Name: Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer de kinetiek van nucleotidebinding en -dissociatie tijdens de ATP-omzetcyclus van kinesin met behulp van stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC), de Royal Society en de Universiteit van Nottingham.

1 Bepaling van de Fluorescence Intensity Verandering van binding van Mant-gemerkt nucleotide. <ol><li> Voeg 1 uM-mant gelabelde nucleotide tot 1 uM kinesine (uiteindelijke concentraties) in een passende reactie buffer. Typisch een buffer die de groei en stabiliteit van microtubuli voordelen wordt gebruikt (zie bespreking). Een algemeen gebruikte buffer bevat 80 mM piperazine-bis-2-ethaansulfonzuur (PIPES) pH6.9, 1 mM MgCl2 en 1 mM ethyleenglycol-bis-2 aminoether-azijnzuur (EGTA). Opmerking: De concentratie van kinesine vermeld in alle protocollen betrekking op de concentratie van nucleotide bindingsplaatsen (dwz motor domeinen). Verschillende kinesins bestaan ​​als monomeren, dimeren of tetrameren en kan dus meer dan een nucleotide bindingsplaats per molecuul bevatten. </li><li> Na een incubatieperiode (1-3 min) en bij een standaard fluorimeter meet het emissiespectrum voor-mant gelabelde nucleotide kinesine complex. Gebruik een excitatie golflengte van 365nm enmaatregel uitgestraalde licht 400-500 nm in stappen van 1 nm. </li><li> Voeg een oplossing van 1 mM mant gelabelde nucleotide in dezelfde reactiebuffer in stap 1.1. </li><li> Meet het emissiespectrum van de mant nucleotide enkel monster, zoals eerder beschreven (zie stap 1.2). </li><li> Normaliseren van de spectra om het signaal bij de golflengte van maximale fluorescentie intensiteit van het spectrum van mant nucleotide in oplossing (dus zonder kinesine) door te delen door de waarde. </li><li> Plot de genormaliseerde spectra (bijvoorbeeld Figuur 2B) om fluorescentie-intensiteit verschillen tussen de mantATP-gebonden en / of mantADP-gebonden kinesine en mant nucleotide in oplossing te observeren. </li></ol> 2 Meting van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten voor mantATP <ol><li> Aan een oplossing van 20 uM kinesine (zie bespreking) in passende Mg2 + -vrije buffer (bijvoorbeeld 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0.1% Tween20), voeg 1mM (eindconcentratie) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 1 mM (eindconcentratie) dithiothreitol (DTT). Opmerking: Toevoeging van Tween20 de buffer wordt aanbevolen als het vermindert / voorkomt dat kinesine eiwit op de kolom voor bufferuitwisseling (Stappen 2.3 en 3.3) </li><li> Incubeer de oplossing bij 25 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Aparte vrije nucleotide en EDTA uit de kinesine met een zwaartekracht G-25 sephadex gelfiltratiekolom volgens de instructies van de fabrikant (zie lijst van materialen). <ol><li> Equilibreer de kolom met ten minste 3 kolomvolumes passende Mg2 + -vrije buffer (zie Stap 2.1). Laad de kinesine-bevattende oplossing op de kolom. Bereid een verzamelbuis door toevoeging van een geschikt volume van 100 mM magnesiumchloride oplossing van de lege buis, zodat de uiteindelijke concentratie van magnesium chloride 1 mM na verzameling van het kinesine oplossing. Onmiddellijke toevoeging van magnesiumchloride helpt stabilise de-nucleotide gratis kinesine. </li><li> Elueren de kinesine met een geschikte Mg 2 + -vrij buffer. Kinesins zijn onstabiel als vrij van nucleotide dus is het belangrijk om snel te werken. Bewaar de nucleotide gratis kinesine op ijs en binnen 1-2 uur. </li></ol></li><li> Tijdens of voorafgaand aan de bereiding van nucleotide vrij kinesine, stelt een mantATP concentratiereeks in dezelfde reactiebuffer als de uiteindelijke oplossing van nucleotide-free kinesine. Bepaal het concentratiebereik van mantATP nodig, overeenkomstig de beschikbare concentratie van kinesine met een typische reeks van 0,1 tot 50 pm (zie stap 2.5 en discussie). </li><li> Bereid een concentratiereeks van nucleotide-free kinesine. Voor elke concentratie van mantATP (Stap 2.4), moet een concentratie van nucleotiden free kinesine zodat het gemerkte nucleotide-mant in 5 tot 10-voudige molaire overmaat ten opzichte kinesine nucleotide bindingsplaatsen worden bereid. </li><li> Stel de golflengte op de gestopte-flow fluorimeter tot 365 nm en het verzamelen van uitgezonden licht bij&gt; 400 nm met behulp van een lange-pass filter. </li><li> Beginnend met de laagste concentratie van mantATP, meng de mantATP met een geschikte concentratie van nucleotiden vrij kinesine in een 1: 1 v / v verhouding met een gestopte stroming fluorimeter (figuur 3A en 3B Inzet). Opmerking: De reactanten worden verdund met 50% na mengen. Houd een nota van de nucleotide concentratie zowel voor als na het mengen (dwz 3,0 / 1,5 uM) om verwarring te voorkomen. </li><li> Passen bij de verandering in de fluorescentie-intensiteit gemeten bij elke concentratie van mantATP een exponentiële functie en een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (dwz, Fluorescentie = A 0 .exp (k obs .t) + (m. t + c), waar een 0 is de amplitude, k obs is de snelheid constant is en t de tijd, zie figuur 3B en discussie). Uit deze past bepalen eensnelheidsconstante (k obs) bij elke concentratie van mantATP. Elke k obs is een convolutie van een vereniging en dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k 1 en k -1). </li><li> Deconvolutie van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten door het plotten van k obs tegen mantATP concentratie (bijvoorbeeld Figuur 3C). Bevestig deze gegevens een lineaire functie (bijvoorbeeld, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) de helling en de y-as intercept verkrijgen. De gradiënt is de snelheidsconstante voor mantATP vereniging (Figuur 1, k 1) met de eenheden M -1 s -1. Het intercept geeft de dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k -1) met eenheden van s -1 (zie bespreking). Opmerking: Deze benadering kan ook worden toegepast op de ADP associatie en dissociatie bepalensnelheidconstanten (Figuur 1, k -4 en k 4) met behulp van mantADP als de nucleotide. </li></ol> 3 Meting van de dissociatiesnelheidsconstante voor mantADP <ol><li> Aan een oplossing van 2 uM kinesine in een geschikte reactiebuffer (bijvoorbeeld 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.1% Tween20), voeg 50 uM mantADP (eindconcentratie). </li><li> Incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder overtollig mantADP en andere vrije nucleotide door buffer uitwisseling kinesine in de gekozen reactiebuffer met een G-25 Sephadex-kolom (zie materialen) volgens de instructies van de fabrikant. De kinesine motor domeinnaam moet nu worden geladen met mantADP. </li><li> Stel de golflengte op de gestopte-flow fluorimeter tot 365 nm en het verzamelen van uitgezonden licht bij&gt; 400 nm met behulp van een lange-pass filter. </li><li> Meng de mantADP.kinesin complex (~ 1 uM) met een 50-voudige of meer molar overmaat ongelabeld ATP in een 1: 1 v / v verhouding met een gestopte stroming fluorimeter (figuur 4A en 4B Inzet). </li><li> Passen bij de afname van de fluorescentie-intensiteit waargenomen in de tijd om een enkele exponentiële functie plus een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (dat wil zeggen, Fluorescentie = A 0 .exp (k obs .t) + (m.t + c), waar een 0 is de amplitude, k obs is de snelheid constant is en t de tijd, zie figuur 4B en discussie). De k obs afgeleid uit deze fit is de snelheidsconstante voor de dissociatie van ADP (figuur 1, k 4) met eenheden van s -1 (zie bespreking). </li></ol>

<ol><li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation%3A+one+engine%2C+many+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li>
<li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li>
<li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li>
<li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li>
<li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+analogues+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li>
<li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li>
<li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li>
<li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+interaction+of+2%27%283%27%29-O-%28N-methylanthraniloyl%29-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1%3A+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li>
<li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li>
<li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li>
<li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li>
<li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li>
<li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich%2C+JA+%22Binding+and+Kinetics+for+Molecular+Biologists%22">Binding and Kinetics for Molecular Biologists</a>. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).</li>
<li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li>
<li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%3A+a+brief+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li>
<li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li>
<li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li>
<li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier presenteren we protocollen voor observatie en analyse van de kinetiek van de overgangen tussen nucleotide staten voor een kinesine. Deze protocollen maken gebruik van de snelle menging werkwijze gestopte stroming in combinatie met fluorescent gelabelde nucleotiden. Werkwijzen van dit type zijn uitgebreid gebruikt nucleotide binding en dissociatie van diverse kinesins 9-11,13-16 studeren. De beschreven hebben waarneming van fosfaat afgifte (Figuur 1, stap 3) niet toe methoden. Echter, gestopte stroming fluorescentie gebruikt om deze overgang zien met een fosfaat sensing eiwit te koppelen van de productie van fosfaat een fluorescentie-intensiteit verandering 17. De werkwijzen voorgesteld gebruik nucleotiden gelabeld met de kleine fluorofoor methylanthraniloyl (mant), die in het algemeen vertonen een toename in fluorescentie-intensiteit wanneer gebonden aan eiwit. Bovendien mant fluorofoor, wanneer geconjugeerd aan ofwel de 2 &#39;of 3&#39; positie op de ribose, heeft vaak weinig of geen effect op de binding, dissociatie of hydrolyse van de nucleotide 9-12. Mant-gemerkte nucleotiden zijn verkrijgbaar bij commerciële bronnen (zie materialen) en worden als mengsels van de 2 &#39;en 3&#39; conjugaat ze snel opnieuw in evenwicht wanneer gezuiverd tot een enkel isomeer 8. -Mant gemerkte nucleotiden maken uitstekende reporter moleculen waarbij de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie kan worden waargenomen. Het gebruik van fluorescent gemerkte nucleotiden betekent dat het uitlezen van de beschreven assays is een realtime verandering in fluorescentie-intensiteit. Dit maakt deze assays geschikt voor gestopte stroming fluorescentie, die snelle menging van de reagentia en real time waargenomen veranderingen in fluorescentie geassocieerd met de daaropvolgende reactie mogelijk maakt. De combinatie van gestopte stroming als de mengtechniek en fluorescentie als detectiemethode vormt een systeem dat relatief sample efdoende. Om bijvoorbeeld de in figuur 3C gegevens door nodig 0,8-1,0 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK, en de in figuur 4B gegevens door nodig ~ 0,3 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK. Een nadeel van het gebruik van mant als een fluorofoor is dat het gevoelig voor fotobleken. Dit kan worden waargenomen los van kinesine reactiekinetiek door een oplossing van gemerkt nucleotide-mant met reactiebuffer, in afwezigheid van kinesine, in de gestopte stroming. Een langzame afname in fluorescentie-intensiteit waargenomen als de mant groep wordt gebleekt. Over het bereik van termijnen in de beschreven fotobleken van de mant groep protocollen wordt goed beschreven door een lineaire functie. Daarom is een eenvoudige manier de gegevens voor fotobleken correct past een exponentiële functie met een uitgangswaarde beschreven door een lineaire functie (dwz mt + c) in plaats van de gebruikelijke vlakke basislijn, beschreven door een enkele parameter. mantATP bindend Bij het meten van snelheidsconstanten van associatie en dissociatie van mantATP (deel 2) de ADP, dat geassocieerd blijft met het kinesine-nucleotide bindingsplaats in afwezigheid van microtubuli, worden verwijderd. Dit maakt mantATP vereniging en dissociatie (Figuur 1, stap 1) in acht worden genomen los van ADP dissociatie. Om dit te bereiken de kinesine wordt geïncubeerd met tenminste een 50-voudige overmaat van EDTA op nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.1). De EDTA sequesters Mg2 +-ionen veroorzaken Mg2 + dissociëren van de nucleotide-bindende pocket, waardoor afgifte van de nucleotide 11. Daarom, bij het ​​uitvoeren van de stappen 2,1-2,3, is het essentieel om een buffer vrij van Mg 2 + gebruiken. De nucleotide-free kinesine eiwit buffer uitgewisseld te scheiden zowel vrij nucleotide en van EDTA. Om deze scheiding, een wegwerp zwaartekracht-stroom ge volbrengenl filtratie kolom is voldoende en is eenvoudig en snel te gebruiken (zie de lijst van materialen). De interactie van mantATP met nucleotide gratis kinesine wordt uitgevoerd bij een reeks mantATP concentraties (Stap 2.4) uitgevoerd om deconvolutie van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten (Stap 2.8) in te schakelen. De theorie achter de experimenten van dit type wordt ook beschreven in referentie 18 Bij het uitvoeren van deze experimenten men begint met de laagste concentratie mantATP. Dit neemt de noodzaak voor wasstappen tussen de verschillende concentraties. Het zal waarschijnlijk nodig zijn om de gevoeligheid van de gestopte stroming fluorimeter aanpast wanneer de mantATP concentratie wordt verhoogd. De mantATP concentratie moet altijd minstens 5-voudige overmaat ten opzichte van de concentratie van kinesine nucleotide bindingsplaatsen aan pseudo eerste orde te handhaven. Aangezien de concentratie van mantATP toeneemt, de signaalverandering kan raken overspoeld als de fractie van nucleotide dat bindt aan afneemt kinesine. Therefore, wordt de concentratie van het kinesine ook verhoogd voor elke concentratie mantATP zodat de concentratie van mantATP nooit groter dan 10-voudige molaire overmaat ten opzichte van nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.6). mantADP Dissociatie Hoewel associatie en dissociatie snelheidsconstanten voor mantADP kan worden bepaald volgens dezelfde methode beschreven voor mantATP (deel 2). Dissociatie van ADP van een kinesine kan direct worden waargenomen door preloading de nucleotide-bindingsplaats met mantADP (stappen 3.1-3.3) De mantADP.kinesin complex wordt vervolgens gemengd met een overmaat ongelabeld ATP (stap 3.5). De overmaat ongelabelde ATP voorkomt opnieuw inbinden van mantADP aan de kinesine en daardoor kan de dissociatie reactie (Figuur 1, k 4) in acht te nemen, los van vereniging van mantADP. In deze test moet de concentratie ongemerkt ATP tenminste een 50-voudige molaire overmaat nuc zijnleotide bindingsplaatsen. De theorie achter deze assay wordt goed beschreven in referentie 18 Deze directe methode geeft een nauwkeuriger waarde voor de dissociatiesnelheidsconstante dan de extrapolatie naar de y-as in stap 2.8 beschreven. Opname van microtubuli De beschreven werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie bepaald in aanwezigheid van microtubules. Microtubuli kennis met de nucleotide met spuit voor het mengen in de gestopte stroming: de onderste spuit in figuur 3B en 4B (Inlegwerk). In deze configuratie zal de kinesine de nucleotide aan op hetzelfde moment als het voldoet aan de microtubules. Gestabiliseerde microtubuli worden gebruikt, waarbij de levensduur van de tubuline polymeer wordt verlengd door het gebruik van ofwel een stabilisatie chemische, zoals taxol of een nonhydrolysable GTP analoog, zoals guanosine-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] trifosfaat (GMPCPP, zie lijst van materialen). Het is mogelijk om twee cycli van tubuline polymerisatie met GMPCPP om microtubuli die kan worden opgeslagen gedurende vele maanden in vloeibare stikstof 9,19 maken. Het gebruik van vooraf bereide microtubuli vermindert significant de praktische problemen bij het uitvoeren van deze testen. Om microtubuli in de assays omvatten, is het belangrijk om een ​​reactie buffer geschikt voor microtubule stabiliteit te gebruiken. De buffer van keuze is gebaseerd PIPES, de meest gebruikte buffer die 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl2 en 1 mM EGTA (zogenaamde BRB80) 20,21. De beschreven werkwijzen zijn niet beperkt tot gebruik met kinesins, maar kan worden aangepast en toegepast op elke nucleotide bindend eiwit. Zo zijn soortgelijke werkwijzen toegepast op de ATP omzet cyclus van leden van de familie van myosine moleculaire motoren 12,22 en het gebruik van mant gemerkte guanosine nucleotiden breidtmethoden van dit type GTP hydrolyse van eiwitten 23,24.

De kinesins zijn een superfamilie van eiwitten gekenmerkt door een zeer geconserveerd domein motor 1. De kinesine motor domein interageert met microtubuli in een nucleotide-afhankelijke wijze. Leden van de kinesine familie te tonen een scala aan functies uit translocerende kinesins, die lading in een gerichte manier langs microtubuli, aan niet-translocerende microtubuli-end binding kinesins, die microtubuli dynamiek 2,3 reguleren. Kinesins gebruik maken van de omzet van adensosine-5&#39;-trifosfaat (ATP) om hun interactie met de microtubuli cytoskelet 4-6 reguleren. De conformatie van het kinesine motor domein en daardoor de affiniteit voor het microtubule afhankelijk van de nucleotide toestand: ATP, ADP kan, ADP.Pi of geen nucleotide gebonden (figuur 1). Naar het moleculaire mechanisme van een kinesine begrijpen, is een goed begrip van de relatie tussen ATP omzet en microtubuli interactie vereist. Hetor wij, een hoofddoel van het veld kinesine betreft de functionele eigenschappen van verschillende nucleotide staten en de kinetiek van de overgangen tussen twee in de aanwezigheid en afwezigheid van microtubuli karakteriseren. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Figuur 1 De eenvoudigste ATP omzet cyclus een kinesine bestaat uit vier mogelijke toestanden: nucleotide-free (Φ), ATP-gebonden, ADP.P i -gebonden en ADP-gebonden Elk van de vier transities gekenmerkt door een voorwaartse en. achteruit snelheidsconstante (k x respectievelijk k -x). Om te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie moet een die stap in de ATP omzet cyclus bepalen is snelheidsbepalend bij afwezigheid van microtubules en bepalen hoe de cyclus wordt veranderd door de aanwezigheid van microtubules. De eenvoudigste ATP omzet cyclus bestaat uit vier afzonderlijke chemische stappen: (1) ATP binding aan de lege plaats (Φ geeft de lege plaats, dat wil zeggen, nucleotide-free kinesine); (2) ATP splitsing; (3) fosfaat dissociatie en (4) ADP dissociatie (figuur 1). De snelheidsbeperkende stap stelt de snelheidsconstante voor de volledige ATP omzet cyclus. Derhalve, om te bepalen welke stap is snelheidsbepalend elk van de afzonderlijke overgangen worden gemeten en vergeleken met de snelheidsconstante voor de gehele cyclus. Methoden om de totale ATP omzet cyclus constant worden hier niet beschreven te meten maar kan worden gevonden referentie 7 Hier beschrijven we methoden waarmee rate constanten voor de afzonderlijke chemische stappen kan worden bepaald. Er zijn verschillende methoden om individuele overgangen bestuderen in de omzet cyclus van een nucleotide hydrolyseren eiwit. De hier gepresenteerde methoden nemen advantage van de eigenschappen van nucleotiden gemerkt met de fluorofoor methylanthraniloyl, meestal aangeduid als mant, die een verandering in fluorescentie-intensiteit weer bij binding aan eiwit 8. De mant wordt gebruikt, omdat het kleine formaat betekent dat, indien gekoppeld aan de ribose (figuur 2A), moet gewoonlijk weinig of geen effect op de kinetiek van nucleotide binding of hydrolyse 9-12. Hier presenteren we protocollen die het gebruik van gemerkte nucleotiden-mant, samen met gestopte stroming fluorescentie, observatie van nucleotide binding en dissociatie mogelijk in de ATP omzet cyclus van kinesine.

<table><tbody><tr><td>2&rsquo;/3&rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&rsquo;trifosfaat&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2&rsquo;/3&rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&rsquo;-difosfaat&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>Het dinatriumzout van ATP wordt aangebracht op een concentratie van 100&nbsp;mM in 100&nbsp;mM MgCl2. De concentratie moet worden geverifieerd door absorptie bij 260&nbsp;nm (e = 15.400&nbsp;M-1cm-1). Oplossing opgeslagen in aliquots bij -20&nbsp;oC.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0,5&nbsp;M stockoplossing in water, pH 8,0. GEVAAR: poeder schadelijk bij inademing.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp;M stockoplossing in water vers gemaakt voor gebruik op dezelfde dag. GEVAAR: poeder schadelijk bij inademing of bij contact met de huid.</td></tr><tr><td>NAP-5 kolom</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex hars zwaartekrachtsstroming gel filtratie kolom</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>niet-hydrolyseerbaar analoog van GTP</td></tr><tr><td>Gestopt-flow fluorimeter&nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>Een fluorimeter met wat leidingen aan, waardoor reagentia snel gemengd kunnen worden in de observatiecuvet. Hierdoor kunnen de kinetics van reacties op tijdschalen van ~0,1&nbsp;-&nbsp;100&nbsp;sec worden gemonitord.</td></tr></tbody></table>

gebruik van stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de atp omzet cyclus van kinesins analyseer

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

De kinesine superfamilie van microtubuli geassocieerde motorische eiwitten delen een karakteristieke motor domein dat zowel hydrolyseert ATP en bindt microtubuli. Kinesins weer verschillen tussen de superfamilie zowel in ATP omzet en in microtubuli interactie. Deze verschillen op maat specifieke kinesins om diverse functies zoals vrachtvervoer, microtubuli schuiven, microtubuli depolymerisatie en microtubuli stabilisatie. Om het werkingsmechanisme van een kinesine begrijpen is het belangrijk te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie. De ATP omzet cyclus ontleden, een benadering om fluorescent gemerkte nucleotiden gebruiken om afzonderlijke stappen in de cyclus visualiseren. Het bepalen van de kinetiek van elk nucleotide overgang in de ATP omzet cyclus kan de snelheidsbeperkende stap of stappen voor de gehele cyclus te identificeren. Voor een kinesine, is het belangrijk om de snelheidsbeperkende stap kennen, inAangezien microtubules, zoals deze stap wordt gewoonlijk versneld duizenden voudig indien de kinesine interageert met microtubules. De cyclus in afwezigheid van microtubuli wordt vergeleken met die in de aanwezigheid van microtubuli volledig begrijpen kinesine ATP omzet cyclus. De kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen doorgaans te snel waarnemen handmatig mengen reagentia, met name in aanwezigheid van microtubules. Een snelle menginrichting, zoals een gestopte stroming fluorimeter, waardoor kinetiek worden waargenomen op tijdschalen van slechts enkele milliseconden, kan worden gebruikt om dergelijke overgangen te controleren. We beschrijven hier protocollen waarin snelle menging van reagentia gestopte stroming wordt gebruikt in combinatie met fluorescent gemerkte nucleotiden ATP omzet cyclus van kinesine ontleden.

Een toename in fluorescentie-intensiteit van de mant groep typisch waargenomen na binding van gemerkt nucleotide-mant een kinesine. De omvang van een dergelijk signaal veranderingen vereist de specifieke kinesine betrokken. Daarom is het nuttig evenwicht metingen zowel de aanwezigheid en grootte van een fluorescentie-intensiteit te bevestigen alvorens aan kinetische testen. Representatieve fluorescentie spectra voor mantATP en mantADP, zowel in oplossing als in complex met de kinesine-13, MCAK, worden getoond in figuur 2B. Deze gegevens wijzen op de toename van de fluorescentie-intensiteit wordt weergegeven door zowel mantATP en mantADP na binding aan MCAK. De verandering in de fluorescentie-intensiteit na binding van mant nucleotide een kinesine wordt gebruikt om te rapporteren over de vereniging en dissociatie van zowel ATP en ADP (afdelingen 2 en 3). Bij MCAK, wordt een fluorescentie-intensiteit waargenomen verschil tussen mantATP.kinesin en mantADP.kinesin <sup&gt; 9. Figuur 3A toont de reactie die optreedt na mengen mantATP met nucleotide free kinesine. Representatieve gegevens illustreren de toename in fluorescentie-intensiteit die optreedt na binding van mantATP de kinesine-13 MCAK wordt getoond in figuur 3B. Gegevens van de in figuur 3B type wordt verzameld op verschillende mantATP concentraties. Een plot van de snelheidsconstanten (k obs) bepaald versus mantATP concentratie wordt weergegeven in Figuur 3C. Montage van deze gegevens aan een lineaire functie (dat wil zeggen, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) maakt deconvolutie van het tarief constanten die bijdragen aan obs (Stap 2.8) k. Daarom, waardoor de bepaling van zowel de vereniging en de dissociatie snelheidsconstante voor mantATP (Figuur 1, k 1 en k <em&gt; -1 respectievelijk). Figuur 4A toont de reactie die plaatsvindt na mengen mantADP.kinesin met een overmaat ongelabeld ATP. De gegevens in Figuur 4B toont de fluorescentie-intensiteit daling waargenomen mantADP bij dissociatie van het kinesine-13, MCAK. Door toepassing van deze gegevens aan een exponentiele functie (stap 3.6) de snelheidsconstante voor dissociatie van mantADP direct bepaald. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Figuur 2 nucleotiden gemerkt met de fluorofoor methylanthraniloyl (mant) worden gebruikt om individuele stappen in de ATP omzet cyclus isoleren. (A) Structuur van mantATP die de positie van de mant fluorofoor geconjugeerd aan ofwel de 2 &#39;of 3&#39; positie op de ribose. (B) genormaliseerde fluorescentie spectra voor mantATP en mantADP in oplossing (maxp) en een mantATPd mantADP in complex met de kinesine MCAK (mATP + MCAK en MADP + MCAK). De mantATP spectra zijn genormaliseerd om de fluorescentie bij max voor mantATP in oplossing en de mantADP spectra zijn genormaliseerd om de fluorescentie bij max voor mantADP in oplossing. De spectra van de mant nucleotiden gemengd met MCAK worden verzameld op 1 min na menging. De concentratie van de reagentia en fluorimeter instellingen worden zoals beschreven in het protocol de stappen 1.1 en 1.2. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Figuur 3 Meting van de vereniging snelheidsconstante van mantATP. (A) Schematische afbeelding van de reactie die plaatsvindt na de menging door gestopt-flow: mantATP (mATP) bindt met nucleotide-vrije kinesine. De fluorescentie-intensiteit van de mant groep toeneemt bij binding aan het eiwit. (B) Fluorescentie signaalwisseling (zwart) waargenomen na mengen mantATP (25 M) met MCAK (5 M nu-cleotide gratis). Deze data is fit (rode stippellijnen) om een enkele exponentiële functie plus een lijn van constante negatieve helling, die goed is voor fotobleken van de mant fluorofoor (zie bespreking) Inzet:. Inhoud van de spuiten voor het mengen van de gestopte-flow fluorimeter. (C) Snelheidsconstanten (k obs) bepaald voor de reactie van mantATP met nucleotide free MCAK uitgezet tegen de concentratie van mantATP. Dit perceel zal een lineaire gebied met het verloop dat de vereniging snelheidsconstante (Figuur 1, k 1) met eenheden van M -1 s -1 en de y-as wordt de dissociatiesnelheidsconstante (Figuur 1, k -1) met zijn eenheden van s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> . Figuur 4 Meting van de dissociatie snelheidsconstante voor mantADP (A) Schematische afbeelding van de reactie die plaatsvindt na de menging door gestopt-flow: kinesine voorgeladen met mantADP wordt in een overmaat van niet-gemerkte ATP verdund. Dissociëren mantADP wordt vervangen door niet-gemerkte ATP, waardoor de achterkant reactie van mantADP vereniging (zie bespreking) voorkomen. De fluorescentie-intensiteit van de mant groep afneemt bij dissociatie van het eiwit. (B) Fluorescentie afname waargenomen na de dissociatie van mantADP de kinesine MCAK. De fluorescentie-signaal (zwart) is fit (rode stippellijn) tot een enkele exponentiële plus een lijn van constante negatieve helling om rekening te houden fotobleken van de mant-groep (zie bespreking). De snelheidsconstante bepaald is de snelheidsconstante voor dissociatie van mantADP (figuur 1, k4) Inzet:.. Inhoud van de spuiten voor het mengen op een gestopte-flow fluorimeter <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Kinesins worden gekenmerkt door nucleotide-afhankelijke interactie met microtubuli: een cyclus van ATP omzet gekoppeld met een cyclus van microtubule interactie. We beschrijven hier protocollen om de kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen in de ATP omzet cyclus van een kinesine met fluorescent gemerkte nucleotiden en gestopte stroming fluorescentie geanalyseerd.

Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie te meten tijdens de A TP-omzettingscyclus van een kinesin. Dit wordt bereikt door eerst het kinesineiwit voor te bereiden, hetzij vrij van nucleotide of geladen met fluorescent gelabelde nucleotide. Vervolgens wordt het voorbereide kinesin gemengd met nucleotide met behulp van een gestopt stroom fluorimeter en wordt de verandering in fluorescentie geassocieerd met binding of dissociatie van fluorescent gelabelde nucleotide waargenomen.Vervolgens wordt de verandering in fluorescentie aangepast aan een exponentiële functie om een snelheidsconstante te verkrijgen. Ten slotte worden de gemeten snelheidsconstanten ontwikkeld en worden snelheidsconstanten toegeschreven aan specifieke overgangen van de A TP-omzettingscyclus. Uiteindelijk wordt de combinatie van fluorescent gelabelde nucleotide en gestopt stroomfluorescentie gebruikt om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie te meten.CIN Demonstratie van de procedure zal Jennifer Patel postdoc en Hannah Belch, een afgestudeerde student uit mijn lab, zijn. Na het bepalen van de fluorescentie-intensiteit van kinesin bij binding van een gelabeld nucleotide zoals beschreven in het tekstprotocol naar een oplossing van maximaal 20 micromolair kinesin in magnesiumvrij buffer bij een millimolair EDTA en een millimolair DTT, incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 25 graden Celsius, zet een zwaartekrachtstroom G 25 SX gelfiltratiekolom op en breng deze in evenwicht met ten minste drie kolomvolumes van een magnesiumvrije buffer. Laad vervolgens de essin-oplossing in de kolom om vrije nucleotiden en EDTA van de kinesin te scheiden.Repareer een opvangbuis door in een volume van 100 millimolair magnesiumchloride-oplossing toe te voegen aan de lege buis, zodat de eindconcentratie van magnesiumchloride een millimolair is. Na verzameling van de kinesinoplossing, gebruik een geschikte magnesiumvrije buffer om snel de kinesin te elueren. De aanwezigheid van magnesiumchloride in de opvangbuis helpt de kinesin direct na Ian van de kolom te stabiliseren, bewaar de kinesin op ijs en gebruik binnen één tot twee uur.Bereid ondertussen een man a TP-concentratiereeks voor. Kies het concentratiebereik volgens de beschikbare concentratie van kinesin. Bereid voor elke concentratie van mant a TP een geschikte concentratie kinesin voor, zodat het man-gelabelde nucleotide in vijf- tot tienvoudig molair overschot is over de kinesin-nucleotidebindingsplaatsen.Stel de excitatiegolflengte op de gestopt stroom fluorimeter in op 365 nanometer en de emissiegolflengte boven de 400 nanometer met een longpassfilter. Begin vervolgens met de laagste concentratie van Manta TP, gebruik de gestopt stroom fluorimeter om de manta TP en nucleotidevrije kinesin in een een-op-een volume-op-volumeverhouding te mengen. Gebruik de volgende formule om de verandering in fluorescentie-intensiteit te passen die wordt gemeten op elke concentratie van mant A TP tot een exponentiële functie, plus een lijn met constante negatieve helling om rekening te houden met fotobleken van de mant-groep.Bepaal uit deze fits een snelheidsconstante bij elke concentratie van mant. A TP ontwikkel vervolgens de associatie- en dissociatiesnelheden door flossing kops tegen de concentratie van mant. A TP Pas vervolgens deze gegevens aan een lineaire functie aan om de helling en y-asonderschep te verkrijgen.De helling vertegenwoordigt de snelheidsconstante voor man a TP-associatie met eenheden per molair per seconde. De onderschep vertegenwoordigt de dissociatiesnelheidsconstante met de eenheden per seconde. Om de dissociatiesnelheidsconstante te meten, fermenteert u DP tot een oplossing van twee micromolair kinesin in een geschikte buffer bij 50.Micromolair betekent een DP incubatie 25 graden Celsius gedurende 30 minuten. Nadat u een G 25 Sedex-kolom heeft gebruikt om fre mant te verwijderen, A DP van de kinesin, geladen met mant A DP, en de gestopt stroom fluter zoals eerder in deze video beschreven, gebruikt u de gestopt stroom om het mant A DP Kinine-complex te mengen met een 50-voudig of groter molair overschot van ongelabelde A TP in een een-op-een volume-op-volumeverhouding. Pas de afname in fluorescentie-intensiteit die in de tijd wordt waargenomen op een enkele exponentiële functie, plus een lijn met constante negatieve helling, aan om rekening te houden met fotobleken van de groep.De kops die uit deze fit wordt bepaald, is de snelheidsconstante voor dissociatie van mant A DP met eenheden per seconde. De grootte van de signaalverandering bij binding of dissociatie van een mantelhout-nucleotide is afhankelijk van de specifieke kinesin. Daarom is het nuttig om eerst evenwichtsmetingen uit te voeren om zowel de aanwezigheid als de grootte van een verandering in fluorescentie-intensiteit te bevestigen.Fluorescente spectra ferment a TP en meant a DP zowel in oplossing als in complex van de kinesin M CAC worden hier getoond. Deze figuur toont de reactie die optreedt bij het mengen van man a TP met nucleotidevrij kinesin. De toename in fluorescentie-intensiteit die optreedt bij binding van man A TP tot M CAC wordt hier getoond, passen de snelheidsconstante ten opzichte van de man.A TP-concentratie aan een lineaire functie zoals hier te zien, stelt deconvolutie van de snelheidsconstante die bijdraagt ​​aan kops mogelijk en biedt de associatie- en dissociatiesnelheidsconstante ferment A TP. Deze figuur toont de afname van de fluorescentie-intensiteit die ferment A DP wordt waargenomen bij dissociatie van M CEC zoals hier geïllustreerd. De snelheidsconstante voor dissociatie van mant A DP van Kinesin wordt bepaald door deze gegevens aan te passen aan een exponentiële functie. Eenmaal onder de knie, kunnen deze protocollen elk in minder dan drie uur worden voltooid.Hoewel deze methode inzichten kan bieden in kinesin, kan deze ook worden toegepast op andere nucleotidebindende eiwitten, zoals myosine en G-eiwitten. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescent gelabelde nucleotiden en een stopflowmeter te gebruiken om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie voor een kinesin te meten.

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.

Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Hier wordt een protocol voorgelegd aan Kinesin-1 ladingen te identificeren. Een motorloze mutant van de kinesine-1 zware keten (KIF5B) aggregaten in het cytoplasma en induceert aggregatie van de ladingen. Beide aggregaten gedetecteerd onder fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om ladingen van andere auto eiwitten te identificeren.

Identificatie van kinesine-1 Cargos Met behulp van fluorescentiemicroscopie

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

Het doel van dit protocol is om temperatuur te gebruiken om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te regelen. Het voordeel van deze methode maakt het niet alleen mogelijk om stroomsnelheden in situ te reguleren, maar maakt ook dynamische controle mogelijk, zoals periodiek afstemmen van stroomsnelheden op en neer.

Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Leer de kinetiek van nucleotidebinding en -dissociatie tijdens de ATP-omzetcyclus van kinesin met behulp van stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden.

Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer

Meer video's verkennen