Methoden voor neuronale transfectie

Transfectie - de overdracht van genetisch materiaal in zoogdiercellen - is een waardevol instrument waarmee wetenschappers neuronen en neuraal weefsel genetisch kunnen manipuleren. De unieke eigenschappen van deze delicate cellen maken transfectie uitdagend en vereisen gespecialiseerde technieken.

Deze video bespreekt de principes achter het transfecteren van neuronen en introduceert strategieën die veelvuldig bij deze cellen worden toegepast, waaronder nucleofectie, biolistische transfectie en virale transductie. Tot slot bespreken we de toepassingen van transfectietechnieken in het cel- en moleculair neurowetenschappelijk onderzoek.

Laten we beginnen met een overzicht van hoe transfectie werkt. Hoewel genetisch materiaal in de directe nabijheid van een gecultiveerde cel kan worden gebracht door het aan het omringende medium toe te voegen, kunnen nucleotiden celmembranen niet efficiënt penetreren.

Alle transfectieprotocollen zijn ontworpen om genetisch materiaal in staat te stellen deze barrière te omzeilen. Nucleotiden die de eiwitproductie blokkeren, zoals silencing RNA, kunnen hun functie onmiddellijk uitoefenen zodra ze het cytoplasma binnendringen. DNA-gebaseerde constructen moeten echter voor translatie naar de nucleus worden getransporteerd voordat de eiwitsynthese kan beginnen.

In delende cellen kan de afbraak van de kernenvelope tijdens de mitose leiden tot de incorporatie van getransfecteerd DNA in de zich hervormende kernen van de dochtercellen. Omdat de meeste gecultiveerde neuronen post-mitotische - of niet-delende - cellen zijn, zijn gespecialiseerde transfectieprotocollen vereist om succesvol genexpressie te induceren.

Laten we ons overzicht van deze protocollen beginnen met nucleofectie. Deze techniek maakt gebruik van een combinatie van een geïnduceerd elektrisch veld en chemische reagentia, die samen werken om tijdelijke, porie-achtige structuren te creëren in zowel de cel- als de kernmembranen. Aangezien nucleotiden geladen zijn, drijft het elektrische veld ook de beweging van DNA door de poriën aan.

Om deze procedure uit te voeren, worden neuronen in suspensie vóór resuspensie in een commercieel nucleofectiereagens via centrifugatie verzameld in een pellet. Het celmengsel wordt vervolgens gecombineerd met gezuiverd DNA en overgebracht naar een electroporatiecuvet, die is voorzien van twee aluminium platen die elektrisch contact maken met het Nucleofector-apparaat. Dit apparaat levert een reeks snelle elektrische pulsen, waarvan het aantal en de duur zijn aangepast aan het celtype. Na de nucleofectie kunnen de cellen worden verdund in kweekmedium en worden uitgeplaat voor verdere groei.

Als alternatief kan met de gene gun-techniek door transfectiebarrières worden gebroken door projectielen die genetisch materiaal bevatten door zowel de cel- als de kernmembranen te schieten.

Om gene gun-projectielen te maken, wordt DNA dat codeert voor het gen van belang neergeslagen op kralen op micronschaal, gewoonlijk bestaande uit goud. Na een incubatie van 10 minuten worden de kralen gewassen en overgebracht naar buisjes. Terwijl de oplossing droogt, worden de buisjes gedraaid, wat resulteert in een uniforme coating van de kralen. Vervolgens worden de buisjes in cartridges gesneden en in het apparaat geladen. De gasgestuurde afgifte van de genetische lading kan worden uitgevoerd op cellen die groeien in standaard kweekplaten door eenvoudig op de trekker te drukken.

Ten slotte maakt virale transductie gebruik van de virale levenscyclus om vreemd genetisch materiaal in de nucleus af te leveren. RNA dat het gen van belang codeert, wordt verpakt in gemodificeerde retrovirussen, bekend als lentivirale vectoren, die doelcellen binnendringen door te binden aan specifieke membraaneiwitten, wat een membraanfusie induceert. Het virale RNA wordt vervolgens omgezet in een complementaire DNA-streng die naar de nucleus wordt getransporteerd.

Let er voordat u met deze procedure begint op dat virussen zowel de cellen in uw lichaam als de cellen in uw kweekschaal kunnen infecteren, waardoor het volgen van de veiligheidsrichtlijnen uiterst belangrijk is.

De eerste stap is het genereren van de lentivirale partikels die uw gen van belang dragen. Dit wordt bereikt door de bouwstenen van het virus tot expressie te brengen in een menselijke cellijn die is geoptimaliseerd voor virale productie, zoals 293T-cellen. Om onnodige verspreiding van gemanipuleerde virussen te voorkomen, worden de genen die nodig zijn voor hun assemblage gescheiden gehouden van de transfervector, waarvan de sequentie zal worden opgenomen in het infectieuze partikel.

Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de volledig geassembleerde virussen in het kweekmedium worden afgegeven, waar ze kunnen worden verzameld en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Vervolgens wordt de juiste concentratie, of titer, van het virus bepaald door het succes van de transductie in een testcellijn te beoordelen. De lentivirale vector wordt daarna toegevoegd aan de neuronale doelcultuur en gewoonlijk 24 tot 48 uur geïncubeerd om te garanderen dat de infectie heeft plaatsgevonden.

Nu u bekend bent met de gangbare transfectietechnieken, zal de keuze voor een specifieke methode afhangen van de doelen van uw experimenten. Laten we naar enkele voorbeelden kijken.

Om te beginnen: het observeren van de rijping van neuronen in cultuur maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van de morfologische veranderingen die belangrijk zijn voor de neuronale connectiviteit, zoals de vorming van dendritische spines. Om de celmorfologie in de tijd te visualiseren, maakten deze onderzoekers gebruik van nucleofectie om een fluorescent eiwit in gecultiveerde neuronen over te brengen. Hierbij werd een fluorescent gelabeld tubuline-eiwit getransfecteerd in een subset van cellen, wat gedetailleerde analyses van celprocessen via fluorescentiemicroscopie mogelijk maakte. Omdat de expressieniveaus gedurende de gehele levensduur van het neuron werden gehandhaafd, kon de morfologische analyse gedurende ten minste een maand in cultuur worden uitgevoerd.

Transfectie kan ook worden gebruikt om de impact van specifieke genetische mutaties op de neuronale functie te testen. Een genenkanon kan worden gebruikt om DNA over te brengen dat codeert voor wild-type of mutante versies van een eiwit, waarna de kortetermijneffecten op de celbiologie kunnen worden beoordeeld, bijvoorbeeld door middel van patchclamp-registratie van het vuren van neuronen.

Tot slot is een veelgebruikte strategie om de functie van een gen te testen door te observeren wat er met cellen gebeurt wanneer de expressie ervan wordt geblokkeerd. Voor deze experimenten kunnen lentivirale vectoren worden gebruikt om silencing RNA-constructen over te brengen, die de eiwitsynthese voorkomen. In dit experiment leidt knockdown van genen die geassocieerd zijn met de ziekte van Parkinson tot een significante afname van de celviabiliteit.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over de transfectie van neuronen bekeken. In deze video hebben we de principes van neuron-transfectie geïntroduceerd, evenals de procedures en toepassingen voor drie veelgebruikte transfectiestrategieën.

Bedankt voor het kijken!