Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Het algemene doel van deze procedure is om in detail een contusiemodel van ruggenmergletsel bij muizen te beschrijven, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst postmortem neurale voorlopercellen of PM NPCs te labelen met de vitale tracer PKH 26. Vervolgens wordt een dorsale incisie gemaakt op de muis en wordt het ruggenmerg blootgelegd.

Vervolgens wordt een infinite horizon of IH impactorapparaat gebruikt om een laesie op het ruggenmerg te creëren. Ten slotte worden de met PKH 26 gelabelde PM en PC's in de staarsafvoerende ader van de muis geïnjecteerd. Uiteindelijk wordt het lot van geënte PKH 20 6:00 PM en PC's op de laesieplaats gevolgd.

Het letselmodel repliceert het ruggenmergletsel bij de mens. De primaire mechanische verwonding wordt gevolgd door progressieve secundaire degeneratie waarbij cellulaire en farmacologische behandeling worden bestudeerd. De beschreven toepassingen kunnen een methodologische basis bieden om meer inzicht te verkrijgen in het geloof.

Inductie van stamcellen getransplanteerd in een ruggenmerg terwijl degeneratie en inflammatoire gebeurtenissen plaatsvinden. Het demonstreren van de laesie zal worden gedaan door Dr. Tony Laja Longo, PhD-student in het laboratorium. Terwijl de staarinspuiting zal worden uitgevoerd door Dr. Ache, een postdoctoraal onderzoeker in het lab, beginnend met neurale stamcellen die voldoen aan de criteria zoals beschreven in het tekstprotocol.

Resus suspendeer de cellen tot een concentratie van een maal 10 tot de zes cellen per 150 microliter. Bereid minstens 1,2 maal 10 tot de zes cellen per muis om genoeg cellen te hebben voor het laden van de pipet. Met neuraal stamcelmedium, was de cellen drie keer in een 10 milliliter conische fles, draaiend bij 500 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.

Na elke wasbeurt, vóór het laatste spintelling, worden de cellen dan na het draaien, afzuiging van het supernatant, waarbij ongeveer 25 microliter vloeistof wordt achtergelaten om te voorkomen dat er cellen worden afgezogen. Bereid vervolgens een twee X suspensie door een milliliter verdunningsmiddel C toe te voegen aan de celpalate en gebruik voorzichtig pipetteren om het onmiddellijk op te schorsen. Voor het kleuren, bereid een twee x kleurstoffenoplossing in verdunningsmiddel C door vier microliter van de PKH 26 ethanol D-oplossing toe te voegen aan één milliliter verdunningsmiddel C in een buis en goed te mengen.

Voor snelle dispersieverspreiding voegt u één milliliter van de twee x celsuspensie toe aan één milliliter van de twee XD-oplossing en meng onmiddellijk het monster door te pipetteren. Na het incuberen van de celkleur suspensie gedurende één tot vijf minuten, stopt u het kleuren door een gelijk volume van 1% BSA-oplossing in HBSS toe te voegen en incubeert u gedurende één minuut. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende 500 maal G gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.

Gebruik 10 milliliter compleet medium om de celpellet voor beoordeling van celherstel, celviabiliteit en fluorescentie-intensiteit op te schorsen. Centrifugeer de cellen, gooi het supernatant weg en voeg 10 milliliter HBSS toe aan de celpellet. Was tweemaal met HBSS en suspendeer de cellen in een steriele fysiologische oplossing.

Na het voorbereiden van het chirurgische gebied en een muis volgens het tekstprotocol, plaatst u het dier met de dorsale zijde naar boven op een schuifwarmer om hypothermie tijdens de operatie te voorkomen met een scalpel, een verticale incisie maken over het gebied van belang van T zeven tot T 12 met behulp van een pincet. Houd de huid en het oppervlakkige vetkussentje gevonden tussen de ruimte tussen de vijfde en zesde thoracale processen onder een stereomicroscoop. Tel het proces onder de bloedvat als T zes, ga dan naar T zeven.

Plaats vervolgens een kleine lager onder de ventrale zijde van de muis om de kromming van de wervelkolom te vergroten en gebruik grof forceps om de wervelkolom te blokkeren om deze te immobiliseren. Gebruik vervolgens een scalpel om de para van de wervelkolom spieren bilateraal te snijden van T zeven tot T 10 op het wervelniveau totdat het dorsale oppervlak van de lamina de scalpelpunt raakt. Gebruik vervolgens een scalpel om de verbinding van T zeven tot T 10 op het wervelniveau af te tikken totdat het dorsale oppervlak van de lamina de scalpelpunt raakt in de ruimte tussen de T acht en T negen kleine uitsteeksels.

Gebruik vervolgens microschaar om het weefsel tussen T acht en T negen en T negen en T 10 te snijden. Gebruik nu de rongeur om het T negen proces te verwijderen. Blootstel de verbinding door microschaar te gebruiken om voorzichtig de spierlaag weg te schrapen.

Ga door totdat het bot blootgelegd is. Gebruik een pincet om de spieren van de lamina te verwijderen en een kleine ruimte tussen de wervels te openen. Plaats vervolgens voorzichtig de microschaar onder het bot.

Snijd de lamina aan beide kanten en gebruik een pincet om het te verwijderen, waarbij het snoer wordt blootgelegd. Gebruik de ron jour om eventuele vrije of scherpe botfragmenten die achterblijven te verwijderen. Verwijder vervolgens de bovenste helft van de dorsale T negen proces.

Na het volgen van het IH impactorapparaatprotocol, volgens de richtlijnen in de tekst, gebruikt u vier oh absorberbare hechtingen om de incisie te sluiten door eerst het blootgestelde ruggenmerg op de plaats van de verwijderde lamina te bedekken. Zorg ervoor dat u de onderliggende spieren niet afknijpt. Gebruik twee of drie reflexclips om de huid te sluiten.

Injecteer twee milliliters zoutoplossing in de onderrug subcutaan en plaats de muis in een voorverwarmde kooi op een verwarmingskussen om te herstellen. Om een staarvena injectie van cellen uit te voeren. Suspensie de cellen in de testbuis en laad 75 microliter in een 0,3 milliliter spuit, ervoor zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de celsuspensie.