Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer In Vivo

Het algemene doel van deze procedure is om olfactorische sensorische neuronen in vivo te labelen om de axonale morfologie en ontwikkeling te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst fluoro vier gekoppeld dextran in één olfactorisch sensorisch neuron te poren. De tweede stap is om 24 uur te wachten om de kleurstof de kans te geven zich te verspreiden in de axonale processen van de sensorische neuronen.

Vervolgens wordt een kikkervisje geanesthetiseerd en wordt een driedimensionale beeldstapel van de reukbol verkregen met behulp van multifoton-microscopie. De laatste stap is om de gelabelde neuron in hetzelfde dier herhaaldelijk te onderzoeken na gespecificeerde tijdsintervallen. Uiteindelijk maakt reconstructie van de cellulaire morfologie de visualisatie van veranderingen in de axonale morfologie mogelijk.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals hoe axonen naar de doelgebieden in de voorhersenen groeien en hoe synapsen worden gevormd. Voor het experiment. Zorg ervoor dat de electroporatie-opstelling bestaat uit een stereomicroscoop met een grote werkafstand en is uitgerust met fluorescente verlichting en filtersets voor de kleurstof.

Gebruik voor elektroporatie of een speciale elektroporatie voor een enkele cel of een generieke vierkante pulsgenerator die is aangesloten op een oscilloscoop. Verbind de uitgangen van de elektroporatie met een pipethouder en een badelektrode. Zorg ervoor dat zowel de pipethouder als de badelektrode zilverdraden bevatten die zijn bedekt met een dunne laag zilverchloride.

Monteer vervolgens de pipethouder op een micromanipulator om nauwkeurige positionering mogelijk te maken. Maak daarna de micropipetten voor elektroporatie met bo-silicaat glas capillairen met een intern filament. Stel de parameters van de micropipet polar in om een micropipet met langere schacht en kleinere tipopening met hoge pipetweerstand voor elektroporatie van een enkele cel te produceren.

Meet vervolgens de pipetweerstand direct met de speciale elektroporatie voor een enkele cel. Los in deze procedure fluoro vier gekoppeld dextran op in de kikker-ringer bij een concentratie van drie millimolar. Verdeel deze stockoplossing in kleine aliquots en bewaar de een voor toekomstig gebruik in de vriezer.

Vul vervolgens de micropipet met één tot vijf microliter dextranoplossing. Klop voorzichtig de micropipet af om resterende luchtbellen uit de pipettip te verwijderen. Monteer vervolgens de micropipet in de pipethouder.

Zorg ervoor dat de zilverdraad in de pipet in contact staat met de kleurstoffoplossing. Plaats nu een klein stukje weefsel in een petrischaal en bedek het met een kleine hoeveelheid water met 0,02% trica. Anesthetiseer vervolgens een pre metamorfisch kikkervisje in het water met 0,02% trica.

Bevestig de juiste anesthesie door het aan te raken en ervoor te zorgen dat het niet reageert. Breng vervolgens het kikkervisje voorzichtig over naar de met weefsel beklede petrischaal. Zorg ervoor dat de elektrode in contact is met het natte weefsel en positioneer de micropipettip dicht bij het reukorgaan van het kikkervisje met behulp van een micromanipulator.

Doorboor vervolgens de huid die het reukorgaan bedekt. Breng met de pipettip voorzichtig de punt in de centraal gelegen sensorische neuronlaag van het hoofdreukepithelium of MRO-neusepithelium. Activeer nu de positieve vierkante spanningspulsen om de kleurstof over te brengen naar de sensorische neuronen door een enkele spanningspool of treinen van meerdere pulsen toe te passen.

Visualiseer vervolgens de succesvolle kleurstoffextrusie en elektroporatie met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop. De kleurstof verspreidt zich snel in het cellichaam en de dendrieten na een succesvolle elektroporatie. Na het herhalen van de procedures voor het tweede reukorgaan van het kikkervisje, zet het kikkervisje over in een beker gevuld met vers water voor herstel en laat de geëlektropoteerde kleurstof zich verspreiden naar de sensorische neuronen en de reukbol.

Ten minste 24 uur na elektroporatie, anesthetiseer het kikkervisje in het water met 0,02% trica. Breng vervolgens het kikkervisje voorzichtig over naar een beeldvormingskamer. Snijd een klein rechthoekje uit een strook param.

Bedek vervolgens het kikkervisje met de param, waarbij het voorste staart-cephalon door het uitgesneden venster zichtbaar blijft. Bevestig de param met naalden op de schaal zonder het kikkervisje te verwonden en zorg ervoor dat het kikkervisje ondergedompeld is in voldoende water met 0,02% Trica. Monteer vervolgens de beeldvormingskamer op het podium van een rechtopstaande multifotonmicroscoop of een confocale microscoop.

Verkrijg een driedimensionale stapel beelden van de reukbol en zorg ervoor dat de beeldvormingsprocedure niet langer is dan 10 tot 15 minuten. Breng vervolgens het kikkervisje terug naar normaal water in een aparte tank en bescherm het tegen lichtblootstelling. In dit beeld zijn vier dekstrengen gekoppeld aan verschillende fluoro viers geëlektropoteerd op vier verre locaties van het reukorgaan, lateraal aangegeven door groen, intermediair aangegeven door geel, mediaal aangegeven door rood en het vomer-neusorgaan aangegeven door oranje.

Dit maakt de visualisatie van de accessoire reukbol en de drie hoofdprojectievelden van de hoofdreukbol mogelijk. Dit beeld toont driedimensionale reconstructies van verschillende axonale groeipatronen van afzonderlijke olfactorische sensorische neuronen die zijn gesuperponeerd op de structuur van de reukbol, en hier is een voorbeeld van een enkele olfactorische sensorische neuronaxon die zich projecteert in de reukbol en een tufted arborisatie vormt in sferische glomerulaire. Zoals hier in Opus Levu te zien is, splitsen deze axonen regelmatig voordat ze zich aansluiten op één, twee of meerdere gmer.

Dit is een representatief voorbeeld van een individueel olfactorisch sensorisch neuron dat herhaaldelijk werd onderzocht door middel van in vivo time lapse beeldvorming, wat continue veranderingen in axonale morfologie toont. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe olfactorische sensorische neuronen via elektroporatie worden gelabeld en hoe hun ontwikkeling wordt gemonitord met behulp van in vivo TimeLapse beeldvorming.