Regioselectieve Biolistische Targeting in Organotypische Brain Plakjes met een aangepaste Gene Gun

Het doel van deze procedure is om snel en efficiënt verschillende gebieden van organotypische plakjes te transfecteren of labelen met behulp van een gene gun. Dit wordt bereikt door eerst levensvatbare organotypische plakjes van de hersenen of andere weefsels te bereiden. De tweede stap is het produceren van DNA of gedecodeerde gouddeeltjes voor biotische levering.

Vervolgens wordt de organotypische plak onder een gestabiliseerd gene gun-montage geplaatst en worden de gecoate deeltjes in het weefsel afgevuurd voor episomale transformatie of labelen. De laatste stap is het observeren of analyseren van het effect van heterologe genen die naar de geïsoleerde regio's zijn geleverd. Uiteindelijk stelt deze aanpak de gebruiker in staat om precies verschillende regio's van de orgaansneden te transfecteren met verschillende heterologe genen.

Het grootste voordeel van deze methode boven bestaande methoden is dat biologische levering het mogelijk maakt om terminaal gedifferentieerde cellen te transfecteren, evenals het beperken van de actieradius tot een kleine diameter. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van belangrijke neurobiologische vragen, zoals het begrijpen van de regionale bijdrage van een enkel gen. Begin deze procedure door een verse hersenen in een kleine ontvangervorm te plaatsen.

Bedek het met de ARO-oplossing, die iets boven kamertemperatuur is gebracht. Koel vervolgens de mal snel af tot vier graden Celsius door hem op ijs te plaatsen. Wanneer de aros is uitgehard.

Haal na vijf tot tien minuten de met aros ingebedde hersenen uit de mal. Lijm het daarna op het fibro slicer-platform. Breng vervolgens het platform over naar de Vibra slicer-kamer met steriele ijskoude PBS.

Na het snijden, plaats de plakjes voorzichtig op de celcultuurinzetstukken in een zesvoudige multi-well tray met kweekmedium aan de buitenkant van de inzet. Incubeer ze in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Bereid in deze procedure de nanoprojectielen voor met goudparticles van 40 nanometer diameter door eerst 50 microliter 0,05 molaire spermaïne toe te voegen, en 10 microliter DNA bij één milligram per milliliter aan 10 milligram goudparticles.

Voeg vervolgens calciumchloride toe aan het oplossingsmengsel om de binding van DNA-moleculen aan de gouden nanodeeltjes te bevorderen. Trek daarna de oplossing met een spuit in de slang. Plaats de slang in de slangvoorbereidingsstation.

Laat de goudparticles bezinken. Verwijder vervolgens de supinate door aspiratie met een spuit. Draai de slang om de goudparticles gelijkmatig te verspreiden.

Droog vervolgens de deeltjes onder een constante stikstofstroom van vijf liter per minuut. Om DNA-kogels te maken, snijd de slang in stukken van één centimeter met een slangensnijder. Plaats ze vervolgens direct in de gene groeikaart of bewaar ze gedurende vier graden Celsius tot gebruik in een steriele laminaire flow-kap, laad de cartridge met het met DNA gecoate goud in de cartridgehouder.

Laad vervolgens de houder in de gene gun. Bevestig de gemodificeerde gene gun-loop aan deze met behulp van steriele pincetten. Plaats een filterinzet met een organotypische plak in een steriele plastic schaal.

Verwijder het medium van de organotypische plak. Stel vervolgens de gasdruk in op 50 PSI met behulp van de montage. Plaats de gene gun op een afstand van 10 millimeter boven het gewenste gebied van de plak voor genetische levering.

Richt vervolgens voorzichtig op het centrum van de loop en vuur de gecoate deeltjes in het weefsel. Na de biotische transfectie, was de plak voorzichtig twee keer met PBS. Bevestig vervolgens de plak door 20 minuten in 4% ijskoud PFA in PBS te incuberen.

Was daarna de plak twee keer in PBS. Snijd opnieuw voorzichtig het membraan los van de inzet met een scalpel zonder de plak te verstoren. Plaats vervolgens de membraandoos op een microscoopglaasje met pincetten en laat de organotypische plak erop rusten.

Voeg vervolgens één druppel montagemedium toe op de plak. Plaats een dekglas voorzichtig zonder enige kracht direct in contact met het weefsel. Bevestig vervolgens het dekglas met een dunne laag nagellak.

Deze figuur toont de biotische levering van fluorescent eiwit gecodeerd DNA in de organotypische plak van een zes weken oude muis. Zoals hier te zien is, vertoont een bikini-neuron met een opmerkelijke dendritische haven, gevonden op het grensvlak van de bikini-laag en de moleculaire laag van de cerebellum, uitgesproken labelen na tijdelijke biotische transfectie met P-E-G-F-P-N een. Hier is een hogere vergroting van de dendrieten met de stekels, en hier is een parametale cel gevonden in de ca een regio van de hippocampus.

Na de biotische levering van PDS Red FP gecoate goudnanodeeltje. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in slechts enkele uren worden uitgevoerd gedurende de periode van drie tot vier dagen na deze procedure. Andere methoden zoals confocale microscopie kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe bepaalde neuronen zijn verbonden met aangrenzende regio's.