Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling

Het doel van de volgende procedure is om snel en automatisch de veranderingen in celmorfologie en de subcellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten van belang te kwantificeren in grote aantallen cellen als reactie op een specifieke stimulus. Dit wordt bereikt door eerst de T-cellen te stimuleren met de chemo-soorten van belang. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gelabeld en vervolgens geanalyseerd door middel van beeldvormende flowcytometrie.

In de laatste stap kunnen het aantal morfologisch gepolariseerde lymfocyten en de hoeveelheid segregatie van de fluorescente markers worden geëvalueerd op basis van de locatie en de intensiteit van de pixels voor elke kleuring, afhankelijk van de gekozen masker. Uiteindelijk kan deze beeldvormende flowcytometrietechnologie worden gebruikt om snel en robuust de morfologische veranderingen van lymfocyten na chemokine-stimulatie te kwantificeren, evenals de locatie van specifieke eiwitten van belang binnen de gepolariseerde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie is dat een groot aantal cellen herhaaldelijk kan worden verwerkt en automatisch geanalyseerd, wat een statistisch sterke analyse van de morfologische veranderingen en de eiwitverdeling garandeert.

Bij chemokine gestimuleerde T-lymfocyten begint de Boche-stimulatie van de T-cellen door vijf keer te centrifugeren in warm HBSS aangevuld met 10 millimolair HEPs, gedurende vijf minuten bij 340 keer G. Bij kamertemperatuur, verwijder de supinate en suspendeer de pellets in 0,3 milliliter warm HBSS per buisje. Breng vervolgens de celsuspensies over in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voeg 10 tot 500 nanogram per milliliter chemokine toe aan elke buis en schud de buizen vervolgens meerdere keren om te mengen.

Incubeer de cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Na acht tot 10 minuten, stop de polarisatie met 0,3 milliliter warm, 2%paraldehyde aangevuld met 10 millimolair. He peas.

Meng vervolgens de buizen met meer schudbewegingen en incubeer ze nog vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te kleuren voor immunofluorescentieanalyse. Breng vervolgens de gestimuleerde T-cellen over in overeenkomstige flowcytometriebuizen. Vul de buizen volledig met kleuringsbuffer.

Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer de pellets in 100 microliters van 5% foetaal runderserum in PBS. Voeg nu vijf microliters van ZI N-T-H-L-A-A-B-C toe aan elke buis. Vortex en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker aan het einde van de incubatie.

Was de cellen twee keer en incubeer ze vervolgens in 500 microliters van 1%para formaldehyde. Na 10 minuten, was de cellen in meer kleuringsbuffer en vul de buizen vervolgens volledig met permeatiebuffer. Na het twee keer wassen van de cellen in de permeatiebuffer, verwijder de supinate en vortex ze om de celpellets te dissociëren.

Kleur vervolgens de monsters met nul punt 25 microgram per milliliter, trixi voor loon, vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatieperiode, was de cellen in permeatiebuffer. Opnieuw resus.

Suspendeer de pellets in 200 microliters PBS en breng de cellen vervolgens over in afzonderlijke microcentrifugebuisjes om het percentage gepolariseerde T-cellen na chemokine-stimulatie te bepalen. Schakel eerst de beeldvormende flowcytometer in en laat deze calibreren volgens de instructies van de fabrikant. Trek histogrammen die de RMS-gradiëntwaarden kwantificeren van de in-focus populatie die is geselecteerd op de RMS-gradiënt.

Het histogram geeft de enkele celpopulatie weer op een histogram van het gebied zodra het microcentrifugebuisje in de machine is geplaatst, pas de laservermogensgang aan op individuele cellen en verzamel 5.000 T-lymfocyten. In de ideeënanalysesoftware. Open de verzamelde bestanden en maak vervolgens een histogram dat de RMS-waarde van de gradiënt toont voor de lichtveldbeelden die voor elke individuele cel zijn verkregen, door een poort te tekenen op de cellen die een RMS-gradiëntwaarde boven 57 vertonen.

Maak in het analysemenu een nieuw masker genaamd erode M1 two van het morfologiemasker op de lichtveldbeelden M zero one eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk van het gebied dat is berekend op het erode M1 two masker van de cellen die in de vorige poort zijn gemaakt. Open een histogram dat het gebied van cellen toont. Gebruik dit nieuw gemaakte masker om een poort te tekenen op de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratiekralen en puin in het kleine gebied, evenals de dubbelen in het grote gebied.

Open vervolgens een bot bestaande uit de ruwe max op de H-L-A-A-B-C kleuring als functie van de ruwe max pixel op de Phin kleuring in het analysemaskersmenu achter naar nieuw masker genaamd erode M two two van het morfologiemasker van de H-L-A-A-B-C geverfde cellen eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk bestaande uit de circulariteitsparameter berekend op de erode M two two.

Maak vervolgens een andere histogram om de waarden van de circulariteitskenmerken van de eerder gepoortte cellen te rapporteren. Kijk vervolgens naar de vorm van het histogram voor de niet gestimuleerde cellen, RO poort voor de gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteitswaarde tot aan de circulariteitslimietwaarde waar de meeste niet gestimuleerde cellen zijn uitgezet om de polarisatie van de actinekleuring binnen de cellen te beoordelen. Plus een histogram voor de heldere detailgelijkenis, R drie waarde om de H-L-A-A-B-C en de foid in kleuring te vergelijken.

Gebruik vervolgens dezelfde poortstrategie zoals zojuist is aangetoond, plus een GA op de niet gestimuleerde cellen voor de niet geco-lokaliseerde gescheiden kleuring. Het statistiekenpaneel toont het percentage T-cellen met gepolariseerde actinekleuring hier. Voorbeelden van CCL 19 gestimuleerde T-lymfocyten die in de poort van de niet-gepolariseerde of gepolariseerde cellen vallen, worden getoond.

Verschillen in de morfologie tussen beide subpopulaties kunnen duidelijk worden waargenomen. De zojuist aange