Name: Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer hoe je morfologische veranderingen en eiwitlokalisatie in T-cellen kwantificeert na chemokinestimulatie met behulp van imaging flow cytometrie. Deze methode biedt snelle, statistisch robuuste analyse van grote celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs sterk erkennen Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert en Louise Rimbault van de Cochin Imaging Facility. Dit werk werd ondersteund door Inserm, CNRS en de Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée).

1. Bereiding van T lymfocyten <ol><li> Bereid primaire muis of humane T cellen zoals beschreven 10,11. </li><li> Telen menselijke T-cellen in compleet RPMI-medium met 10% humaan AB serum bij een dichtheid van 2-3 x 10 6 cellen / ml. Opmerking: Het gebruik van foetaal kalfsserum (FCS) in plaats van humaan serum kan spontane polarisatie van een groot deel van humane T-cellen in kweek te wekken. Bewaar deze cellen in kweek gedurende 4-5 dagen en verder verwerken ze op elk moment gedurende deze periode. </li><li> Handhaaf muis T-cellen in volledig RPMI medium aangevuld met 10% FCS in een soortgelijk celdichtheid. Gebruik direct of de volgende dag, na een O / N kweek bij 37 ° C in aanwezigheid van 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultiveren CEM humane T-cellijn in compleet RPMI aangevuld met 10% FCS. </li></ol> 2. Chemokine Stimulatie <ol><li> Was 5 x 10 5 cellen per experimentele conditie in warm HBSS medium aangevuld met 10 mM Hepes. Voor sommige experimenten, co-transfectie van primaire menselijke T-cellen de dag ervoor met 2 ug pmaxGFP en 8 ug pcDNA3.1 + (lege vector, controle), PKCζ kinase dood, of N-terminale Par6 plasmiden. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in warm HBSS-Hepes medium (gebruik 0,3 ml x aantal experimentele condities). </li><li> Verdeel de cellen in 1,5 ml microcentrifuge buisjes. OPMERKING: Daarom zal één buis overeenkomt met één experimentele conditie 5 x 10 5 cellen bevatten in 0,3 ml HBSS-Hepes medium. Voor sommige experimenten, voeg 500 nM latrunculine A of drager (DMSO) en incubeer de cellen gedurende 30 min voor chemokine stimulatie. </li><li> Voeg 10 tot 500 ng / ml CCL19 of CXCL12 chemokine in elke buis. LET OP: We gebruiken meestal 10-200 ng / ml chemokine voor menselijke T-cellen. CEM cellen niet drukken de CCR7-receptor die CCL19 bindt. Daarom zal CEM cellen alleen in staat om te reageren op een CXCL12 stimulatie. Bovendien gebruiken hogere chemokine concentraties (300-500 ng / ml), muis T-cellen polariseren. </li><li> Flip de tubes meerdere malen en incubeer ze in een 37 ° C waterbad gedurende 8 of 10 minuten voor primaire T-cellen of CEM respectievelijk. </li><li> Stop de polarisatie proces door aan elke buis 0,3 ml van een warme oplossing met 2% paraformaldehyde (PFA) en 10 mM Hepes in PBS. Flip de buizen en incubeer ze bij 37 ° C gedurende 5 min. </li></ol> 3. kleuringen <ol><li> Breng de cellen van de reactievaatjes aan flowcytometrie buizen. </li><li> Vul de buizen volledig met RB oplossing die 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes in PBS. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 460 g gedurende 4 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pl van een RT oplossing met 5% FCS in PBS. </li><li> Voeg 5 ul FITC-anti-HLA-ABC in elke buis, vortex hen en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Was de cellen eenmaal met PBS met 5% FCS, eennd eenmaal met alleen PBS. </li><li> At RT: voeg 500 ul 1% PFA, incubeer gedurende 10 min, daarna wassen cellen met een oplossing die 1% BSA, 0,5 mM EDTA en 10 mM HEPES in PBS. </li><li> Verwijder het supernatant, vul de buizen volledig met een oplossing van PBS met 0,2% BSA, 0,1% saponine, 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes (permeabilisatie buffer). </li><li> Was de cellen tweemaal in dit medium. </li><li> Flip de buizen het medium te verwijderen en vortex ze de celpellet dissociëren. </li><li> Voeg 0,25 pg / ml TRITC-Phalloidin en / of een 1: 100 verdunning van anti-P-ERM antilichaam aan elke buis, vortex hen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met de permeabilisatie buffer. Incubeer met een fluorescerende secundaire antilichaam indien nodig. </li><li> Resuspendeer de cellen in 200 ul PBS en overbrengen naar microcentrifugebuizen. OPMERKING: Cellen zijn klaar voor overname. Alternatief, terwijl maximaal totaal volume van 200 gl per buis, voeg geconcentreerd PFA tot een uiteindelijke 1%concentratie teneinde de kleuringen behouden wanneer de cellen niet worden gebruikt op dezelfde dag voor verdere verwerking. </li></ol> 4. Images Acquisition and Analysis <ol><li> Schakel het apparaat (zie Tabel van specifieke reagentia / Equipment) en laat hem zelf te kalibreren volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: De INSPIRE-software werd gebruikt met een 40X objectief (0,75 NA). De ideeën 3.0-software werd gebruikt voor alle gerapporteerde kwantificeringen. </li><li> Maak een reeks overname ramen die kunnen worden opgeslagen in een sjabloon voor toekomstige experimenten. Teken histogrammen dat de RMS-gradiënt waarden te kwantificeren. Van de &quot;In Focus&quot; bevolking, geselecteerd op de RMS gradiënt histogram, begrenzen de &quot;Single cell&quot; populatie op een histogram van de omgeving. Zodra de microcentrifugebuisje heeft in de machine is geplaatst, past het laservermogen, hek aan individuele cellen en het verwerven van 5000 T-lymfocyten. </li><li> In de Ideeën zachteware, opent de overname bestand en maak een histogram dat de waarde van de gradiënt RMS-waarde voor helderveld beelden zal tonen (kanaal 1) verkregen voor elke individuele cel. Teken een hek aan de RMS gradiënt histogram dat cellen vertonen RMS gradiënt waarde boven 57 beschouwt. OPMERKING: De RMS gradiënt hiermee rekening te houden bij de analyse alleen de T-lymfocyten die in het brandvlak. We hebben empirisch vastgesteld dat individuele cellen vertonen een RMS-gradiënt waarde superieur is aan 57 zijn in het brandvlak, en nauwkeurig kan worden beschouwd. </li><li> In de analyse / Maskers menu, maak een nieuw masker, genaamd Erode (M01,2) van de morfologie masker op de helderveld beelden M01, geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, een nieuwe functie van de ruimte, berekend over het eroderen (M01,2) masker. Van de geselecteerde in de vorige poort cellen, opent een histogram dat de omgeving van de cellen met behulp van deze nieuw gecreëerde masker. OPMERKING: De morfologie maskers die beschikbaar zijn doorStandaard zijn veel groter dan de werkelijke grootte van de cel. Zo is nauwkeuriger te eroderen tot 2 pixels. </li><li> Teken een hek aan de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratie kralen en puin (klein gebied) en de wambuizen (grote Area). Stel deze poort bij elke aankoop. OPMERKING: Variaties in celgrootte de positie van de poort beïnvloeden. Een muis T-cellen zijn kleiner dan menselijke T-cellen die zelf kleiner is dan CEM cellen, zal het gebied van elke celtype evenredig met de grootte. </li><li> Gezien de single, focus cellen die werden afgesloten in de vorige stappen, opent een puntenplot bestaande uit de ruwe Max pixel op het HLA-ABC kleuring (kanaal 2, x-as) als functie van de Raw Max pixel op de phalloidin kleuring (Channel 4, y-as). Maak een poort naar de ongekleurde of verzadigd fluorescerende gebeurtenissen uit te sluiten. Open twee histogrammen tonen de Raw Max Pixel voor HLA-ABC (kanaal 2) en phalloidin (Channel 4) kleuringen. </li><li> In de analyse / Maskers menu, createa nieuw masker, genaamd Erode (M02,2) van de morfologie masker van de HLA-ABC gekleurde cellen (Channel 2), geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, maak dan een nieuwe functie, bestaande uit de parameter Circulariteit, berekend op Eroderen (M02,2). OPMERKING: Deze parameter meet de afwijking van de cel vorm van een cirkel. Daarom zal een perfect ronde T-cel een hoge circulariteit waarde terwijl langgerekte gepolariseerde cellen zullen een lage cirkelvormigheid index exposeren. </li><li> Vervolgens maakt een histogram dat de waarden van de functie Recursiviteit van de eerder gated cellen rapporteert. Met dit histogram direct plot de verdeling van een individu, in-focus celpopulatie volgens de waarde van de Recursiviteit per individuele cel. </li><li> Kijkend naar de vorm van het histogram voor niet gestimuleerde cellen opneming van een poort voor gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteit waarde tot de circulariteit grenswaarde waar de meeste van de niet gestimuleerde cellenworden uitgezet. Kijk naar de statistieken display voor het percentage van de gepolariseerde cellen onder de gated bevolking (% Gated). LET OP: Wij hebben deze poort voor Circulariteit index waarden onder 13 in te stellen. </li><li> Om te kijken naar de polarisatie van het actine kleuring in de cellen plot een histogram voor de heldere details Gelijkenis R3 waarde, het vergelijken van de HLA-ABC kleuring (kanaal 2) en de phalloidin kleuring (Channel 4). OPMERKING: Hoe groter de waarde van deze functie, hoe meer bovenop de twee kleuringen zijn. </li><li> Met dezelfde gating strategie als voorheen, breng een hek aan de niet-gestimuleerde cellen voor de gescheiden kleuring dat het percentage cellen met gepolariseerde actine kleuring toont. </li><li> Wanneer voltooid, het percentage cellen vertonen een scheiding in de verdeling van de MHC klasse I en falloïdine kleuringen het percentage gepolariseerde cellen met de gemiddelde waarden van de Recursiviteit en Gelijkenis indexen van alle cellen ± SD wordt in corresponding statistieken panelen. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Een recente techniek van beeldvorming flowcytometrie, een snelle en informatieve gating strategie analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen geïnduceerd door chemokine stimulatie wordt gepresenteerd. De veranderingen in celmorfologie geïnduceerd door chemokine stimulatie en de subcellulaire verdeling van verschillende eiwitten tijdens het polarisatieproces: Uit één experiment kan men twee soorten informatie. Interessant is bewijs ook voorzien in de mogelijkheid om een ​​groot aantal cellen, die statistische rob...

Chemokines zijn kleine oplosbare eiwitten die cellen aan te trekken om gespecialiseerde locaties 1. Daarom zij deelnemen aan de juiste positionering van de cellen in weefsels, een cruciale functie in de ontwikkeling en fysiologie. Het immuunsysteem is geen uitzondering op deze regel als het gebaseerd is op de actie van vele verschillende celtypen die in onderling overleg handelen om een ​​effectieve immuunrespons. Door het regelen van de specifieke locatie van een immuun celtype in een bepaalde toestand, chemokinen vooraf vereist voordat vreemde antigenen kunnen worden gedetecteerd en geneutraliseerd. In T-lymfocyten in het bijzonder, chemokines binden aan specifieke oppervlak receptoren die, de huisbediende ontlokken vele intracellulaire signalen (calcium stijging, ERK fosforylering, Rho GTPasen activering, toename van integrines affiniteit en cytoskelet wijzigingen) dat T-cel beweeglijkheid 2,3 bevoordelen. Op cellulair niveau, kan men morfologische wijzigingen geïnduceerd op chemokine stimulatie observeren.Deze veranderingen in cel vormen zijn bijzonder dramatisch in T-cellen: rustende T cellen een druppelvormig ronde morfologie reizen binnen de bloedstroom. De detectie van de aanwezigheid van chemokinen in ontstekingsplaatsen of nabijheid van lymfoïde organen zal de vorm van T-cellen die nu vast een typische &quot;hand-mirror&quot; morfologie bestaande uit een bipolaire vorm veranderen: een leidende rand aan de voorzijde en een achterste rand, of Uropode, aan de achterkant 4. Daarnaast kunnen intracellulaire componenten gescheiden in de twee tegenoverliggende gebieden van een gepolariseerde T-cel migratie ondersteunen. Bijvoorbeeld, actine filamenten polymerisatie stijgt op chemokine stimulatie 5 en gepolymeriseerd actine accumuleert aan de voorzijde van een gepolariseerde T-cel 2. Anderzijds, verscheidene eiwitten, zoals gefosforyleerde eiwitten van de Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie die het plasmamembraan koppelen aan de corticale F-actine cytoskelet, opnieuw lokaliseren de Uropode gepolariseerdeT-cellen 6. Interessant wij en anderen hebben aangetoond dat dit polarisatieproces vereist voor T celmigratie. Inderdaad, zal er geen behandeling die interfereert met polarisatie cellulaire beweeglijkheid remmen. Bijvoorbeeld, remming van de activiteit van de leden van de atypische eiwitkinasen C (PKC) families, PKCζ en PKCι blokken T cel polarisatie en hun trekkende scannen van dendritische cellen 7. T-cel polarisatie wordt ook geregeld door Rho GTPasen. We hebben aangetoond dat de modulatie van RhoA activiteit van de recent beschreven Fam65b eiwit interfereert met T cel veranderingen in morfologie en hun vermogen om te migreren in Transwell assay 6. Als polarisatie voorwaarde stap voor cellulaire motiliteit, is dus cruciaal te kunnen kwantificeren als belangrijkste uitlezen van chemokine reacties. Cel vorm verbouwingen waren eerder handmatig 8 gemeten. Echter, dergelijke kwantificering is zeer tijdrovend, waardoor gewoonlijk slechts enkeletientallen cellen rekening gehouden. Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om snel kwantificeren van de mate van veranderingen vorm van T-lymfocyten blootgesteld aan stimulatie chemokine. Een imaging flowcytometrie technologie (zie tabel specifieke reagentia / Apparatuur) gebruikt, die de voordelen van een stromingscytometer en een microscoop 9 combineert efficiënt kwantificeren van de hoeveelheid gepolariseerde cellen onder verschillende condities van chemokine stimulatie. Naast de kwantificering van de morfologische veranderingen die robuust kan meten met deze techniek, is het ook mogelijk om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van sommige eiwitten op chemokine signalering evalueren.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Voorverwarmen om het complement te inactiveren.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Voorverwarmen om het complement te inactiveren.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd. Deze chemokine kan ook worden gebruikt op muis T-cellen.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>Dit is een 8% PFA-oplossing in water. Meng volume op volume met 2x PBS om een 4% PFA-oplossing in PBS te verkrijgen.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antilichaam</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snelle en robuuste analyse van cellulaire en moleculaire polarisatie geïnduceerd door chemokine signaling

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cellen reageren op stimulatie door chemokine verliezen hun ronde vorm in een proces genaamd polarisatie, en door het veranderen van de subcellulaire lokalisatie van verschillende proteïnen. Klassieke beeldvormende technieken gebruikt om deze fenomenen. Echter, vereist zij de handmatige overname van vele cellen, gevolgd door tijdrovende kwantificering van de morfologie en de co-localisatie van de kleuring van tientallen cellen. Hier is een snelle en krachtige methode beschreven om deze fenomenen te bestuderen monsters uit meerdere duizenden cellen met een beeldvormende flowcytometrie technologie die de voordelen van een microscoop met die van een cytometer combineert. Met T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19 en kleuring voor MHC klasse I moleculen en filamenteuze actine, wordt een gating gepresenteerde gelijktijdig meten van de mate van veranderingen vorm en de mate van co-lokalisatie van markers die worden beïnvloed door CCL19 signalering. Bovendien is deze gating strategie liet ons toe om OBSERVe de segregatie van draadvormige actine (aan de voorzijde) en gefosforyleerd Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) eiwitten (aan de achterkant) in gepolariseerd T-cellen na CXCL12 stimulatie. Deze techniek was ook nuttig om de blokkerende effect op de polarisatie van twee verschillende elementen waarnemen: remming van actine polymerisatie door een farmacologische remmer en expressie van mutanten van de Par6 / atypische PKC signaleringsroute. Aldus wordt bewijs blijkt dat deze techniek nuttig is voor zowel morfologische veranderingen en eiwit herverdeling analyseren.

Het eerste voorbeeld hier gekozen heeft betrekking op het gebruik van menselijke primaire T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19. Echter, kan dezelfde strategie worden toegepast met primaire muis T-cellen, T-cellijnen of ander celtype reageren op chemokine stimulatie. De gating strategie hier gepresenteerde omvat een reeks vensters die de gefocusseerde evenementen, dan de enkele cellen selecteren. Tenslotte het bereik van fluorescentie-intensiteit gevolgd hier als voorbeeld twee markers: de MHC klasse I HLA-ABC en filament...

Chemokine-signalering veroorzaakt duidelijke veranderingen in cellulaire morfologie en enkele belangrijke herverdelingen van intracellulaire eiwitten. Hier wordt een snel en gedetailleerd protocol geboden om deze gebeurtenissen te bestuderen.

Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Het doel van de volgende procedure is om snel en automatisch de veranderingen in celmorfologie en de subcellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten van belang te kwantificeren in grote aantallen cellen als reactie op een specifieke stimulus. Dit wordt bereikt door eerst de T-cellen te stimuleren met de chemo-soorten van belang. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gelabeld en vervolgens geanalyseerd door middel van beeldvormende flowcytometrie.In de laatste stap kunnen het aantal morfologisch gepolariseerde lymfocyten en de hoeveelheid segregatie van de fluorescente markers worden geëvalueerd op basis van de locatie en de intensiteit van de pixels voor elke kleuring, afhankelijk van de gekozen masker. Uiteindelijk kan deze beeldvormende flowcytometrietechnologie worden gebruikt om snel en robuust de morfologische veranderingen van lymfocyten na chemokine-stimulatie te kwantificeren, evenals de locatie van specifieke eiwitten van belang binnen de gepolariseerde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie is dat een groot aantal cellen herhaaldelijk kan worden verwerkt en automatisch geanalyseerd, wat een statistisch sterke analyse van de morfologische veranderingen en de eiwitverdeling garandeert.Bij chemokine gestimuleerde T-lymfocyten begint de Boche-stimulatie van de T-cellen door vijf keer te centrifugeren in warm HBSS aangevuld met 10 millimolair HEPs, gedurende vijf minuten bij 340 keer G. Bij kamertemperatuur, verwijder de supinate en suspendeer de pellets in 0,3 milliliter warm HBSS per buisje. Breng vervolgens de celsuspensies over in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voeg 10 tot 500 nanogram per milliliter chemokine toe aan elke buis en schud de buizen vervolgens meerdere keren om te mengen.Incubeer de cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Na acht tot 10 minuten, stop de polarisatie met 0,3 milliliter warm, 2%paraldehyde aangevuld met 10 millimolair. He peas.Meng vervolgens de buizen met meer schudbewegingen en incubeer ze nog vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te kleuren voor immunofluorescentieanalyse. Breng vervolgens de gestimuleerde T-cellen over in overeenkomstige flowcytometriebuizen. Vul de buizen volledig met kleuringsbuffer.Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer de pellets in 100 microliters van 5% foetaal runderserum in PBS. Voeg nu vijf microliters van ZI N-T-H-L-A-A-B-C toe aan elke buis. Vortex en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker aan het einde van de incubatie.Was de cellen twee keer en incubeer ze vervolgens in 500 microliters van 1%para formaldehyde. Na 10 minuten, was de cellen in meer kleuringsbuffer en vul de buizen vervolgens volledig met permeatiebuffer. Na het twee keer wassen van de cellen in de permeatiebuffer, verwijder de supinate en vortex ze om de celpellets te dissociëren.Kleur vervolgens de monsters met nul punt 25 microgram per milliliter, trixi voor loon, vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatieperiode, was de cellen in permeatiebuffer. Opnieuw resus.Suspendeer de pellets in 200 microliters PBS en breng de cellen vervolgens over in afzonderlijke microcentrifugebuisjes om het percentage gepolariseerde T-cellen na chemokine-stimulatie te bepalen. Schakel eerst de beeldvormende flowcytometer in en laat deze calibreren volgens de instructies van de fabrikant. Trek histogrammen die de RMS-gradiëntwaarden kwantificeren van de in-focus populatie die is geselecteerd op de RMS-gradiënt.Het histogram geeft de enkele celpopulatie weer op een histogram van het gebied zodra het microcentrifugebuisje in de machine is geplaatst, pas de laservermogensgang aan op individuele cellen en verzamel 5.000 T-lymfocyten. In de ideeënanalysesoftware. Open de verzamelde bestanden en maak vervolgens een histogram dat de RMS-waarde van de gradiënt toont voor de lichtveldbeelden die voor elke individuele cel zijn verkregen, door een poort te tekenen op de cellen die een RMS-gradiëntwaarde boven 57 vertonen.Maak in het analysemenu een nieuw masker genaamd erode M1 two van het morfologiemasker op de lichtveldbeelden M zero one eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk van het gebied dat is berekend op het erode M1 two masker van de cellen die in de vorige poort zijn gemaakt. Open een histogram dat het gebied van cellen toont. Gebruik dit nieuw gemaakte masker om een poort te tekenen op de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratiekralen en puin in het kleine gebied, evenals de dubbelen in het grote gebied.Open vervolgens een bot bestaande uit de ruwe max op de H-L-A-A-B-C kleuring als functie van de ruwe max pixel op de Phin kleuring in het analysemaskersmenu achter naar nieuw masker genaamd erode M two two van het morfologiemasker van de H-L-A-A-B-C geverfde cellen eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk bestaande uit de circulariteitsparameter berekend op de erode M two two.Maak vervolgens een andere histogram om de waarden van de circulariteitskenmerken van de eerder gepoortte cellen te rapporteren. Kijk vervolgens naar de vorm van het histogram voor de niet gestimuleerde cellen, RO poort voor de gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteitswaarde tot aan de circulariteitslimietwaarde waar de meeste niet gestimuleerde cellen zijn uitgezet om de polarisatie van de actinekleuring binnen de cellen te beoordelen. Plus een histogram voor de heldere detailgelijkenis, R drie waarde om de H-L-A-A-B-C en de foid in kleuring te vergelijken.Gebruik vervolgens dezelfde poortstrategie zoals zojuist is aangetoond, plus een GA op de niet gestimuleerde cellen voor de niet geco-lokaliseerde gescheiden kleuring. Het statistiekenpaneel toont het percentage T-cellen met gepolariseerde actinekleuring hier. Voorbeelden van CCL 19 gestimuleerde T-lymfocyten die in de poort van de niet-gepolariseerde of gepolariseerde cellen vallen, worden getoond.Verschillen in de morfologie tussen beide subpopulaties kunnen duidelijk worden waargenomen. De zojuist aange

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Leer hoe je morfologische veranderingen en eiwitlokalisatie in T-cellen kwantificeert na chemokinestimulatie met behulp van imaging flow cytometrie. Deze methode biedt snelle, statistisch robuuste analyse van grote celpopulaties.

Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling

Meer video's verkennen