Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo

Het algemene doel van deze procedure is om transcriptionele startpunten en RNA-splitsingsplaatsen in vivo van bacteriën te identificeren met behulp van een fluorescente primer-extensiereactie. Dit wordt bereikt door eerst bacteriën zoals e coli of S aria te laten groeien en de RNA-moleculen te isoleren. Vervolgens wordt het RNA reverse getranscriseerd met behulp van specifieke fluorescente primers en reverse transcriptase, wat resulteert in cDNA-fragmenten.

Daarna worden DNA of plasmiden geïsoleerd uit de bacteriële cellen en wordt er een fluorescente Sanger-sequencingladder gemaakt van de DNA-sjabloon met behulp van een sequencingkit. Ten slotte worden de cDNA-fragmenten en sequencingladders gescheiden en tegelijkertijd gedetecteerd op een polyacrylamidegel met behulp van een geautomatiseerde gelsequencer en met elkaar vergeleken. Uiteindelijk wordt fluorescente primer-extensie gebruikt om de vijf prime-uiteinden van RNA-moleculen tot op een baseresolutie in kaart te brengen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden zoals race of radioactiviteit-gebaseerde primaire extensie is de snelle identificatie van de vijf van-uiteinden van RNA-moleculen, omdat de detectie gelijktijdig plaatsvindt tijdens elektroforese. De gevoeligheid is vergelijkbaar met rood activiteit-gebaseerde primaire extensies, maar stelt laboratoriumpersoneel in staat om deze methode te gebruiken zonder de noodzaak van stralingsveiligheidstraining. We hebben deze fluorescente primaire extensietechniek met succes gebruikt om de RNA-componenten van toxine-antitoxinesystemen te onderzoeken.

Stafylokokken die de procedure demonstreren, zijn Christopher Schuster, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Na het bereiden van een hoge opbrengst van RNA en het ontwerpen van primers volgens het tekstprotocol, voer de primer-extensiereactie uit door eerst de thermocycler voor te verwarmen tot 95 graden Celsius. Meng voor elk RNA-monster de volgende verbindingen in een PCR-buis, denatureer de monsters gedurende één minuut bij 95 graden Celsius.

Plaats de buizen vervolgens vijf minuten op ijs om de primers en het RNA te hybridiseren. Stel vervolgens de PCR-machine in op 47 graden Celsius. Bereid vervolgens de reverse transcriptie mastermix voor zoals hier beschreven.

Voeg vier microliter, een reverse transcriptie mastermix, toe aan elk gehybridiseerd RNA-monster en incubeer de buizen gedurende één uur bij 47 graden Celsius. Om de reactie te stoppen, verwarm de monsters gedurende twee minuten tot 95 graden Celsius. Voeg vervolgens zes microliter formaamid-laaddye toe en bewaar deze 's nachts of tot twee weken in het donker bij min 20 graden Celsius.

Na het bereiden van de genomische DNA of plasmiden, volgens het tekstprotocol, assembleer de Sanger-sequencingreactie door 12 microliter van ongeveer 10 tot 15 microgram genomisch DNA of 100 tot 500 nanogram plasmide DNA te mengen met één microliter van een fluorescent gelabelde primer en één microliter DMSO-pipet. Voeg één microliter van elk sequencingmengsel toe aan afzonderlijke vooraf gelabelde PCR-buizen. Voeg vervolgens drie microliter van de D-N-A-D-M-S-O primermix toe aan elke buis.

Stel de PCR-machine in op het volgende programma en voer het uit na het plaatsen van de monsters in de machine. Voeg na de run zes microliter laaddye toe aan de monsters en zet deze vervolgens op ijs. Als u direct of bij min 20 graden Celsius langdurig gebruikt, gebruik dan schone stofvrije 25 centimeter platen, plaats 0,25 millimeter spacers op de achterglasplaat en laat de gekartelde glasplaat op de bovenkant zakken met de gekartelde uiteinden van de glasplaten en de railsingang piloten beide naar boven gericht.

Bevestig de gelrails aan beide zijden van de glasplaten en draai de knoppen lichtjes vast. Om de gel uit te gieten. Combineer de hier vermelde verbindingen in een beker met een roerbare en plaats deze op een magnetische roerplaat. Direct na het toevoegen van een PS en een team, gebruik een 50 milliliter spuit om de acrylamide-oplossing op te nemen en plaats een 0,45 nanometer filter op de punt.

Plaats de gesandwichde platen in een hoek van 10 tot 20 graden en laat de geloplossing langzaam tussen de glasplaten lopen terwijl u de spuitpunt continu van de ene naar de andere kant beweegt. Stop met het uitgeven van de geloplossing zodra deze het onderste uiteinde van de glasplaten bereikt. Gebruik een bubbelhaak om eventuele luchtbellen die zich hebben gevormd te verwijderen.

Schuif vervolgens de gelzakjesspacer tussen de glasplaten bij het gekartelde uiteinde, dompel het onder in de geloplossing en bevestig het door de gietplaat lichtjes vast te zetten en de bovenste railschroeven los te laten en laat de gel een tot twee uur uitharden. Gebruik voor het verwijderen van de gietplaat en gelzakjesspacer gedistilleerd gedeïoniseerd water om de zakjes van zout en gelresidu te reinigen om de gel te laten lopen. Schuif de buffertankhouder in de gelrails op de voorste glasplaten en draai de knoppen vast.

Plaats de gel in de onderste geltank van de geautomatiseerde gelimager tegen de verwarmingsplaat en bevestig deze door de railsingangspilot in de apparaatbeugels te schuiven. Gebruik één XTBE-buffer om de bovenste en onderste gelbufferkamers te vullen. Sluit vervolgens de onderste bufferkamer en gebruik de stroomkabel om de bovenste bufferkamer op de stroom aan te sluiten.

Als er zout in de gelzak aanwezig is, gebruik dan buffer om herhaaldelijk in de zak te pipetten om deze te reinigen. Gebruik vervolgens het bovenste bufferdeksel om de bovenste buffertankkamer te sluiten. Na het inschakelen van de imager en computer en het starten van de basisbeeld IR-gegevensverzameling software volgens het tekstprotocol, gebruik de hier vermelde instellingen om de scannercontrole in te stellen.

Voer vervolgens de lege gel gedurende 20 minuten vooraf uit door spanning aan te selecteren en op enter te drukken. Gebruik ondertussen een PCR-machine om de sequencingladder en de primer-extensieproducten gedurende twee minuten op 90 graden Celsius te verwarmen. Stop de elektroforese, open de geautomatiseerde gelsequencer en verwijder het bovenste buffertankdeksel voordat u op ijs koelt. Plaats vervolgens de haaidentenkam tussen de glasplaten en met de haaidenten.