Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling
12 december 2014
Chemokine-signalering veroorzaakt duidelijke veranderingen in cellulaire morfologie en enkele belangrijke herverdelingen van intracellulaire eiwitten. Hier wordt een snel en gedetailleerd protocol geboden om deze gebeurtenissen te bestuderen.
Het doel van de volgende procedure is om snel en automatisch de veranderingen in celmorfologie en de subcellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten van belang te kwantificeren in grote aantallen cellen als reactie op een specifieke stimulus. Dit wordt bereikt door eerst de T-cellen te stimuleren met de chemo-soorten van belang. In de tweede stap worden de cellen fluorescent gelabeld en vervolgens geanalyseerd door middel van beeldvormende flowcytometrie.
In de laatste stap kunnen het aantal morfologisch gepolariseerde lymfocyten en de hoeveelheid segregatie van de fluorescente markers worden geëvalueerd op basis van de locatie en de intensiteit van de pixels voor elke kleuring, afhankelijk van de gekozen masker. Uiteindelijk kan deze beeldvormende flowcytometrietechnologie worden gebruikt om snel en robuust de morfologische veranderingen van lymfocyten na chemokine-stimulatie te kwantificeren, evenals de locatie van specifieke eiwitten van belang binnen de gepolariseerde cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microscopie is dat een groot aantal cellen herhaaldelijk kan worden verwerkt en automatisch geanalyseerd, wat een statistisch sterke analyse van de morfologische veranderingen en de eiwitverdeling garandeert.
Bij chemokine gestimuleerde T-lymfocyten begint de Boche-stimulatie van de T-cellen door vijf keer te centrifugeren in warm HBSS aangevuld met 10 millimolair HEPs, gedurende vijf minuten bij 340 keer G. Bij kamertemperatuur, verwijder de supinate en suspendeer de pellets in 0,3 milliliter warm HBSS per buisje. Breng vervolgens de celsuspensies over in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Voeg 10 tot 500 nanogram per milliliter chemokine toe aan elke buis en schud de buizen vervolgens meerdere keren om te mengen.
Incubeer de cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Na acht tot 10 minuten, stop de polarisatie met 0,3 milliliter warm, 2%paraldehyde aangevuld met 10 millimolair. He peas.
Meng vervolgens de buizen met meer schudbewegingen en incubeer ze nog vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te kleuren voor immunofluorescentieanalyse. Breng vervolgens de gestimuleerde T-cellen over in overeenkomstige flowcytometriebuizen. Vul de buizen volledig met kleuringsbuffer.
Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer de pellets in 100 microliters van 5% foetaal runderserum in PBS. Voeg nu vijf microliters van ZI N-T-H-L-A-A-B-C toe aan elke buis. Vortex en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker aan het einde van de incubatie.
Was de cellen twee keer en incubeer ze vervolgens in 500 microliters van 1%para formaldehyde. Na 10 minuten, was de cellen in meer kleuringsbuffer en vul de buizen vervolgens volledig met permeatiebuffer. Na het twee keer wassen van de cellen in de permeatiebuffer, verwijder de supinate en vortex ze om de celpellets te dissociëren.
Kleur vervolgens de monsters met nul punt 25 microgram per milliliter, trixi voor loon, vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatieperiode, was de cellen in permeatiebuffer. Opnieuw resus.
Suspendeer de pellets in 200 microliters PBS en breng de cellen vervolgens over in afzonderlijke microcentrifugebuisjes om het percentage gepolariseerde T-cellen na chemokine-stimulatie te bepalen. Schakel eerst de beeldvormende flowcytometer in en laat deze calibreren volgens de instructies van de fabrikant. Trek histogrammen die de RMS-gradiëntwaarden kwantificeren van de in-focus populatie die is geselecteerd op de RMS-gradiënt.
Het histogram geeft de enkele celpopulatie weer op een histogram van het gebied zodra het microcentrifugebuisje in de machine is geplaatst, pas de laservermogensgang aan op individuele cellen en verzamel 5.000 T-lymfocyten. In de ideeënanalysesoftware. Open de verzamelde bestanden en maak vervolgens een histogram dat de RMS-waarde van de gradiënt toont voor de lichtveldbeelden die voor elke individuele cel zijn verkregen, door een poort te tekenen op de cellen die een RMS-gradiëntwaarde boven 57 vertonen.
Maak in het analysemenu een nieuw masker genaamd erode M1 two van het morfologiemasker op de lichtveldbeelden M zero one eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk van het gebied dat is berekend op het erode M1 two masker van de cellen die in de vorige poort zijn gemaakt. Open een histogram dat het gebied van cellen toont. Gebruik dit nieuw gemaakte masker om een poort te tekenen op de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratiekralen en puin in het kleine gebied, evenals de dubbelen in het grote gebied.
Open vervolgens een bot bestaande uit de ruwe max op de H-L-A-A-B-C kleuring als functie van de ruwe max pixel op de Phin kleuring in het analysemaskersmenu achter naar nieuw masker genaamd erode M two two van het morfologiemasker van de H-L-A-A-B-C geverfde cellen eroded of two pixels. Maak vervolgens in het analysefunctiemenu een nieuw kenmerk bestaande uit de circulariteitsparameter berekend op de erode M two two.
Maak vervolgens een andere histogram om de waarden van de circulariteitskenmerken van de eerder gepoortte cellen te rapporteren. Kijk vervolgens naar de vorm van het histogram voor de niet gestimuleerde cellen, RO poort voor de gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteitswaarde tot aan de circulariteitslimietwaarde waar de meeste niet gestimuleerde cellen zijn uitgezet om de polarisatie van de actinekleuring binnen de cellen te beoordelen. Plus een histogram voor de heldere detailgelijkenis, R drie waarde om de H-L-A-A-B-C en de foid in kleuring te vergelijken.
Gebruik vervolgens dezelfde poortstrategie zoals zojuist is aangetoond, plus een GA op de niet gestimuleerde cellen voor de niet geco-lokaliseerde gescheiden kleuring. Het statistiekenpaneel toont het percentage T-cellen met gepolariseerde actinekleuring hier. Voorbeelden van CCL 19 gestimuleerde T-lymfocyten die in de poort van de niet-gepolariseerde of gepolariseerde cellen vallen, worden getoond.
Verschillen in de morfologie tussen beide subpopulaties kunnen duidelijk worden waargenomen. De zojuist aange
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om veranderingen in celmorfologie en eiwitlokalisatie in T-cellen na chemokinestimulatie te kwantificeren. Het maakt gebruik van beeldstromingscytometrie voor snelle analyse van grote celpopulaties.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Immunologie
- Kwantitatieve beeldvorming
Achtergrond
- Chemokinesignalering beïnvloedt de celmorfologie.
- Herverdeling van intracellulaire eiwitten is cruciaal voor celfunctie.
- Traditionele microscopiemethoden zijn beperkt in doorvoer.
- Beeldstromingscytometrie maakt geautomatiseerde analyse van veel cellen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om morfologische veranderingen in lymfocyten na chemokinestimulatie te kwantificeren.
- Om de lokalisatie van specifieke eiwitten binnen gepolariseerde cellen te beoordelen.
- Om statistische analyse te verbeteren door hoge doorvoerverwerking.
Gebruikte methoden
- Stimulering van T-cellen met chemokines.
- Fluorescente labeling van cellen.
- Analyse via beeldstromingscytometrie.
- Evaluatie van celmorfologie en eiwitsegregatie.
Belangrijkste resultaten
- Snelle kwantificering van gepolariseerde lymfocyten.
- Beoordeling van fluorescente markerverdeling.
- Statistisch robuuste analyse van morfologische veranderingen.
- Vergelijking met traditionele microscopiemethoden.
Conclusies
- Beeldstromingscytometrie is effectief voor het analyseren van celmorfologie.
- Deze methode verbetert het begrip van de effecten van chemokinesignalering.
- Het maakt de studie van grote celpopulaties efficiënt mogelijk.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput quantification of chemokine-induced cellular polarization and protein redistribution, addressing a key bottleneck in target validation for immunomodulatory drug discovery. By automating morphological and co-localization analysis across thousands of cells, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic de-risking of chemokine receptor pathways. The approach supports scalable, reproducible assessment of compound effects on cell polarity, directly informing go/no-go decisions in preclinical portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemokine receptor signaling hypotheses through quantitative measurement of actin polarization and phospho-ERM segregation as functional readouts of pathway activation.
- Operational Value: Provides statistically robust data from large cell populations, reducing variability and increasing confidence in target engagement assessments.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by linking receptor stimulation to defined cytoskeletal rearrangements, clarifying biological function before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative, imaging-based assay for polarization that captures both shape change and protein redistribution, enabling multiparametric profiling of compound effects.
- Operational Value: Uses imaging flow cytometry to process 5,000+ cells per condition with automated gating, ensuring assay standardization and reproducibility across runs.
- Translational Value: Generates scalable, multiplexable readouts suitable for hit validation and lead optimization in chemokine-targeted screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates utility in evaluating inhibitory compounds (e.g., actin polymerization blockers) and genetic perturbations (e.g., Par6/aPKC mutants), providing a disease-relevant system for pathway-specific de-risking.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of polarized vs. non-polarized subpopulations within the same sample, improving internal control and data interpretability.
- Translational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating morphological polarization with subcellular protein segregation, a hallmark of functional chemokine response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a quantitative bridge between biochemical receptor engagement and functional cellular phenotype. It enables early assessment of whether a compound modulates not just receptor binding but also downstream effector mechanisms critical for immune cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying morphological polarization and protein co-localization as direct outputs of chemokine receptor signaling, clarifying pathway activity in primary lymphocytes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining, stimulation, and imaging flow cytometry protocols that produce quantitative circularity and co-localization metrics for compound screening.
- Analytics: Provides RMS gradient, area, circularity, and co-localization readouts that enable statistical comparison of conditions and compound effects on cell polarity.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by establishing a disease-relevant readout (actin/phospho-ERM segregation) that mirrors in vivo polarization events.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, plug-and-play capability for immunology and oncology teams studying chemokine-driven cell migration, adaptable to multiple stimuli and readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in chemokine receptor signaling through direct, multiparametric visualization of polarization events.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability via automated imaging flow cytometry analysis, minimizing user bias and enabling consistent execution across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into functional pathway modulation, reducing late-stage failure due to unanticipated biological complexity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemokine-targeted candidates based on their ability to induce or inhibit bona fide cellular polarization phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging flow cytometry operation, compensation, and mask-based analysis for morphological and fluorescence parameters.
- Dependent on access to imaging flow cytometry instrumentation and associated software for feature extraction (e.g., RMS gradient, circularity, co-localization).
- Necessitates standardization of cell stimulation, fixation, and staining protocols across users to ensure reproducibility of polarization readouts.
- Requires optimization of chemokine concentration and incubation time for each cell type and stimulus to avoid over- or under-stimulation artifacts.
- Limited to adherent or suspension cells compatible with imaging flow cytometry shear stress; not applicable to fragile or non-viable primary samples without optimization.
