hij het intracellulaire signaleringsmolecuul cyclisch AMP bij een pad dat cruciaal is voor het leerproces.

Vervolgens waren in de jaren 80 leden van het laboratorium van Shosaku Numa de eersten die sleutelmoleculen in de neuronale functie kloneerden, zoals het voltage-afhankelijke natriumkanaal. Analyses van de functionele domeinen binnen deze grote membraaneiwitten hebben sindsdien ons begrip verbeterd van hoe de controle over ionenbewegingen leidt tot het vuren van neuronen.

Een andere belangrijke ontdekking in de moleculaire mechanismen achter neuronale communicatie vond plaats in de jaren 90, toen Thomas Sudhof ontdekte dat calciumionen de vorm veranderen van eiwitten die neurotransmitter-gevulde blaasjes aan het celmembraan verankeren, wat verklaart hoe actiepotentialen leiden tot de nauwkeurig getimede afgifte van chemische signalen in de synaps.

Van de neurofysiologie tot het gedrag: ontdekkingen in de moleculaire neurowetenschappen hebben ons begrip van vele neurowetenschappelijke disciplines verbeterd.

Ondanks deze productieve geschiedenis is er nog veel te leren! Laten we enkele vragen bekijken die tegenwoordig in laboratoria worden gesteld.

Eén onderzoeksgebied richt zich op de vraag welke genen de neuronale functie beïnvloeden. Zo is bekend dat nucleotide-expansies in specifieke genen betrokken zijn bij verschillende ziekten die worden gekenmerkt door een gestage achteruitgang van de gezondheid van neuronen, zoals de ziekte van Huntington.

Een andere groep genen die wordt onderzocht, codeert voor transcriptiefactoren: eiwitten die de expressie van specifieke genen reguleren. Het identificeren van de DNA-doelen van transcriptiefactoren die specifiek zijn voor het zenuwstelsel kan ons een beter inzicht geven in het genetische programma dat ons in staat stelt om te denken.

Alternatief kunnen neurowetenschappers zich afvragen hoe moleculen het neuronale gedrag reguleren. Ze kunnen bijvoorbeeld de moleculaire machinerie bestuderen die de ionenbewegingen over het celmembraan reguleert, wat resulteert in de voortplanting van actiepotentialen. Onderzoek op dit gebied heeft geleid tot anesthetica zoals lidocaïne, dat specifieke ionkanalen blokkeert en de overdracht van pijnsignalen naar de hersenen stopt.

Alternatief kunnen wetenschappers de interactieplaatsen tussen neuronen onderzoeken, bekend als de synaps. Hier kunnen zij zich afvragen welke moleculen betrokken zijn bij het behoud van de integriteit van de synaps, en hoe deze verbindingen in ziekteverschijnselen hersteld kunnen worden.

Neuronale plasticiteit is het vermogen van het zenuwstelsel om zich chemisch en fysiek aan te passen als reactie op ervaring. Sommig onderzoek in dit veld is gericht op ervaringsafhankelijke morfologische veranderingen in complexe neuronale structuren, bekend als dendritische bomen, die synapsen vormen via hoogdynamische structuren die dendritische spines worden genoemd. Anderen zijn geïnteresseerd in hoe ervaring de distributie van neurotransmitterreceptoren op synaptische membranen kan wijzigen, wat de signaleringskracht van een synaps kan versterken in een fenomeen dat bekend staat als langetermijnpotentiëring, of LTP.

Zoals u kunt zien, benaderen cel- en moleculaire neurowetenschappers de neurobiologie vanuit een microscopisch perspectief, maar het scala aan processen dat zij bestuderen is uitgebreid.

Nu u bekend bent met enkele van de boeiende vragen die in laboratoria voor cel- en moleculaire neurowetenschappen worden gesteld, bekijken we de beschikbare instrumenten om deze te beantwoorden.

Ten eerste beschikken wetenschappers over zeer krachtige technieken om de genetische controle van neuronale functies te onderzoeken. Microarrays kunnen bijvoorbeeld de expressie van een groot aantal genen gelijktijdig kwantificeren. Een microarray is een oppervlak waaraan tienduizenden fragmenten van enkelstrengs DNA- "probes" zijn bevestigd. Genetisch materiaal dat uit een neuron is geëxtraheerd, krijgt de kans om aan de probes te binden, waarna fluorescente markers worden gebruikt om precies te visualiseren welke sequenties in het monster aanwezig zijn.

Als alternatief maakt real-time of kwantitatieve PCR gebruik van apparatuur die via een PCR-gebaseerde methode indirect de relatieve hoeveelheid van specifieke mRNA-transcripten kan meten. Deze aanpak is uiterst nuttig voor het detecteren van de expressieniveaus van individuele genen.

Tot slot is transgene technologie een belangrijk instrument voor het onderzoek naar genfuncties in het zenuwstelsel. Met deze methode kunnen onderzoekers dieren produceren waarbij delen van hun genoom zijn verwijderd, bekend als knock-outs, of waarbij gemodificeerde genen in hun genetische code zijn ingevoegd, bekend als transgenen. Zenuwstelselweefsels van deze dieren kunnen op diverse manieren worden geanalyseerd om te bepalen hoe veranderingen in genexpressie de cellulaire functie beïnvloeden.

Om de moleculaire controle van neuronale signalering te bestuderen, prefereren onderzoekers vaak om hersenweefsel buiten het dier te bestuderen, hetzij in kleine weefselstukjes of in gedissocieerde cellen die in vitro zijn gekweekt, genaamd primaire neuronale culturen. Een voordeel van dit vereenvoudigde systeem is de mogelijkheid om via transfectie efficiënt de expressie van genen van belang voor de neuronale signalering te manipuleren. De resultaten van deze genetische manipulaties kunnen vervolgens worden waargenomen door visualisatie van de eiwitlokalisatie, analyse van de celmorfologie of elektrofysiologische opnames.

Ten slotte maken spectaculaire vorderingen in de beeldvormingstechnologie het voor wetenschappers mogelijk om neuronale plasticiteit op nieuwe, boeiende manieren te bestuderen. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld tweefotonmicroscopie gebruiken om diepe lagen van levende weefsels in grote detail te visualiseren. Na het maken van een "venster" in de schedel kan deze techniek worden gebruikt om de morfologie van hersencellen te beelden vóór en nadat dieren een ervaring ondergaan, waardoor onderzoekers kunnen zien hoe leren er op neuronaal niveau uitziet.

Beeldvormingsinstrumenten worden ook gebruikt om moleculaire componenten van het zenuwstelsel in gepreserveerde weefsels te onderzoeken. Fluorescentiemicroscopie wordt vaak gebruikt in combinatie met immunohistochemie, waarbij monsters worden gekleurd met fluorescente antilichamen die de cellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten markeren.

Nu we zowel de belangrijke vraagstellingen als de instrumenten die worden gebruikt om deze te beantwoorden hebben besproken, kijken we naar enkele toepassingen van cel- en moleculair neurowetenschappelijk onderzoek.

Ten eerste kunnen onderzoekers door microarray-technieken toe te passen op een kleine populatie neuronen de verschillen in expressie van diverse genen in specifieke neuronale subtypen onderzoeken. Hier werden individuele neuronen uit de retina geïsoleerd en cellulair RNA geëxtraheerd, waardoor de onderzoekers de expressie van mRNA's konden profileren van cellen met verschillende functionele en morfologische kenmerken.

Moleculaire technieken kunnen ook worden toegepast om de reactie van het zenuwstelsel op letsel beter te begrijpen. Wanneer dorsale wortelganglia, of DRG's, uit volwassen muizen worden verwijderd voor primaire neuronale kweek, worden axonen noodzakelijkerwijs doorgesneden. Door de gedissocieerde DRG-neuronen te transfecteren met gen-silencing constructen, is het mogelijk om het effect van individuele eiwitten op de teruggroei van nieuwe axonen te testen.

Gespecialiseerde beeldvormingstechnieken kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe eiwitten, zoals neurotransmitterreceptoren, naar en van het synaptische membraan worden getransporteerd. In dit experiment werden gekweekte neuronen getransfecteerd met een gen dat codeert voor een fluorescent gelabeld membraaneiwit. Met behulp van een confocale microscoop werden vervolgens kleine regio's van het membraan gefotobleekt, wat betekent dat de fluorforen in dat gebied werden vernietigd. Met het hier gebruikte bleekschema weerspiegelt het progressieve herstel van fluorescentie, of FRAP, het transport van nieuwe fluorescerende eiwitten naar het plasmamembraan. De snelheid waarmee deze beweging plaatsvindt, kan worden gekwantificeerd en vergeleken over vele experimentele condities.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over cellulaire en moleculaire neurowetenschappen bekeken. In deze video hebben we de historische ontdekkingen besproken die de cellulaire en moleculaire neurowetenschappen hebben gevormd tot het vakgebied dat het nu is, enkele kernvragen binnen dit veld en de technieken die worden gebruikt om deze te beantwoorden.

Zoals altijd, bedankt voor het kijken naar JoVE Science Education!