Neuronale transfectiemethoden
Transfectie - de overdracht van genetisch materiaal in zoogdiercellen - is een waardevol hulpmiddel dat wetenschappers in staat stelt om neuronen en neuronaal weefsel genetisch te manipuleren. De unieke eigenschappen van de delicate cellen maken transfectie uitdagend en vereisen gespecialiseerde technieken.
Deze video bespreekt de principes achter het transfecteren van neuronen en introduceert strategieën die vaak op deze cellen worden toegepast, waaronder nucleofectie, biolistische transfectie en virale transductie. Ten slotte zullen we de toepassingen van transfectietechnieken in de onderzoeksgebieden cel- en moleculaire neurowetenschappen bespreken.
Laten we beginnen met een overzicht van hoe transfectie werkt. Hoewel genetisch materiaal in de buurt van een gekweekte cel kan worden gebracht door het aan het omgevingsmedium toe te voegen, kunnen nucleotiden de celmembranen niet efficiënt binnendringen.
Alle transfectieprotocollen zijn ontworpen om genetisch materiaal deze barrière te laten passeren. Nucleotiden die de eiwitproductie blokkeren, zoals silencing RNA, kunnen hun functie onmiddellijk uitvoeren zodra ze het cytoplasma binnenkomen. DNA-constructen moeten echter in de kern worden getransporteerd voor translatie voordat eiwitsynthese kan beginnen.
In delende cellen kan de afbraak van de kernvlies tijdens de mitose resulteren in de opname van getransfecteerd DNA in de zich herstellende dochtercelkernen. Omdat de meeste gekweekte neuronen post-mitotisch zijn - of niet-delende - cellen, zijn gespecialiseerde transfectieprotocollen vereist om genexpressie succesvol te induceren.
Laten we ons overzicht van deze protocollen beginnen met nucleofectie. Deze techniek maakt gebruik van een combinatie van een geïnduceerd elektrisch veld en chemische reagentia, die samenwerken om tijdelijke, poriachtige structuren in zowel de cel- als kernmembranen te creëren. Omdat nucleotiden geladen zijn, drijft het elektrische veld ook de beweging van DNA door de poriën aan.
Om deze procedure uit te voeren, worden neuronen in suspensie verzameld in een pellet door centrifugatie voordat ze worden gesuspendeerd in commercieel nucleofectiereagens. Het cellenmengsel wordt vervolgens gecombineerd met gezuiverd DNA en overgebracht naar een elektroporatiecuvet, die twee aluminium platen bevat die elektrische contact maken met het Nucleofector-apparaat. Dit apparaat levert een reeks snelle elektrische pulsen, waarvan het aantal en de duur zijn aangepast op het celtype. Na nucleofectie kunnen de cellen worden verdund in kweekmedium en worden geplaat voor verdere groei.
Alternatief, de gene gun-techniek schiet door transfectiebarrières heen, door kogels met genetisch materiaal door zowel cel- als kernmembranen te schieten.
Om gene gun-kogels te maken, wordt DNA dat uw gen van belang codeert, geprecipiteerd op micron-schaalbeadles, meestal samengesteld uit goud. Na een incubatie van 10 minuten worden de beadles gewassen en overgebracht in behuizing. De behuizing wordt vervolgens geroteerd terwijl de oplossing droogt, wat resulteert in een uniforme coating van beadles. Vervolgens wordt de behuizing in cartridges gesneden en in de pistool geplaatst. Gas-aangedreven levering van de genetische lading kan worden uitgevoerd op cellen die groeien in standaard kweekplaten door eenvoudig het trekker te trekken.
Ten slotte maakt virale transductie gebruik van de virale levenscyclus om vreemd genetisch materiaal in de kern te brengen. RNA dat codeert voor het gen van belang wordt verpakt in gemodificeerde retrovirussen, bekend als lentivirale vectoren, die toegang krijgen tot doelcellen door te binden aan specifieke membraaneiwitten, wat een membraanfusie-gebeurtenis triggert. Het virale RNA wordt vervolgens omgekeerd getranskribeerd in een complementair DNA-streng die in de kern wordt getransporteerd.
Voordat u met deze procedure begint, moet u weten dat virussen zowel de cellen in uw lichaam als de cellen in uw schaal kunnen infecteren, dus het volgen van veiligheidsrichtlijnen is uiterst belangrijk.
De eerste stap is het genereren van de lentivirale deeltjes die uw gen van belang dragen. Dit wordt bereikt door de bouwstenen van het virus tot expressie te brengen in een humane cellijn die is geoptimaliseerd voor virale productie, zoals 293T-cellen. Om de onnodige verspreiding van gemanipuleerde virussen te voorkomen, worden de genen die nodig zijn voor hun samenstelling gescheiden gehouden van de transfervector, waarvan de sequentie in het besmettelijke deeltje zal worden opgenomen.
Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de volledig geassembleerde virussen worden vrijgelaten in het kweekmedium, waar ze kunnen worden verzameld en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Vervolgens wordt de juiste concentratie, of titer, van het virus bepaald door de transductiesucces te beoordelen in een testcellijn. De lentivirale vector wordt vervolgens toegevoegd aan de doelneuronencultuur en meestal gedurende 24 tot 48 uur geïncubeerd om ervoor te zorgen dat infectie heeft plaatsgevonden.
Nu u bekend bent met de gebruikelijke transfectietechnieken, zal degene die u gebruikt afhangen van de specifieke doelen van uw experimenten. Laten we enkele voorbeelden bekijken.
Om te beginnen, het observeren van de rijping van neuronen in cultuur maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van de morfologische veranderingen die belangrijk zijn voor neuronale connectiviteit, zoals de vorming van dendritische stekels. Om de celmorfologie in de tijd te visualiseren, maakten deze onderzoekers gebruik van nucleofectie om een fluorescerend eiwit in gekweekte neuronen te leveren. Hier werd een fluorescent-gelabeld tubuline-eiwit in een subset van cellen getransfecteerd, wat gedetailleerde analyses van celprocessen mogelijk maakte via fluorescentiemicroscopie. Omdat de expressieniveaus gedurende de levensduur van de neuronen werden gehandhaafd, kon morfologische analyse gedurende ten minste een maand in cultuur worden uitgevoerd.
Transfectie kan ook worden gebruikt om de impact van specifieke genetische mutaties op neuronfunctie te testen. Een gene gun kan worden gebruikt om DNA te leveren dat codeert voor wilde type of mutante versies van een eiwit, en kortetermijneffecten op de cellulaire biologie kunnen worden beoordeeld, bijvoorbeeld door patch clamp-opname van neuronontlading.
Ten slotte is een veelgebruikte strategie om
Transfectie - het proces van het overbrengen van genetisch materiaal naar cellen - is een krachtig hulpmiddel voor de snelle en efficiënte manipulatie…
Transfectie - de overdracht van genetisch materiaal in zoogdiercellen - is een waardevol hulpmiddel dat wetenschappers in staat stelt om neuronen en neuronaal weefsel genetisch te manipuleren. De unieke eigenschappen van de delicate cellen maken transfectie uitdagend en vereisen gespecialiseerde technieken.
Deze video bespreekt de principes achter het transfecteren van neuronen en introduceert strategieën die vaak op deze cellen worden toegepast, waaronder nucleofectie, biolistische transfectie en virale transductie. Ten slotte zullen we de toepassingen van transfectietechnieken in de onderzoeksgebieden cel- en moleculaire neurowetenschappen bespreken.
Laten we beginnen met een overzicht van hoe transfectie werkt. Hoewel genetisch materiaal in de buurt van een gekweekte cel kan worden gebracht door het aan het omgevingsmedium toe te voegen, kunnen nucleotiden de celmembranen niet efficiënt binnendringen.
Alle transfectieprotocollen zijn ontworpen om genetisch materiaal deze barrière te laten passeren. Nucleotiden die de eiwitproductie blokkeren, zoals silencing RNA, kunnen hun functie onmiddellijk uitvoeren zodra ze het cytoplasma binnenkomen. DNA-constructen moeten echter in de kern worden getransporteerd voor translatie voordat eiwitsynthese kan beginnen.
In delende cellen kan de afbraak van de kernvlies tijdens de mitose resulteren in de opname van getransfecteerd DNA in de zich herstellende dochtercelkernen. Omdat de meeste gekweekte neuronen post-mitotisch zijn - of niet-delende - cellen, zijn gespecialiseerde transfectieprotocollen vereist om genexpressie succesvol te induceren.
Laten we ons overzicht van deze protocollen beginnen met nucleofectie. Deze techniek maakt gebruik van een combinatie van een geïnduceerd elektrisch veld en chemische reagentia, die samenwerken om tijdelijke, poriachtige structuren in zowel de cel- als kernmembranen te creëren. Omdat nucleotiden geladen zijn, drijft het elektrische veld ook de beweging van DNA door de poriën aan.
Om deze procedure uit te voeren, worden neuronen in suspensie verzameld in een pellet door centrifugatie voordat ze worden gesuspendeerd in commercieel nucleofectiereagens. Het cellenmengsel wordt vervolgens gecombineerd met gezuiverd DNA en overgebracht naar een elektroporatiecuvet, die twee aluminium platen bevat die elektrische contact maken met het Nucleofector-apparaat. Dit apparaat levert een reeks snelle elektrische pulsen, waarvan het aantal en de duur zijn aangepast op het celtype. Na nucleofectie kunnen de cellen worden verdund in kweekmedium en worden geplaat voor verdere groei.
Alternatief, de gene gun-techniek schiet door transfectiebarrières heen, door kogels met genetisch materiaal door zowel cel- als kernmembranen te schieten.
Om gene gun-kogels te maken, wordt DNA dat uw gen van belang codeert, geprecipiteerd op micron-schaalbeadles, meestal samengesteld uit goud. Na een incubatie van 10 minuten worden de beadles gewassen en overgebracht in behuizing. De behuizing wordt vervolgens geroteerd terwijl de oplossing droogt, wat resulteert in een uniforme coating van beadles. Vervolgens wordt de behuizing in cartridges gesneden en in de pistool geplaatst. Gas-aangedreven levering van de genetische lading kan worden uitgevoerd op cellen die groeien in standaard kweekplaten door eenvoudig het trekker te trekken.
Ten slotte maakt virale transductie gebruik van de virale levenscyclus om vreemd genetisch materiaal in de kern te brengen. RNA dat codeert voor het gen van belang wordt verpakt in gemodificeerde retrovirussen, bekend als lentivirale vectoren, die toegang krijgen tot doelcellen door te binden aan specifieke membraaneiwitten, wat een membraanfusie-gebeurtenis triggert. Het virale RNA wordt vervolgens omgekeerd getranskribeerd in een complementair DNA-streng die in de kern wordt getransporteerd.
Voordat u met deze procedure begint, moet u weten dat virussen zowel de cellen in uw lichaam als de cellen in uw schaal kunnen infecteren, dus het volgen van veiligheidsrichtlijnen is uiterst belangrijk.
De eerste stap is het genereren van de lentivirale deeltjes die uw gen van belang dragen. Dit wordt bereikt door de bouwstenen van het virus tot expressie te brengen in een humane cellijn die is geoptimaliseerd voor virale productie, zoals 293T-cellen. Om de onnodige verspreiding van gemanipuleerde virussen te voorkomen, worden de genen die nodig zijn voor hun samenstelling gescheiden gehouden van de transfervector, waarvan de sequentie in het besmettelijke deeltje zal worden opgenomen.
Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de volledig geassembleerde virussen worden vrijgelaten in het kweekmedium, waar ze kunnen worden verzameld en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Vervolgens wordt de juiste concentratie, of titer, van het virus bepaald door de transductiesucces te beoordelen in een testcellijn. De lentivirale vector wordt vervolgens toegevoegd aan de doelneuronencultuur en meestal gedurende 24 tot 48 uur geïncubeerd om ervoor te zorgen dat infectie heeft plaatsgevonden.
Nu u bekend bent met de gebruikelijke transfectietechnieken, zal degene die u gebruikt afhangen van de specifieke doelen van uw experimenten. Laten we enkele voorbeelden bekijken.
Om te beginnen, het observeren van de rijping van neuronen in cultuur maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van de morfologische veranderingen die belangrijk zijn voor neuronale connectiviteit, zoals de vorming van dendritische stekels. Om de celmorfologie in de tijd te visualiseren, maakten deze onderzoekers gebruik van nucleofectie om een fluorescerend eiwit in gekweekte neuronen te leveren. Hier werd een fluorescent-gelabeld tubuline-eiwit in een subset van cellen getransfecteerd, wat gedetailleerde analyses van celprocessen mogelijk maakte via fluorescentiemicroscopie. Omdat de expressieniveaus gedurende de levensduur van de neuronen werden gehandhaafd, kon morfologische analyse gedurende ten minste een maand in cultuur worden uitgevoerd.
Transfectie kan ook worden gebruikt om de impact van specifieke genetische mutaties op neuronfunctie te testen. Een gene gun kan worden gebruikt om DNA te leveren dat codeert voor wilde type of mutante versies van een eiwit, en kortetermijneffecten op de cellulaire biologie kunnen worden beoordeeld, bijvoorbeeld door patch clamp-opname van neuronontlading.
Ten slotte is een veelgebruikte strategie om
Transfectie - de overdracht van genetisch materiaal in zoogdiercellen - is een waardevol hulpmiddel dat wetenschappers in staat stelt om neuronen en neuronaal weefsel genetisch te manipuleren. De unieke eigenschappen van de delicate cellen maken transfectie uitdagend en vereisen gespecialiseerde technieken.
Deze video bespreekt de principes achter het transfecteren van neuronen en introduceert strategieën die vaak op deze cellen worden toegepast, waaronder nucleofectie, biolistische transfectie en virale transductie. Ten slotte zullen we de toepassingen van transfectietechnieken in de onderzoeksgebieden cel- en moleculaire neurowetenschappen bespreken.
Laten we beginnen met een overzicht van hoe transfectie werkt. Hoewel genetisch materiaal in de buurt van een gekweekte cel kan worden gebracht door het aan het omgevingsmedium toe te voegen, kunnen nucleotiden de celmembranen niet efficiënt binnendringen.
Alle transfectieprotocollen zijn ontworpen om genetisch materiaal deze barrière te laten passeren. Nucleotiden die de eiwitproductie blokkeren, zoals silencing RNA, kunnen hun functie onmiddellijk uitvoeren zodra ze het cytoplasma binnenkomen. DNA-constructen moeten echter in de kern worden getransporteerd voor translatie voordat eiwitsynthese kan beginnen.
In delende cellen kan de afbraak van de kernvlies tijdens de mitose resulteren in de opname van getransfecteerd DNA in de zich herstellende dochtercelkernen. Omdat de meeste gekweekte neuronen post-mitotisch zijn - of niet-delende - cellen, zijn gespecialiseerde transfectieprotocollen vereist om genexpressie succesvol te induceren.
Laten we ons overzicht van deze protocollen beginnen met nucleofectie. Deze techniek maakt gebruik van een combinatie van een geïnduceerd elektrisch veld en chemische reagentia, die samenwerken om tijdelijke, poriachtige structuren in zowel de cel- als kernmembranen te creëren. Omdat nucleotiden geladen zijn, drijft het elektrische veld ook de beweging van DNA door de poriën aan.
Om deze procedure uit te voeren, worden neuronen in suspensie verzameld in een pellet door centrifugatie voordat ze worden gesuspendeerd in commercieel nucleofectiereagens. Het cellenmengsel wordt vervolgens gecombineerd met gezuiverd DNA en overgebracht naar een elektroporatiecuvet, die twee aluminium platen bevat die elektrische contact maken met het Nucleofector-apparaat. Dit apparaat levert een reeks snelle elektrische pulsen, waarvan het aantal en de duur zijn aangepast op het celtype. Na nucleofectie kunnen de cellen worden verdund in kweekmedium en worden geplaat voor verdere groei.
Alternatief, de gene gun-techniek schiet door transfectiebarrières heen, door kogels met genetisch materiaal door zowel cel- als kernmembranen te schieten.
Om gene gun-kogels te maken, wordt DNA dat uw gen van belang codeert, geprecipiteerd op micron-schaalbeadles, meestal samengesteld uit goud. Na een incubatie van 10 minuten worden de beadles gewassen en overgebracht in behuizing. De behuizing wordt vervolgens geroteerd terwijl de oplossing droogt, wat resulteert in een uniforme coating van beadles. Vervolgens wordt de behuizing in cartridges gesneden en in de pistool geplaatst. Gas-aangedreven levering van de genetische lading kan worden uitgevoerd op cellen die groeien in standaard kweekplaten door eenvoudig het trekker te trekken.
Ten slotte maakt virale transductie gebruik van de virale levenscyclus om vreemd genetisch materiaal in de kern te brengen. RNA dat codeert voor het gen van belang wordt verpakt in gemodificeerde retrovirussen, bekend als lentivirale vectoren, die toegang krijgen tot doelcellen door te binden aan specifieke membraaneiwitten, wat een membraanfusie-gebeurtenis triggert. Het virale RNA wordt vervolgens omgekeerd getranskribeerd in een complementair DNA-streng die in de kern wordt getransporteerd.
Voordat u met deze procedure begint, moet u weten dat virussen zowel de cellen in uw lichaam als de cellen in uw schaal kunnen infecteren, dus het volgen van veiligheidsrichtlijnen is uiterst belangrijk.
De eerste stap is het genereren van de lentivirale deeltjes die uw gen van belang dragen. Dit wordt bereikt door de bouwstenen van het virus tot expressie te brengen in een humane cellijn die is geoptimaliseerd voor virale productie, zoals 293T-cellen. Om de onnodige verspreiding van gemanipuleerde virussen te voorkomen, worden de genen die nodig zijn voor hun samenstelling gescheiden gehouden van de transfervector, waarvan de sequentie in het besmettelijke deeltje zal worden opgenomen.
Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de volledig geassembleerde virussen worden vrijgelaten in het kweekmedium, waar ze kunnen worden verzameld en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Vervolgens wordt de juiste concentratie, of titer, van het virus bepaald door de transductiesucces te beoordelen in een testcellijn. De lentivirale vector wordt vervolgens toegevoegd aan de doelneuronencultuur en meestal gedurende 24 tot 48 uur geïncubeerd om ervoor te zorgen dat infectie heeft plaatsgevonden.
Nu u bekend bent met de gebruikelijke transfectietechnieken, zal degene die u gebruikt afhangen van de specifieke doelen van uw experimenten. Laten we enkele voorbeelden bekijken.
Om te beginnen, het observeren van de rijping van neuronen in cultuur maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van de morfologische veranderingen die belangrijk zijn voor neuronale connectiviteit, zoals de vorming van dendritische stekels. Om de celmorfologie in de tijd te visualiseren, maakten deze onderzoekers gebruik van nucleofectie om een fluorescerend eiwit in gekweekte neuronen te leveren. Hier werd een fluorescent-gelabeld tubuline-eiwit in een subset van cellen getransfecteerd, wat gedetailleerde analyses van celprocessen mogelijk maakte via fluorescentiemicroscopie. Omdat de expressieniveaus gedurende de levensduur van de neuronen werden gehandhaafd, kon morfologische analyse gedurende ten minste een maand in cultuur worden uitgevoerd.
Transfectie kan ook worden gebruikt om de impact van specifieke genetische mutaties op neuronfunctie te testen. Een gene gun kan worden gebruikt om DNA te leveren dat codeert voor wilde type of mutante versies van een eiwit, en kortetermijneffecten op de cellulaire biologie kunnen worden beoordeeld, bijvoorbeeld door patch clamp-opname van neuronontlading.
Ten slotte is een veelgebruikte strategie om
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why do neurons require specialized transfection techniques compared to other mammalian cells?
Most cultured neurons are post-mitotic, or non-dividing cells, unlike rapidly dividing cells where the nuclear envelope breaks down during mitosis to incorporate transfected DNA. This unique property of mature neurons necessitates specialized protocols that can directly deliver genetic material across both cell and nuclear membranes without relying on cell division to facilitate DNA entry into the nucleus.
Q2: How does nucleofection enable genetic material to cross neuronal cell membranes?
Nucleofection combines an induced electrical field with chemical reagents to create transient pore-like structures in both cell and nuclear membranes. Since nucleotides are charged, the electric field drives DNA movement through these pores. Neurons are collected in a pellet, resuspended in commercial nucleofection reagent, mixed with purified DNA, and transferred to an electroporation cuvette where rapid electrical pulses are delivered.
Q3: What is the process for preparing gene gun bullets for biolistic transfection?
DNA encoding the gene of interest is precipitated onto micron-scale gold beads and incubated for 10 minutes. The beads are then washed and transferred into tubing that is rotated as the solution dries, creating a uniform coating. The tubing is cut into cartridges and loaded into the gene gun for gas-powered delivery through cell and nuclear membranes.
Q4: How do lentiviral vectors deliver genetic material into neuronal nuclei?
Lentiviral vectors are modified retroviruses that gain entry into target cells by binding to specific membrane proteins, triggering membrane fusion. The viral RNA is reverse transcribed into complementary DNA and transported into the nucleus. Lentiviral particles are generated by expressing viral building blocks in optimized cell lines like 293T cells, then collected and concentrated by ultracentrifugation before adding to target neuronal cultures.
Q5: How can transfection be used to visualize neuronal morphology changes in culture?
Researchers use nucleofection to deliver fluorescent proteins, such as fluorescently-tagged tubulin, into cultured neurons. This allows detailed analysis of morphological changes important for neuronal connectivity, like dendritic spine formation. Because expression levels are maintained throughout the neuron's lifetime, morphological analysis via fluorescence microscopy can be performed for extended periods, such as at least one month in culture.
Q6: What are the advantages of using lentiviral vectors for gene silencing studies in neurons?
Lentiviral vectors can deliver silencing RNA constructs that prevent protein synthesis, allowing researchers to observe cellular effects when gene expression is blocked. This approach is particularly useful for functional studies, such as knockdown of genes associated with Parkinson's disease, which can reveal impacts on cell viability and other cellular processes relevant to an introduction to cellular and molecular neuroscience research.
Q7: How can gene gun transfection be used to assess the impact of genetic mutations on neuronal function?
A gene gun delivers DNA encoding wild-type or mutant versions of a protein into neurons, enabling short-term assessment of cellular effects. Researchers can evaluate impacts on neuronal function using techniques like patch clamp electrophysiology principle applications to measure changes in neuron firing patterns and other electrophysiological properties resulting from the mutation.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:49
Principles of Transfection
1:57
Nucleofection
3:07
Gene Gun Transfection
4:03
Viral Transduction
5:53
Applications
7:40
Summary
Videos from this collection: