Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer

Het algemene doel van deze procedure is om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie te meten tijdens de A TP-omzettingscyclus van een kinesin. Dit wordt bereikt door eerst het kinesineiwit voor te bereiden, hetzij vrij van nucleotide of geladen met fluorescent gelabelde nucleotide. Vervolgens wordt het voorbereide kinesin gemengd met nucleotide met behulp van een gestopt stroom fluorimeter en wordt de verandering in fluorescentie geassocieerd met binding of dissociatie van fluorescent gelabelde nucleotide waargenomen.

Vervolgens wordt de verandering in fluorescentie aangepast aan een exponentiële functie om een snelheidsconstante te verkrijgen. Ten slotte worden de gemeten snelheidsconstanten ontwikkeld en worden snelheidsconstanten toegeschreven aan specifieke overgangen van de A TP-omzettingscyclus. Uiteindelijk wordt de combinatie van fluorescent gelabelde nucleotide en gestopt stroomfluorescentie gebruikt om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie te meten.

CIN Demonstratie van de procedure zal Jennifer Patel postdoc en Hannah Belch, een afgestudeerde student uit mijn lab, zijn. Na het bepalen van de fluorescentie-intensiteit van kinesin bij binding van een gelabeld nucleotide zoals beschreven in het tekstprotocol naar een oplossing van maximaal 20 micromolair kinesin in magnesiumvrij buffer bij een millimolair EDTA en een millimolair DTT, incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 25 graden Celsius, zet een zwaartekrachtstroom G 25 SX gelfiltratiekolom op en breng deze in evenwicht met ten minste drie kolomvolumes van een magnesiumvrije buffer. Laad vervolgens de essin-oplossing in de kolom om vrije nucleotiden en EDTA van de kinesin te scheiden.

Repareer een opvangbuis door in een volume van 100 millimolair magnesiumchloride-oplossing toe te voegen aan de lege buis, zodat de eindconcentratie van magnesiumchloride een millimolair is. Na verzameling van de kinesinoplossing, gebruik een geschikte magnesiumvrije buffer om snel de kinesin te elueren. De aanwezigheid van magnesiumchloride in de opvangbuis helpt de kinesin direct na Ian van de kolom te stabiliseren, bewaar de kinesin op ijs en gebruik binnen één tot twee uur.

Bereid ondertussen een man a TP-concentratiereeks voor. Kies het concentratiebereik volgens de beschikbare concentratie van kinesin. Bereid voor elke concentratie van mant a TP een geschikte concentratie kinesin voor, zodat het man-gelabelde nucleotide in vijf- tot tienvoudig molair overschot is over de kinesin-nucleotidebindingsplaatsen.

Stel de excitatiegolflengte op de gestopt stroom fluorimeter in op 365 nanometer en de emissiegolflengte boven de 400 nanometer met een longpassfilter. Begin vervolgens met de laagste concentratie van Manta TP, gebruik de gestopt stroom fluorimeter om de manta TP en nucleotidevrije kinesin in een een-op-een volume-op-volumeverhouding te mengen. Gebruik de volgende formule om de verandering in fluorescentie-intensiteit te passen die wordt gemeten op elke concentratie van mant A TP tot een exponentiële functie, plus een lijn met constante negatieve helling om rekening te houden met fotobleken van de mant-groep.

Bepaal uit deze fits een snelheidsconstante bij elke concentratie van mant. A TP ontwikkel vervolgens de associatie- en dissociatiesnelheden door flossing kops tegen de concentratie van mant. A TP Pas vervolgens deze gegevens aan een lineaire functie aan om de helling en y-asonderschep te verkrijgen.

De helling vertegenwoordigt de snelheidsconstante voor man a TP-associatie met eenheden per molair per seconde. De onderschep vertegenwoordigt de dissociatiesnelheidsconstante met de eenheden per seconde. Om de dissociatiesnelheidsconstante te meten, fermenteert u DP tot een oplossing van twee micromolair kinesin in een geschikte buffer bij 50.

Micromolair betekent een DP incubatie 25 graden Celsius gedurende 30 minuten. Nadat u een G 25 Sedex-kolom heeft gebruikt om fre mant te verwijderen, A DP van de kinesin, geladen met mant A DP, en de gestopt stroom fluter zoals eerder in deze video beschreven, gebruikt u de gestopt stroom om het mant A DP Kinine-complex te mengen met een 50-voudig of groter molair overschot van ongelabelde A TP in een een-op-een volume-op-volumeverhouding. Pas de afname in fluorescentie-intensiteit die in de tijd wordt waargenomen op een enkele exponentiële functie, plus een lijn met constante negatieve helling, aan om rekening te houden met fotobleken van de groep.

De kops die uit deze fit wordt bepaald, is de snelheidsconstante voor dissociatie van mant A DP met eenheden per seconde. De grootte van de signaalverandering bij binding of dissociatie van een mantelhout-nucleotide is afhankelijk van de specifieke kinesin. Daarom is het nuttig om eerst evenwichtsmetingen uit te voeren om zowel de aanwezigheid als de grootte van een verandering in fluorescentie-intensiteit te bevestigen.

Fluorescente spectra ferment a TP en meant a DP zowel in oplossing als in complex van de kinesin M CAC worden hier getoond. Deze figuur toont de reactie die optreedt bij het mengen van man a TP met nucleotidevrij kinesin. De toename in fluorescentie-intensiteit die optreedt bij binding van man A TP tot M CAC wordt hier getoond, passen de snelheidsconstante ten opzichte van de man.

A TP-concentratie aan een lineaire functie zoals hier te zien, stelt deconvolutie van de snelheidsconstante die bijdraagt ​​aan kops mogelijk en biedt de associatie- en dissociatiesnelheidsconstante ferment A TP. Deze figuur toont de afname van de fluorescentie-intensiteit die ferment A DP wordt waargenomen bij dissociatie van M CEC zoals hier geïllustreerd. De snelheidsconstante voor dissociatie van mant A DP van Kinesin wordt bepaald door deze gegevens aan te passen aan een exponentiële functie. Eenmaal onder de knie, kunnen deze protocollen elk in minder dan drie uur worden voltooid.

Hoewel deze methode inzichten kan bieden in kinesin, kan deze ook worden toegepast op andere nucleotidebindende eiwitten, zoals myosine en G-eiwitten. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescent gelabelde nucleotiden en een stopflowmeter te gebruiken om de kinetiek van nucleotidebinding en dissociatie voor een kinesin te meten.