Name: Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een fluorescentie-gebaseerde primer-extensiemethode om transcriptiestartpunten en RNA-knippunten in bacteriën in vivo te identificeren met behulp van een geautomatiseerde gel-sequencer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Anne Wochele voor haar hulp in het laboratorium en Vera Augsburger voor hulp met de geautomatiseerde gel sequentiëraar. We danken de Deutsche Forschungsgemeinschaft voor de financiering door middel van subsidies BE4038/2 en BE4038/5 binnen de “prioriteitsprogramma's” SPP1316 en SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen dat een belangenconflict zou kunnen opleveren.

Fluorescerende primer extensie is een eenvoudige en snelle werkwijze voor het bepalen uiteinden van de RNA 5 &#39;, zowel voor TSP- of secundaire RNA processing identificatie. Door het gebruik van fluorescente primers, kan de reactie worden opgezet en uitgevoerd zonder extra veiligheidsmaatregelen (anders dan bij radioactief gemerkte primers). De monsters worden gedetecteerd door fluorescentie, kunnen ze worden afgebeeld terwijl de elektroforese wordt uitgevoerd die een snelle analyse mogelijk maakt in vergelijking met ...

Primerverlenging 1 is een moleculaire methode uiteinden van specifieke RNA-moleculen van de 5 &#39;bepalen tot een basisresolutie. Het voordeel van andere methoden, zoals 5&#39;-RACE (snelle amplificatie van cDNA uiteinden) is de snelle doorlooptijd en de mogelijkheid om een ​​mengsel van verschillende lengtes van RNA-moleculen gemakkelijk analyseren. Deze methode werkt door het onderwerpen RNA moleculen transcriptiereacties keren met specifieke fluorescente primers genereren cDNA fragmenten van bepaalde lengte. Deze cDNA-moleculen worden uitgevoerd naast de traditionele Sanger sequencing reacties 2 op denaturerende polyacrylamide gelen en kan worden gedetecteerd door de fluorescentie door het gebruik van fluorescent gemerkte primers. De lengte van de cDNA-fragmenten worden vervolgens beoordeeld in vergelijking met de sequentie ladder, waardoor het in kaart brengen van het 5&#39;-RNA uiteinden. Traditioneel worden primerverlengingsreacties in combinatiemet radioactieve isotopen cDNA moleculen op röntgenfilms detecteren. Door gezondheid, kwesties afvalverwerking en gebruiksgemak, nieuwere protocollen gebruiken fluorescentie voor de detectie van de primerverlenging met automatische sequencers, hoewel de gevoeligheid iets lager. Met fluorescent gelabelde primers, kan de terugkerende radioactieve labeling procedure worden weggelaten, als fluorescerende primers zijn stabiel gedurende lange tijd (meer dan een jaar in onze handen). De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van een geautomatiseerde sequencer gel, maar met lichte wijzigingen kunnen capillaire sequencer ook worden gebruikt voor de cDNA scheiding en detectie 3. Het parallellisme gel analyse maakt het mogelijk om zelfs een kleine hoeveelheid RNA splitsing of verwerking detecteren. Een ander voordeel is de hoge resolutie van deze werkwijze, als eindstandige splitsing en verwerking van zelfs één base kan worden gedetecteerd. Met betrekking tot de detectie van RNA splitsing of verwerkingen typically twee verschillende primer extensions onderscheiden. In één geval wordt de enzymatische behandeling uitgevoerd in vitro met gezuiverde RNA en gezuiverd enzym, terwijl in het andere geval wordt de verwerkingen in vivo en de resulterende RNA wordt gezuiverd. In beide gevallen het RNA onderworpen aan een primer extensie in vitro uitgevoerd, echter afhankelijk van de bron van RNA, wordt de werkwijze ofwel genoemd in vitro of in vivo primer extensie. In het protocol hier geïntroduceerde richten we alleen op in vivo primerverlenging, vanwege het gebruiksgemak (niet gezuiverde eiwitten nodig) en de mogelijkheid om transcriptionele startpunten en verwerking uit te tegelijkertijd. In vitro primerverlengingen in principe ingesteld op dezelfde manier en dit protocol kan dienen als uitgangspunt. De werkwijze hier afgebeelde kan worden toegepast op vele bacteriesoorten zolang ze vatbaar hoogzuiverheid en hoge opbrengst bereiden van nucleïnezuren. Het onderzoek in ons lab richt zich op het regelgevend kader van toxine-antitoxine (TA) systemen van 4,5, een terrein waarop de primer extension method grote schaal wordt gebruikt. TA-systemen zijn kleine genetische elementen in prokaryotische genomen dat bestaat uit een stabiele en endogeen actief toxische eiwit en een meestal onstabiel eiwit of RNA antitoxine die toxiciteit 6,7 tegengaat. Toxine activiteit wordt soms uitgeoefend door remming van de replicatie, celwand synthese of andere mechanismen, maar meestal door RNase activiteit 8,9. Typisch wordt RNase specificiteit bepaald door het uitvoeren van verschillende tests, waaronder de primer extensie methode. Primerverlengingsreacties zijn geschikt voor deze toepassing, als een mengsel van volledige lengte gesplitst en fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te bepalen hun 5 &#39;einden. Een mix van in vitro en in vivo primer extensions, despecifieke toxine RNase splitsing, bijvoorbeeld sequentie specificiteit te bepalen 10-13. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1. Overzicht van primerverlenging procedure. Bacteriële kweken worden geïncubeerd en behandeld volgens de experimentele behoeften. Totaal RNA wordt geëxtraheerd uit de cellen, behandeld met DNase I bij DNA sporen te verwijderen en onderworpen aan een reverse transcriptie reactie met doelspecifieke fluorescente DNA primers hetgeen cDNA. Genomisch DNA of plasmiden worden geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor fluorescerende Sanger sequentiebepaling reacties voor maat vergeleken met de cDNA-fragmenten. Primerverlengingsproducten worden omzomen Sanger sequentiebepaling producten op een denaturerende ureum polyacrylamidegel en geanalyseerd met een geautomatiseerde laser en microscoop. De sequencing basis die lijn staat met de cDNA band is de last basis van de 5 &#39;cDNA (blauwe pijl). Meer informatie in Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Een overzicht van de gehele primerverlenging procedure is te vinden in figuur 1. In het kort, bacteriële cellen worden gekweekt, geoogst, de cel pellet gelyseerd en het RNA geëxtraheerd. Gezuiverd RNA wordt vervolgens behandeld met DNase I om sporen van DNA moleculen die kunnen fungeren als sjablonen voor de reverse transcriptase verwijderen. Specifieke fluorescerende primers worden toegevoegd aan het RNA gehybridiseerd aan het gebied van belang en vervolgens reverse getranscribeerd, waardoor enkelstrengs complementair DNA (cDNA). Een sequentie ladder wordt gemaakt door traditionele Sanger sequentiebepaling gebruik fluorescente primers en gescheiden op een denaturerende polyacrylamide gel naast het primerverlengingsproduct cDNA fragmenten. Het resulterendegel geanalyseerd door vergelijking van de fluorescerende banden, waardoor de identificatie van uiteinden van belang de 5 &#39;. Transcriptionele uitgangspunten en verwerking sites worden vervolgens individueel door sequentievergelijkingen beoordeeld.

<table><tbody><tr><td>AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&micro;l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescently labeled primers</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5&rsquo; DY-681 modificatie van &ldquo;gewone&rdquo; DNA oligonucleotiden. Compatibele kleurstoffen zoals de LICOR IRDye 700/800 zijn ook verkrijgbaar bij andere leveranciers zoals IDTdna.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Product stopgezet</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini preparation kit</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrate</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNA STORAGE BUFFER</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternatief: &ldquo;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)&rdquo; van Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull;In RNase Inhibitor</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescentie gebaseerde primer extension techniek om transcriptioneel uitgangspunten en splitsing sites van rnases bepaal in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluorescentie gebaseerde primer extensie (FPE) is een moleculaire methode om transcriptionele startpunten of verwerking websites van RNA-moleculen te bepalen. Dit wordt bereikt door reverse transcriptie van het RNA van belang met specifieke fluorescent gelabelde primers en daaropvolgende analyse van de resulterende cDNA-fragmenten door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Tegelijkertijd wordt een traditionele Sanger sequencing reactie uitgevoerd op de gel aan de uiteinden van de cDNA-fragmenten wijzen aan hun exacte overeenkomstige basen. In tegenstelling tot de 5&#39;-RACE (Rapid Amplification van cDNA Ends), waarbij het product moet worden gekloneerd en meerdere kandidaat sequentie, kan het grootste deel van de cDNA-fragmenten gegenereerd door primerverlenging gelijktijdig worden gedetecteerd in een gel run. Bovendien kan de gehele procedure (van reverse transcriptie tot de uiteindelijke analyse van de resultaten) in een werkdag worden ingevuld. Door fluorescerend gemerkte primers, het gebruik van gevaarlijke radioactieve isotoop gemerkte reagentiakan worden vermeden en doorlooptijden worden gereduceerd producten tijdens de elektroforese procedure kan worden gedetecteerd. In het volgende protocol beschrijven we een in vivo fluorescentie primerverlenging methode uiteinden van de RNA 5 &#39;betrouwbaar en snel detecteren afleiden transcriptionele startpunten en RNA verwerking gebeurt (bijvoorbeeld door toxine-antitoxine systeemcomponenten) in S. aureus, E. coli en andere bacteriën.

Zoals weergegeven in figuur 6, kan een primer extensie reactie worden gebruikt om de transcriptionele startpunten van transcripten van belang te bepalen en kan helpen om promotergebieden afleiden (gewoonlijk aangeduid met -10 en -35 elementen). De bovenste (langste) cDNA fragment representeert het uiteinde van het mRNA 5 en kan dus gemakkelijk worden toegewezen in vergelijking met de sequentie ladder. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig6highres.jpg" /><b...

We beschrijven hier een op fluorescentie gebaseerde primer-extensiemethode om transcriptionele startpunten van bacteriële transcripten en RNA-verwerking in vivo te bepalen met behulp van een geautomatiseerde gel-sequencer.

Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Het algemene doel van deze procedure is om transcriptionele startpunten en RNA-splitsingsplaatsen in vivo van bacteriën te identificeren met behulp van een fluorescente primer-extensiereactie. Dit wordt bereikt door eerst bacteriën zoals e coli of S aria te laten groeien en de RNA-moleculen te isoleren. Vervolgens wordt het RNA reverse getranscriseerd met behulp van specifieke fluorescente primers en reverse transcriptase, wat resulteert in cDNA-fragmenten.Daarna worden DNA of plasmiden geïsoleerd uit de bacteriële cellen en wordt er een fluorescente Sanger-sequencingladder gemaakt van de DNA-sjabloon met behulp van een sequencingkit. Ten slotte worden de cDNA-fragmenten en sequencingladders gescheiden en tegelijkertijd gedetecteerd op een polyacrylamidegel met behulp van een geautomatiseerde gelsequencer en met elkaar vergeleken. Uiteindelijk wordt fluorescente primer-extensie gebruikt om de vijf prime-uiteinden van RNA-moleculen tot op een baseresolutie in kaart te brengen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden zoals race of radioactiviteit-gebaseerde primaire extensie is de snelle identificatie van de vijf van-uiteinden van RNA-moleculen, omdat de detectie gelijktijdig plaatsvindt tijdens elektroforese. De gevoeligheid is vergelijkbaar met rood activiteit-gebaseerde primaire extensies, maar stelt laboratoriumpersoneel in staat om deze methode te gebruiken zonder de noodzaak van stralingsveiligheidstraining. We hebben deze fluorescente primaire extensietechniek met succes gebruikt om de RNA-componenten van toxine-antitoxinesystemen te onderzoeken.Stafylokokken die de procedure demonstreren, zijn Christopher Schuster, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Na het bereiden van een hoge opbrengst van RNA en het ontwerpen van primers volgens het tekstprotocol, voer de primer-extensiereactie uit door eerst de thermocycler voor te verwarmen tot 95 graden Celsius. Meng voor elk RNA-monster de volgende verbindingen in een PCR-buis, denatureer de monsters gedurende één minuut bij 95 graden Celsius.Plaats de buizen vervolgens vijf minuten op ijs om de primers en het RNA te hybridiseren. Stel vervolgens de PCR-machine in op 47 graden Celsius. Bereid vervolgens de reverse transcriptie mastermix voor zoals hier beschreven.Voeg vier microliter, een reverse transcriptie mastermix, toe aan elk gehybridiseerd RNA-monster en incubeer de buizen gedurende één uur bij 47 graden Celsius. Om de reactie te stoppen, verwarm de monsters gedurende twee minuten tot 95 graden Celsius. Voeg vervolgens zes microliter formaamid-laaddye toe en bewaar deze 's nachts of tot twee weken in het donker bij min 20 graden Celsius.Na het bereiden van de genomische DNA of plasmiden, volgens het tekstprotocol, assembleer de Sanger-sequencingreactie door 12 microliter van ongeveer 10 tot 15 microgram genomisch DNA of 100 tot 500 nanogram plasmide DNA te mengen met één microliter van een fluorescent gelabelde primer en één microliter DMSO-pipet. Voeg één microliter van elk sequencingmengsel toe aan afzonderlijke vooraf gelabelde PCR-buizen. Voeg vervolgens drie microliter van de D-N-A-D-M-S-O primermix toe aan elke buis.Stel de PCR-machine in op het volgende programma en voer het uit na het plaatsen van de monsters in de machine. Voeg na de run zes microliter laaddye toe aan de monsters en zet deze vervolgens op ijs. Als u direct of bij min 20 graden Celsius langdurig gebruikt, gebruik dan schone stofvrije 25 centimeter platen, plaats 0,25 millimeter spacers op de achterglasplaat en laat de gekartelde glasplaat op de bovenkant zakken met de gekartelde uiteinden van de glasplaten en de railsingang piloten beide naar boven gericht.Bevestig de gelrails aan beide zijden van de glasplaten en draai de knoppen lichtjes vast. Om de gel uit te gieten. Combineer de hier vermelde verbindingen in een beker met een roerbare en plaats deze op een magnetische roerplaat. Direct na het toevoegen van een PS en een team, gebruik een 50 milliliter spuit om de acrylamide-oplossing op te nemen en plaats een 0,45 nanometer filter op de punt.Plaats de gesandwichde platen in een hoek van 10 tot 20 graden en laat de geloplossing langzaam tussen de glasplaten lopen terwijl u de spuitpunt continu van de ene naar de andere kant beweegt. Stop met het uitgeven van de geloplossing zodra deze het onderste uiteinde van de glasplaten bereikt. Gebruik een bubbelhaak om eventuele luchtbellen die zich hebben gevormd te verwijderen.Schuif vervolgens de gelzakjesspacer tussen de glasplaten bij het gekartelde uiteinde, dompel het onder in de geloplossing en bevestig het door de gietplaat lichtjes vast te zetten en de bovenste railschroeven los te laten en laat de gel een tot twee uur uitharden. Gebruik voor het verwijderen van de gietplaat en gelzakjesspacer gedistilleerd gedeïoniseerd water om de zakjes van zout en gelresidu te reinigen om de gel te laten lopen. Schuif de buffertankhouder in de gelrails op de voorste glasplaten en draai de knoppen vast.Plaats de gel in de onderste geltank van de geautomatiseerde gelimager tegen de verwarmingsplaat en bevestig deze door de railsingangspilot in de apparaatbeugels te schuiven. Gebruik één XTBE-buffer om de bovenste en onderste gelbufferkamers te vullen. Sluit vervolgens de onderste bufferkamer en gebruik de stroomkabel om de bovenste bufferkamer op de stroom aan te sluiten.Als er zout in de gelzak aanwezig is, gebruik dan buffer om herhaaldelijk in de zak te pipetten om deze te reinigen. Gebruik vervolgens het bovenste bufferdeksel om de bovenste buffertankkamer te sluiten. Na het inschakelen van de imager en computer en het starten van de basisbeeld IR-gegevensverzameling software volgens het tekstprotocol, gebruik de hier vermelde instellingen om de scannercontrole in te stellen.Voer vervolgens de lege gel gedurende 20 minuten vooraf uit door spanning aan te selecteren en op enter te drukken. Gebruik ondertussen een PCR-machine om de sequencingladder en de primer-extensieproducten gedurende twee minuten op 90 graden Celsius te verwarmen. Stop de elektroforese, open de geautomatiseerde gelsequencer en verwijder het bovenste buffertankdeksel voordat u op ijs koelt. Plaats vervolgens de haaidentenkam tussen de glasplaten en met de haaidenten.</p

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Exonucleasen spelen een cruciale rol bij het waarborgen van de stabiliteit van het genoom. Verlies van de WRN-exonucleasefunctie resulteert in voortijdige veroudering. Het bestuderen van substraten en andere vereisten van de nuclease in vitro kan helpen bij het verduidelijken van zijn rol in vivo. Hier demonstreren we een snelle en reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde assay om zijn nuclease-activiteit te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen

Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Hier beschrijven we de assemblage van RNA polymerase II (Pol II) rek complexen waarvoor alleen korte synthetische DNA en RNA oligonucleotiden en gezuiverde Pol II. Deze complexen zijn nuttig voor het bestuderen van mechanismen die onderliggende co-transcriptionele verwerking van transcripties in verband met het Pol II rek complex.

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Deze studie presenteert een eenvoudige, gebruiksvriendelijke ratiometrische FRET-test voor de detectie en kwantitatieve beoordeling van DNase-activiteit, en demonstreert de toepassing ervan bij de analyse van een zwakke nuclease.

Beoordeling van DNase-activiteit door ratiometrische fluorescentieresonantie energieoverdracht

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

Leer een fluorescentie-gebaseerde primer-extensiemethode om transcriptiestartpunten en RNA-knippunten in bacteriën in vivo te identificeren met behulp van een geautomatiseerde gel-sequencer.

Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo (Video) | JoVE Journal

Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo

Meer video's verkennen