Name: Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer Proximity Ligation Assay voor het detecteren van eiwit-eiwit interacties in situ aan de neuromusculaire junctie van Drosophila larven. Deze methode visualiseert endogene eiwitcomplexen met confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Bloomington Drosophila Stock Center voor het verstrekken vlieg voorraden. We danken ook de Developmental Studies Hybridoma Bank en Dr. Lynn Cooley (Yale University) voor het verstrekken van antilichamen. Een speciale dank gaat uit naar AhHyun Yoo voor haar hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (Krieger), de William en Ada Isabelle Staal Fonds (Krieger), en de Canadese Institutes of Health Research (Harden).

1. Body muur voorbereiden OPMERKING: Bereiding van derde instar larven lichaamwanden (voor studie van de NMJs waarvan de lichaamswand spieren innerveren) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in Brent et al 10 of Ramachandran en Budnik 11,12, maar met enkele wijzigingen.. <ol><li> Ontleding <ol><li> Hef fly voorraden en kruisen bij 25 ° C gedurende 5-6 dagen volgens standaardprocedures 13. </li><li> Pick kruipen derde instar larven uit flesjes of flessen met behulp van fijne pincet. </li><li> Was de larven in een kleine petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele etensresten te verwijderen. </li><li> Plaats één larve op een Sylgard schijf en dompel het in een paar druppels ijskoude PBS. Met behulp van ijskoude PBS zal helpen verdoven de larve waardoor het makkelijker te manipuleren. Gedurende de dissectie, opdat de uitwerking altijd ondergedompeld in PBS om te voorkomen drogen. </li><li> Plaats de laRvA met zijn rug naar boven zodat de twee tracheale stukken zijn zichtbaar onder een dissectie microscoop (Figuur 2A). Met behulp van de tang om een minutien pin te begrijpen, speld de larve neer op het achterste einde nabij het ​​spiracles (Figuur 2B). Met een andere pin, doorboren de cuticula aan het voorste uiteinde in de buurt van de mond haken. Voorzichtig rekken de larve uit in de lengte, dan pin het naar beneden (Figuur 2B). </li><li> Met behulp van microdissection schaar, knijp het achterste einde nabij de pin naar een kleine opening te creëren. De incisie moet oppervlakkig genoeg om alleen passeren de cuticula zijn. </li><li> De punt van het onderste blad van de schaar in de incisie, snede langs de gehele lengte van de middellijn tussen de tracheale stukken (figuur 2C). Richt de schaar bladen iets naar boven bij het snijden te voorkomen dat schade aan de ventrale lichaam muur spieren. </li><li> Maak een kleine horizontale incisie iets anterior aan de posteriorly geplaatste pen (figuur 2C). Maak een andere soortgelijke incisie iets posterior aan de naar voren geplaatste pen (figuur 2C). De incisies moet gewoon passeren de cuticula. OPMERKING: De drie incisies uit stappen 1.1.7 en 1.1.8 in combinatie zou een te lijken &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;Wanneer voltooid, dat wil zeggen, een linker- en rechter klep aan de dorsale zijde van het larvale lichaam moeten worden geproduceerd. </li><li> Reinig voorzichtig uit de inwendige organen met de tang. Het toevoegen van een paar krachtige druppels PBS zal helpen verdringen de organen uit het larvale lichaam, waardoor het makkelijker om ze te verwijderen. Vermijd poking het larvale lichaam als het schade aan de lichaamswand spieren veroorzaken. </li><li> Wikkel het larvale lichaam open en speld de hoeken naar beneden (figuur 2D). Wanneer pinning, strek het lichaam muur zowel horizontaal als verticaal naar een gelijkmatig gespannen rechthoek vormen (see Figuur 2G voor de vorm), zorg ervoor dat u het lichaam muur spieren in het proces te scheuren. </li><li> Eindig het verwijderen van alle resterende interne organen (figuur 2E). </li></ol></li><li> Fixatie en Permeabilisatie <ol><li> Dompel de gespeld lichaam muren in enkele druppels van Bouin&#39;s oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs. U kunt ook gebruik maken van 4% paraformaldehyde (PFA) als alternatief fixatief; incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Spoel driemaal met fosfaatbuffer Saline met Triton (PBT). </li><li> Met behulp van fijne tang, voorzichtig de pennen te verwijderen en breng het lichaam muren door hun hoeken in een gesiliconiseerde 0,65 ml microcentrifugebuis. </li><li> Bewaar het lichaam wanden PBT bij 4 ° C tot klaar voor PLA. Voor een optimaal resultaat, start immuunkleuring het lichaam muren binnen een dag of twee van dissectie. OPMERKING: Om te besparen op reagentia en dat alle lichaamwanden gelijk tijdens de assay worden behandeld, kunnen verschillende genotypen in één geplaatstbuis. Genotypen te onderscheiden door het snijden van de hoeken van het lichaam wanden verschillend (zie figuur 2F voorbeelden). </li></ol></li></ol> 2. Immunohistochemistry OPMERKING: Immunokleuring derde instar larven lichaamwanden werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in Brent et al 14 en Ramachandran en Budnik 11, maar met enkele wijzigingen 11,14.. Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur onder zacht schudden, tenzij anders vermeld. <ol><li> Blokkeren <ol><li> Was het lichaam muren met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk. </li><li> Blokkeren met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Incubeer het lichaam muren met muis en konijn primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang (verdund in 1% BSA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. In dit geval gebruikt 01:10 muis anti-Dlg en 1: 250 konijn eennti-HTSM 15,16. Antilichamen tegen markers die niet zijn gemaakt in de muis of konijn kan ook opgenomen worden - bijvoorbeeld, gebruiken 1: 200 geit anti-Hrp aan de neuronale membranen af te bakenen. </li><li> Was met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer met fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen tegen de markers (verdund in 1% BSA) detecteren 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Aangezien de PLA signaal later gevisualiseerd met een rode fluorofoor, moet een andere fluorofoor worden gebruikt om de marker te detecteren - bijvoorbeeld gebruik 1 200 FITC-geconjugeerd anti-geit geit anti HRP antilichaam detecteren. Door het gebruik van lichtgevoelige reagentia, houdt de buizen in het donker vanaf dit punt. OPMERKING: De kit die gebruikt maakt PLA wordt uitgevoerd tussen primaire antilichamen opgewekt in muizen en konijnen, met het signaal gevisualiseerd op het rode kanaal onder confocale microscopie. Indien gewenst, andere pakketten verkrijgbaar waarmee de test wordt uitgevoerd met primary antilichamen opgewekt in andere soorten, en het signaal gevisualiseerd op andere kanalen. </li></ol></li></ol> 3. Proximity ligatiebepaling Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur onder zacht schudden, tenzij anders vermeld. <ol><li> PLA Probes <ol><li> Was het lichaam muren met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer met PLA probes (1: 5 verdunning elk in 1% BSA) gedurende 2 uur bij 37 ° C. In dit geval gebruikt 40 pl PLA probe antimuis MIN, 40 pl PLA probe anti-konijn PLUS en 120 gl 1% BSA om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen. Tot een 1:25 verdunning van de PLA probes nog, een voldoende signaal-ruisverhouding (dwz voor dit experiment). </li></ol></li><li> Ligatie <ol><li> Was het lichaam muren met Wasbuffer A tweemaal gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer met Ligatie oplossing (1:40 verdunning van ligase in Ligatie buffer) gedurende 1 uur eent 37 ° C. In dit geval gebruikt 5 ui Ligase, 40 ui van 5 Ligatie buffer en 155 gl zuiver water om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen. </li></ol></li><li> Amplification <ol><li> Was het lichaam muren met Wasbuffer A tweemaal gedurende 2 minuten elk. </li><li> Incubeer met Amplificatie oplossing (1:80 verdunning van polymerase in Amplification buffer) gedurende 2 uur bij 37 ° C. In dit geval gebruikt 2,5 pl polymerase, 40 ui van 5 amplificatiebuffer en 157,5 pl zuiver water om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor Imaging <ol><li> Was het lichaam muren met Wasbuffer B twee keer voor 10 minuten elk. </li><li> Wassen met 0.01x Wasbuffer B eenmaal voor 1 min. </li><li> Equilibreren enkele druppels bevestigingsoplossing ten minste 30 minuten voor de montage of bewaar overnacht bij 4 ° C. </li><li> Met behulp van fijne tang, zorgvuldig het lichaam muren te zetten op een platform dia wet hun nagelriemen naar beneden. Plaats het lichaam muren in rijen en in dezelfde richting binnen een druppel of twee van inbedmiddel. Plaats een 22 mm x 40 mm dekglaasje over de voorbereiding zorg luchtbellen niet te genereren, dan sluit de dia met heldere nagellak. </li><li> Bewaar de objectglaasjes in het donker bij -20 ° C tot klaar voor confocale beeldvorming. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li>
<li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Lgl%2FDlg%2FScribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction%2C+polarity+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li>
<li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li>
<li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li>
<li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adducin%3A+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li>
<li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hts%2FAdducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li>
<li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+p21-Activated+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li>
<li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity%3A+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li>
<li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+structural+and+functional+synapse+development%3A+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li>
<li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+forest+tree+by+tree%3A+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulated+Drosophila+adducin+is+a+determinant+of+synaptic+plasticity+in+a+complex+with+Dlg+and+PIP2+at+the+larval+neuromuscular+junction%0A++%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction
 .</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit rapport toont aan hoe PLA kan worden toegepast op de Drosophila larven NMJ. De test wordt uitgevoerd op larvale lichaamswand spier voorbereiding van de opsporing van endogeen eiwit-eiwit interacties bij het NMJ. Met deze techniek Dlg en Hts worden getoond in dichte nabijheid van elkaar, en dus bestaan ​​in een complex, specifiek op de postsynaptische gebied 27. Ter ondersteuning van dit resultaat, heeft een eerdere studie het bewijs van hun associatie met de volgende gegevens: 1) de immuunreactie...

Drosophila Discs grote (Dlg) is een geconserveerde lid van de membraan-geassocieerde guanylate kinase familie van steigers eiwitten die helpen orkestreren de assemblage van grote eiwitcomplexen op specifieke plaatsen van het plasmamembraan. Oorspronkelijk geïdentificeerd als een tumor suppressor eiwit, Dlg fungeert als een belangrijke determinant van epitheliale apicobasal polariteit 1,2,3. DLG dient ook als een grote steiger module bij de neuromusculaire junctie (NMJ) in de door glutamaat motorische neuronen tijdens de larvale ontwikkeling 4. DLG speelt diverse rollen in het larvale NMJ, en haar pleiotropism vertrouwt op zijn vermogen om te associëren met meerdere eiwitten 5,6. Een dergelijk eiwit is Hu-li tai Shao (HTS), een homoloog aan het zoogdier adducins die voornamelijk beschreven met betrekking tot hun rol bij het ​​reguleren van het actine-cytoskelet spectrin 7. Eerder is aangetoond dat Dlg en Hts een complex die berusten op in vitro kunnen vormen </em&gt; co-immunoprecipitatie experimenten met hele volwassen vlieg lysaten 8. Een tekortkoming van deze resultaten is echter dat zij niet aan waar deze complexe vormen. Met behulp van immunohistochemie, worden de verdelingen van Dlg en Hts waargenomen overlappen de postsynaptische membraan van larvale NMJs, maar zijn ze in een complex in deze regio 8? Zoals onlangs aangetoond en verder hier beschreven, wordt Proximity Ligatie Assay (PLA) gebruikt om te zoeken naar een in situ associatie tussen Dlg en Hts specifiek op het larvale NMJ 27. PLA is een relatief nieuwe techniek meestal gebruikt in cel- en weefselkweek dat eiwit-eiwit interacties kan detecteren situ 9. In deze assay worden primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang gedetecteerd met een paar species-specifieke secundaire antilichamen, aangeduid PLA probes die zijn geconjugeerd met oligonucleotiden (Figuur 1A, B). Als de twee eiwittens in dichte nabijheid van elkaar (dat wil zeggen binnen enkele tientallen nanometers), de afstand tussen de bijgevoegde PLA probes kunnen worden overbrugd door hybridisatie van twee extra connector oligonucleotiden (Figuur 1C). In deze conformatie, de vrije uiteinden van de connector oligonucleotiden dicht genoeg bij contact met elkaar maken, en een gesloten circulair DNA-molecuul kan worden opgericht onder in situ ligatie (figuur 1D). Het circulaire DNA-molecuul als een matrijs voor in situ rolling circle amplificatie, die gevuld is met één van de oligonucleotiden geconjugeerd aan de PLA probes (figuur 1E). Sequenties in het resulterende geamplificeerde, concatemere DNA product kan vervolgens worden gevisualiseerd met fluorescent gelabelde complementaire oligonucleotide probes (Figuur 1F). Aangezien het geamplificeerde DNA blijft aan een van de PLA probes, de subcellulaire lokalisatie van het eiwit-eiwit interacties withina weefsel kan worden geconstateerd. Verschillende werkwijzen worden gewoonlijk gebruikt om eiwit-eiwit interacties te detecteren zoals in vitro technieken zoals co-immunoprecipitatie, pull-down assays en gist twee-hybride screening en in vivo technieken zoals Förster Resonance Energy Transfer (FRET) en Bimoleculaire Fluorescentie complementatie ( BiFC). Een valkuil van de in vitro technieken is dat zij niet identificeren waar de interactie endogeen plaatsvindt, terwijl de hiervoor genoemde in vivo technieken omvatten de kunstmatige expressie van fusie-eiwitten die niet de natieve gedrag van hun endogene tegenhangers kunnen weerspiegelen. Een groot voordeel van PLA is dat het kan bepalen in een weefsel subcellulaire lokalisatie van endogeen eiwit interactors die dicht bij elkaar waarschijnlijk vormen van een complex met de mate van nabijheid nodig is om een ​​signaal dat vergelijkbaar FR genererenET en BiFC. PLA kunnen interacties met hoge specificiteit en gevoeligheid te detecteren vanwege de koppeling van antilichaam herkenning en DNA amplificatie. Aldus kan de assay discrete, heldere signalen in de vorm van puncta dat de exacte positie van de interactie onthullen genereren. Bovendien kan nauwelijks zichtbaar antigenen gedetecteerd. Tenslotte PLA is een betrekkelijk eenvoudige techniek uit te voeren, en het duurt niet langer dan een standaard immunohistochemische procedure te voltooien. Daarom PLA biedt een technisch voordeel ten opzichte van andere eiwit-eiwit interactie assays die vaak worden geplaagd met lange bereidingstijden en uitgebreide probleemoplossing. Dit protocol toont hoe PLA kan worden toegepast op de Drosophila larven NMJ voor de opsporing van endogeen eiwit-eiwit interacties in situ. Hier PLA wordt uitgevoerd op larvale lichaamswand spier preparaten Dlg en Hts getoond inderdaad bestaan ​​in een complex op de postsynaptische regio NMJs. PLA is niet eerder gebruikt om de larven NMJ bestuderen en er momenteel slechts een handvol gepubliceerde artikelen die deze test in Drosophila weefsel gebruikt. Het is te hopen dat de verdere blootstelling van PLA aan de Drosophila gemeenschap zal resulteren in een toenemend gebruik hiervan als een extra instrument om andere, meer algemeen gebruikte eiwit-eiwit interactie assays te vullen.

<table><tbody><tr><td>Forceps (fijn #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Meng de elastomeerbasis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1. Laat 30 min. zetten. Giet in een mal (bijv. gebruik een 12-well cell culture plate). Laat minimaal 24 uur drogen. Hecht aan de deksel van een 60 x 15 mm Petri-schaal bij het disseceren.</td></tr><tr><td>Minutien Pins (0,0125&nbsp;mm puntdiameter)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectiescharen (ultrafijn)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Platform Slides</td><td></td><td></td><td>Lijm twee 22 x 22 mm2 deksels op een microscoopglas met transparante nagellak, laat een &lt;20 mm hiaat tussen voor het bevestigen van monsters.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>De stock werd opnieuw uitgebalanceerd over een GFP balancer, zodat homozygote mutanten kunnen worden geselecteerd op basis van de afwezigheid van GFP-signaal.</td></tr><tr><td>1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing): 3&nbsp;mM NaH2PO4, 7&nbsp;mM Na2HPO4, 130&nbsp;mM NaCl, pH 7,0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin's oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (Anachemia Science - 66194-300). Zie doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 voor instructies over het maken van de oplossing.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (fosfaatgebufferde zoutoplossing met Triton): 1x PBS met 0,01% Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (rundesserumalbumine): 1% BSA in 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>muis anti-Dlg (Discs large)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>Gebruik bij een 1:10 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>konijn anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Dr. Lynn Cooley (Yale University). Gebruik bij een 1:250 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>konijn anti-Pak (p21-geactiveerde kinase)</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Gebruik bij een 1:500 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>muis anti-Wg (Wingless)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>Gebruik bij een 1:5 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>geit anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td><td>Jackson&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Gebruik bij een 1:200 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd ezel anti-geit</td><td>Jackson&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>Gebruik bij een 1:200 verdunning in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Probe anti-muis MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA Probe anti-konijn PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Detectiereagentia Rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Wash Buffer A: 0,01&nbsp;M Tris, 0,15&nbsp;M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Wash Buffer B: 0,2&nbsp;M Tris, 0,1&nbsp;M NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0,01x Wash Buffer B: 2&nbsp;mM Tris, 1&nbsp;mM NaCl, pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Montage Medium met DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van in situ eiwit-eiwit complexen in de drosophila larvale neuromusculaire junction met behulp van proximity ligatiebepaling

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is een geconserveerd lid van de membraan-geassocieerde guanylaatkinasefamilie en dient als een belangrijk schakelend eiwit op de larvale neuromusculaire junctie (NMJ) in Drosophila. Eerdere studies hebben aangetoond dat de post-synaptische verdeling van Dlg op de larvale NMJ overlapt met die van Hu-li tai shao (Hts), een homoloog van de zoogdier-adducines. Bovendien wordt waargenomen dat Dlg en Hts een complex met elkaar vormen op basis van co-immunoprecipitatie-experimenten met gebruik van hele lysaten van volwassen vliegen. Vanwege de aard van deze experimenten was het echter onbekend of dit complex specifiek op de NMJ tijdens de larvale ontwikkeling voorkomt.
Proximity Ligation Assay (PLA) is een recent ontwikkelde techniek die meestal wordt gebruikt in cel- en weefselkweek en die eiwit-eiwit-interacties in situ kan detecteren. In deze assay worden monsters geïncubeerd met primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang volgens standaard immuno-histochemische procedures. De primaire antilichamen worden vervolgens gedetecteerd met een speciaal ontworpen paar oligonucleotide-geconjugeerde secundaire antilichamen, PLA-sondes genaamd, die kunnen worden gebruikt om een signaal te genereren alleen wanneer de twee sondes in de nabijheid van elkaar zijn gebonden. Dus eiwitten die in een complex zijn, kunnen worden gevisualiseerd. Hier wordt gedemonstreerd hoe PLA kan worden gebruikt om in situ eiwit-eiwit-interacties op de larvale NMJ van Drosophila te detecteren. De techniek wordt uitgevoerd op preparaten van larvale lichaamswandspieren om aan te tonen dat een complex tussen Dlg en Hts inderdaad bestaat in het post-synaptische gebied van NMJ's.

In wild-type derde instar larvale NMJs, wordt Dlg voornamelijk te vinden op de postsynaptische membraan van type I glutamatergische boutons, met Dlg immunoreactiviteit niveaus zijn meer uitgesproken bij type Ib boutons dan type is boutons (figuur 3A) 4. HTS gehele spier aanwezig maar concentreert op de postsynaptische regio Hts immunoreactiviteit niveaus opgenomen gelijk zowel type I boutons en ook presynaptisch gevonden (Figuur 3A) 8,17. Merk op dat de verdelingen...

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de subcellulaire lokalisatie van endogene eiwit-eiwitinteracties te detecteren bij de NMJ van de drosophila-larve. Dit wordt bereikt door immunofluorescence uit te voeren met behulp van een paar oligonucleotide-geconjugeerde secundaire antilichamen, PLA-sondes genaamd, die zich binden aan de primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang. Vervolgens wordt de opening tussen de PLA-sondes overbrugd door hybridisatie van de twee verbindingsoligonukleotiden.Pas wanneer de twee eiwitten in de nabijheid van elkaar zijn en er een gesloten circulair DNA-molecuul wordt gevormd door in situ ligatie, wordt er in situ rollen kringversterking uitgevoerd om sequenties binnen het gesloten circulaire DNA-molecuul te versterken, die vervolgens worden gedetecteerd met complementaire fluorescent gelabelde oligonucleotiden. Het resulterende fluorescente signaal dat door elk versterkingsproduct wordt gegenereerd, is dus gemakkelijk zichtbaar als een duidelijke heldere vlek wanneer het wordt bekeken met behulp van confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere bestaande methoden zoals E two hybrid precipitatie en dreiging, is dat PLA in staat is om binnen het weefsel de subcellulaire lokalisatie van endogene eiwitten die zich in de nabijheid van elkaar bevinden en waarschijnlijk een complex vormen, te detecteren.Hoewel deze methode inzicht geeft in de eiwit-eiwitinteractienetwerken die specifiek optreden in de larve en mj. Het kan ook worden toegepast op andere jolo-systemen, zoals de epitheliale weefsels in embryo's en imaginale schijven.Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Hel Yu en Ha King, twee technici uit ons laboratorium. Nadat de drosophila-culturen gedurende vijf tot zes dagen bij 25 graden Celsius zijn geïncubeerd, gebruikt u fijne pincetten om kruipende derde instar-larven uit de flesjes of potten te plukken om de larven te wassen. Breng ze over in een kleine petrischaal met PBS.Plaats vervolgens een van de gewassen larven in een sigaretdisc en dompel deze onder in verschillende druppels ijskoud PBS om deze te verdoven, waardoor het gemakkelijker wordt om te manipuleren. Plaats de larve met zijn rugzijde naar boven zodat de twee tracheale banen zichtbaar zijn onder een dissectiemicroscoop. Gebruik vervolgens de pincetten om een mnuchin-pin te grijpen, prik de larve vast aan het achterste uiteinde nabij de spiralen met een andere pin door de cuticula aan het voorste uiteinde nabij de mondhaken en strek de larve voorzichtig in de lengterichting voordat u deze vastprikt.Vervolgens gebruikt u microdissectie, schaar om het achterste uiteinde nabij de pin te knijpen om een kleine opening te maken, de insnijding moet oppervlakkig genoeg zijn om de cuticula te passeren. Plaats vervolgens de punt van de onderste lemmet van de schaar in de insnijding en terwijl u de schaarbladen iets omhoog richt om schade aan de onderliggende spieren te voorkomen, snijdt u langs de gehele lengte van de dorsale middellijn tussen de twee tracheale banen. Maak nu een kleine horizontale insnijding net door de cuticula, iets voor de achterste pin.Maak vervolgens nog een soortgelijke insnijding iets achter de voorste pin. Nadat u een paar krachtige druppels PBS aan het larvenlichaam heeft toegevoegd, gebruikt u de pincetten om de interne organen voorzichtig schoon te maken. Probeer niet in het larvenlichaam te prikken, omdat dit schade aan het lichaam zal veroorzaken.De wandspieren ontvouwen het larvenlichaam open en om de hoeken vast te prikken, rekt u de lichaamswand zowel horizontaal als verticaal uit om een gelijkmatig getrokken rechthoek te vormen. Zorg ervoor dat u de spieren van de lichaamswand niet scheurd tijdens het proces om het weefsel te fixeren. Dompel de vastgepinde lichaamswanden in verschillende druppels boanoplossing en incubeer ze gedurende 15 minuten op ijs volgens de fixatie.Gebruik PBT om het weefsel drie keer te spoelen. Snijd vervolgens de hoeken van elk genotype anders om ze te onderscheiden om reagens te besparen en om ervoor te zorgen dat alle lichaamswanden gelijkmatig worden behandeld tijdens de assay.En na het verwijderen van de pinnen met fijne pincetten, plaatst u ze allemaal in dezelfde gesiliconiseerde microcentrifugebuis van 0,65 milliliter. Gebruik PBT om de lichaamswanden drie keer gedurende 10 minuten elk te wassen om het weefsel te permeabiliseren. Nadat u de laatste wassing hebt verwijderd, voegt u 1% BSA toe om de monsters te blokkeren en incubeert u gedurende een uur.Ga vervolgens naar immunostain, voeg de lichaamswanden muis- en konijnenprimaire antilichamen toe tegen de twee eiwitten van belang en incubeer gedurende twee uur. In dit geval wordt een tot 10 muis-anti-DLG en een tot 250 konijn-anti-HTS in 1% BSA gebruikt. Antilichamen tegen markers kunnen ook na de incubatie worden toegevoegd.Gebruik PBT om de lichaamswanden drie keer gedurende 10 minuten elk te wassen. Voeg vervolgens fluoro vier gelabelde secundaire antilichamen toe tegen alle markers in 1% BSA, en incubeer in het donker bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Gebruik PBT om de lichaamswanden drie keer gedurende 10 minuten elk te wassen.Om de assay te beginnen met een verdunning van een op vijf in ten minste 200 microliter. Totaal volume van zowel PLA-sonde, anti-muis minus en PLA-sonde anti-konijn plus in 1% BSA naar de lichaamswanden gedurende twee uur bij 37 graden Celsius na het gebruik van wasbuffer A om de lichaamswanden twee keer te wassen gedurende vijf minuten elk bij een verdunning van een op 40 van Ligase in Ligase-oplossing, gedurende een uur incuberen bij 37 graden Celsius na de incubatie. Gebruik wasbuffer A om de lichaamswanden twee keer gedurende twee minuten elk te wassen voordat u een verdunning van een op 80 van polymerase in versterkingsoplossing toevoegt.Incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius om de monsters voor beeldvorming voor te bereiden. Ge

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.

Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

This video demonstrates the visualization of protein-protein interactions at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) using Proximity Ligation Assay (PLA). After isolating the body walls, interacting proteins are probed with primary antibodies and PLA-conjugated secondary antibodies. The proximity of the interacting proteins facilitates the ligation of probes with connector oligonucleotides, forming circular DNA, which is then amplified by rolling circle amplification. Fluorescent probes...

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila Larvae Using a Proximity Ligation Assay

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Leer Proximity Ligation Assay voor het detecteren van eiwit-eiwit interacties in situ aan de neuromusculaire junctie van Drosophila larven. Deze methode visualiseert endogene eiwitcomplexen met confocale microscopie.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling (Video) | JoVE Journal

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Meer video's verkennen