Het beoordelen Leukocyte-endotheliale Interacties Onder stroomtoestanden in een Ex Vivo Autoperfused microflow Kamer Assay
30 december 2014
Hier presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker leukocytaantrekking dynamiek ex vivo evaluatie door er een kamer bekleed met endotheliaalverkregen adhesiemoleculen aan het circulatiesysteem van een muis. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen, omdat het zorgt voor leukocyten beoordeling op grond van de relatieve biologische omstandigheden.
Het algemene doel van deze procedure is om een ex vivo arterioveneuze gesloten circuit te creëren om leukocyte-interacties met endotheliale adhesiemoleculen onder fysiologische stromingsomstandigheden te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een dunne glazen kamer te coaten met de betreffende endotheliale adhesiemolecuul. In de tweede stap worden polyethyleen en siliconen slangen verbonden met de kamer en vervolgens chirurgisch aan de muis.
Vervolgens wordt bloed uit de halsslagader toegestaan om door de slangen te stromen. En de daaropvolgende interacties van de native leukocyten met de gecoate glazen kamer worden in realtime geregistreerd. Uiteindelijk kunnen de effecten van verschillende behandelingen op de verplaatsing en rolsnelheid van de leukocyten terwijl ze interageren met de geïmmobiliseerde adhesiemoleculen worden berekend over tijd.
Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande technieken zoals pro cytometry-analyse, is dat met deze techniek de interactie van leukocyten met endotheliale moleculen wordt beoordeeld onder fysiologische stromingsomstandigheden. Verbind de dag voor het experiment een centimeter PE 10 polyethyleen slang met een zes centimeter stuk siliconen slang, gevolgd door vijf centimeter polyethyleen slang. Om de slangopstelling voor de zijde van de halsslagader van het dier voor de zijde van de halsslagader voor te bereiden, verbind de slang zoals zojuist is gedemonstreerd met de toevoeging van een TTU binnen de zes centimeter siliconen slang, ongeveer 1,5 centimeter van de centimeter polyethyleen slang.
Verbind vervolgens een uiteinde van een 10 centimeter stuk siliconen slang met de druktransducer en steek het T-uiteinde van de T-buis van de halsslagader in het andere uiteinde. Zorg ervoor dat de verbindingspunten strak en lekloos zijn. Gebruik vervolgens een een milliliter spuit verbonden met een 25 gauge naald om elke microflowkamer te infuseren met het vers bereide eiwit van de endotheliale oppervlaktecoating van belang, en bewaar de gecoate kamers in een 15 milliliter buis bij vier graden Celsius overnacht de volgende dag.
Om de halsslagader en halsslagaderslangen met de microflowkamer te verbinden, verbind een centimeter siliconen slang met elke kant van de kamer en verzegel vervolgens de verbindingen met een klein rechthoekig stuk param dat over de slang is uitgerekt waar de slang de kamer ontmoet. Gebruik een spuit om de kamer en slangen te vullen met 0,1% bovine serum albumine. En controleer na het controleren op lekkage de kamer gedurende 45 minuten.
Bij kamertemperatuur, dicht bij het einde van de incubatie, stabiliseer de microflowkamer op een notch naar de petrischaal met een kleine druppel siliconen bij elke notch. Verbind vervolgens de halsslagader en halsslagaderslangen met elke kant van de kamer. Terwijl de siliconen droogt, verbind een 60 mil vergrendelingsslang gevuld met heparine met de druktransducer en laat 100 USP-graad heparine door de slang en kamer lopen tot er geen luchtbellen meer zijn.
Voordat de muis met de microflowkamer wordt verbonden, zet de computer, de microscoop en het juiste drukregistratieapparaat aan. Zodra de software is ingesteld, zet een 10 tot 12 weken oude muis vast. In de ventrale positie, maak een insnijding in het nekgebied met een schaar en vervolgens het schildklier om de luchtpijp en bloedvaten bloot te leggen.
Maak de halsslagader schoon totdat deze volledig bloot ligt. Zorg ervoor dat de nervus vagus niet wordt beschadigd. Breng vervolgens de bocht van een gevouwen stuk hechtmateriaal onder de halsslagader en snijd het hechtdraad bij de bocht.
Dus er zijn twee stukken hechtdraad onder de slagader. Haal elk hechtdraad in knopen zonder aan te halen en plaats vervolgens de hechtdraden voor de linkerhalsslagader op dezelfde manier. Wanneer de halsslagaders zijn geplaatst, injecteer één milliliter heparine in de muis ip.
Na de injectie, trek de bovenste hechtdraad aan de halsslagader aan en plaats een vatklem zo laag mogelijk op het blootgestelde gedeelte van de slagader. Gebruik een pincet om de slagader bij de bovenste hechtdraad vast te houden en gebruik vervolgens fijn microschaar om een kleine incisie te maken van ongeveer een achtste van de omtrek van de slagader dicht bij de bovenste hechtdraad. Plaats nu de halsslagaderslang met behulp van een slanghouder door de incisie in de slagader en leid deze door de onderste hechtdraad.
Bind vervolgens de onderste hechtdraad af, gevolgd door de bovenste. Zo wordt de slagader rond de slang afgesloten, maak verschillende knopen om een strakke afsluiting te garanderen. Na het herhalen van dezelfde procedure voor de halsslagaderslang, minus de vatklem, open tijdelijk de vatklem op de halsslagaderslang om de stroming te testen.
Als er geen lekken zijn, verplaats de muis naar de microscoop en verbind de halsslagader en halsslagaderslangen met de microflowkamerslangen om de rolsnelheid van de leukocyten door de microflowkamer te registreren. Laat de halsslagaderklem volledig los om de kamer te vullen. Laat het bloed drie tot vijf minuten circuleren zodat de stromingsomstandigheden stabiliseren.
Stel ondertussen de microscooptafel zo in dat de kamer op gelijke hoogte is met het microscoopobjectief en de rand ervan parallel is aan het venster voor video-opname op het scherm. Bouw vervolgens een petrischaal met kamertemperatuur water en plaats vervolgens het 10 x wateronderdompeling objectief in de schaal zodat de cellen die door de kamer stromen zichtbaar zijn, pas de lichtintensiteit aan om een gemiddelde fysiologische stromingsdruk te simuleren, pas de klem op de slang aan zodat de transducer een constante 30 millimeter kwik leest. Druk vervolgens op start om de opname van zowel het leukocytenvrachtverkeer als de druk te starten met de eerste time-lapse dicht bij het halsslagader uiteinde van de kamer en te bewegen tegen de stroming richting het halsslagader uiteinde tot voltooiing.
Wanneer de opname is voltooid, sluit de klep op de invoersite om de bloedstroom te stoppen en vervang de kamer door een nieuwe kamer gecoat met een andere adhesiemolecuul indien gewenst
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beoordelen van de dynamiek van leukocytenrekrutering ex vivo met behulp van een microflowkamer die is verbonden met het circulatiesysteem van een muis. De methode maakt real-time observatie mogelijk van interacties tussen leukocyten en endotheliale adhesiemoleculen onder fysiologische stroomcondities.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- De rekrutering van leukocyten is cruciaal voor immuunresponsen.
- Inzicht in leukocyt-endotheelinteracties kan therapeutische strategieën informeren.
- Bestaande technieken reproduceren fysiologische condities mogelijk niet nauwkeurig.
- Dit protocol is erop gericht deze beperkingen aan te pakken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor real-time beoordeling van leukocyten-dynamiek.
- Het evalueren van de effecten van behandelingen op het gedrag van leukocyten.
- Het verbeteren van het begrip van interacties tussen leukocyten onder stromingscondities.
Gebruikte methoden
- Het coaten van een glaskamer met endotheliale adhesiemoleculen.
- Het verbinden van de kamer met het bloedsomloopstelsel van de muis.
- Het infunderen van bloed en het registreren van leukocyteninteracties.
- Het analyseren van de rolrolsnelheid en verplaatsing van leukocyten.
Belangrijkste resultaten
- Real-time visualisatie van leukocyteninteracties is gerealiseerd.
- De rol-snelheid en verplaatsing van leukocyten zijn gekwantificeerd.
- De methode vertoonde voordelen ten opzichte van traditionele technieken.
- Fysiologische stroomcondities zijn succesvol gehandhaafd.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van leukocyten-dynamiek.
- Het kan worden toegepast op diverse behandelingen die het gedrag van leukocyten beïnvloeden.
- De techniek verdiept ons begrip van immuunresponsen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het bestuderen van leukocyten-endotheelinteracties onder fysiologische stroomcondities is essentieel voor het verminderen van risico's bij targets voor inflammatoire ziekten en voor het valideren van mechanistische hypothesen in de vroege ontdekkingsfase. Deze ex vivo autoperfuseerde microstroomkamer-assay maakt real-time kwantificering van de rol-snelheid van leukocyten mogelijk, wat zorgt voor voorspellende zekerheid bij de validatie van targets en go/no-go-beslissingen in preklinische programma's ondersteunt. Door de natuurlijke functie van leukocyten te behouden en ex vivo manipulatie-artefacten te vermijden, verbetert deze methode de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de functionele expressie van leukocytenadhesiemoleculen onder fysiologische afschuifspanning te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe meting van de rol-snelheid van leukocyten als functionele readout voor de activiteit van adhesiemoleculen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de target-engagement en mechanistische effecten van immunomodulerende verbindingen in een ziekterellevant systeem te kwantificeren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door basisprofielen van leukocyteninteracties vast te stellen onder gecontroleerde flow.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten (rolsnelheid, verplaatsing), waardoor betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende campagnes mogelijk is.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor het testen van meerdere adhesiemoleculen of therapeutische kandidaten in een consistente fysiologische omgeving.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door gebruik te maken van perifere bloedleukocyten van geanestheseerde muizen, waardoor cellulaire toestanden die vergelijkbaar zijn met in vivo worden behouden.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door functionele outputs te meten die direct vertaalbaar zijn naar eindpunten van intravitale microscopie.
- Risicobeperking: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door verbindingen te identificeren die leukocyt-endotheelinteracties onder stroming beïnvloeden, voorafgaand aan kostbare in vivo-studies.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor mechanistische risicovermindering mogelijk is voorafgaand aan fenotypische screening of preklinische effectiviteitsstudies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door de adhesiedynamiek van leukocyten onder fysiologische flow te kwantificeren, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde coating van de kamer en flowstabilisatie, wat reproduceerbare metingen van leukocyteninteracties garandeert.
- Analytica: Genereert kwantitatieve resultaten (rolsnelheid, verplaatsing) via ImageJ-analyse, wat objectieve vergelijking van behandelingseffecten over verschillende experimentele condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug naar preklinische continuïteit door gebruik te maken van native leukocytenpopulaties, waardoor de fysiologische relevantie voor extrapolatie naar in vivo ontstekingsmodellen behouden blijft.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het screenen van meerdere targets of verbindingen, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd en de workflow-efficiëntie wordt verhoogd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door het functionele gedrag van leukocyten onder schuifspanning te meten, waardoor het aantal fout-positieven uit statische assays wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde stroomcondities (30 mmHg) en real-time imaging, waardoor de variabiliteit tussen experimenten wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege mechanistische inzichten te verschaffen, wat het biologische risico in een laat stadium van programma's voor inflammatoire ziekten vermindert.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door effecten van targetmodulatie te kwantificeren, wat datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling in immunomodulatoire pipelines ondersteunt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, intravitale microscopie en hemodynamische drukregulatie om stabiele ex vivo arterioveneuze circuits te handhaven.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een druktransducer, een Harvard Apparatus flowregulator en een waterimmersie-objectief voor de visualisatie van leukocyten.
- Vereist standaardisatie tussen teams van protocollen voor het coaten van de kamer, de voorbereiding van de buisjes en de hepariniseringsprocedures om een consistente fysiologische flow te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het testen van verschillende endotheliale adhesiemoleculen of leukocyten-subtypen, waarbij validatie van de coating-efficiëntie en specificiteit noodzakelijk is.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit van de chirurgische canulatie van vaten en de noodzaak van murine modellen onder anesthesie, wat de doorvoer kan beperken.
