Automatiseren van ChIP-seq Experimenten om Genereer Epigenetische Profielen op 10.000 HeLa-cellen
10 december 2014
Methoden voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties worden cruciaal voor elk aspect van genomisch onderzoek, maar ze zijn arbeidsintensief, duur en tijdrovend. Hier wordt een commercieel verkrijgbaar robotsysteem voor vloeistofbehartiging gepresenteerd dat chromatine-immunoprecipitatie automatiseert voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties met beperkte hoeveelheden cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om onderzoekers een geautomatiseerd platform te bieden dat in staat is om chromatine immunoprecipitatie-experimenten uit te voeren op slechts 10.000 cellen. Dit wordt bereikt door eerst hoogwaardig gesneden chromatine voor te bereiden voor de chromatine immunoprecipitatie. In de tweede stap wordt een geautomatiseerd chromatine immunoprecipitatie-experiment gemaakt en worden geautomatiseerde bibliotheken uitgevoerd met het immunoprecipiteerd DNA.
Het immunoprecipiteerd DNA wordt geanalyseerd door kwantitatieve PCR en next-generation sequencing. Uiteindelijk kan het succes van de geautomatiseerde technologie worden gevalideerd door de vergelijking van de chromatine immunoprecipitatiesequentieprofielen die zijn gegenereerd op het oorspronkelijke monster van 10.000 cellen met experimenten die zijn uitgevoerd op 100.000 cellen en bestaande datasets voor referentie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het epigenetisch veld te beantwoorden om ons begrip van de functies van specifieke biomarkers in verschillende weefsels te verbeteren.
Stadia van ontwikkeling en ziektetoestanden. Deze techniek heeft implicaties voor de diagnose van meerdere ziekten, omdat het zal helpen bij het identificeren van epigenetische biomarkers in gezondheid en ziekte, nauwkeurig en betrouwbaar. Automatische technologieën zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoekers in de epigenetische analyse van specifieke celtypen, subpopulaties en biopten.
Voor een standaard geautomatiseerd chromatine immunoprecipitatie-experiment begint u door 120 microliter chromatine immunoprecipitatiebuffer H toe te voegen aan 100 microliter gesneden chromatine van één tot 2 miljoen cellen, waarbij twee tot 20 microliter chromatine wordt gereserveerd voor het inputmonster. Selecteer vervolgens protocollen op de IP star compact en klik op het chromatine immunoprecipitatie-pictogram. Kies de chromatine immunoprecipitatie directe methode en kies vervolgens in het volgende scherm de chromatine immunoprecipitatie 200 microliter-protocol en specificeer het monsternummer.
Stel de chromatine immunoprecipitatie-experimentele parameters in op vier uur voor het bekleden van antilichamen. Stap 15 uur voor de immunoprecipitatiefase en vijf minuten voor elke wasstap. Stel vervolgens de reagentia in volgens de instructies die op het lay-outinformatiescherm worden weergegeven en voeg de juiste reagentia en hoog gevalideerde ChIP-seq-kwaliteitsantilichamen toe.
Voeg vervolgens 20 microliter proteïne, A gecoate magnetische kralen toe voor elke reactie en de chromatinemonsters nadat het overnachtse chipprotocol en de omgekeerde cross-linking voorbij zijn. Zuiver het DNA met een op magnetische kralen gebaseerd DNA-zuiveringskit. Gebruik een zeer gevoelige commerciële fluorometrische assay om het immunoprecipiteerd DNA te kwantificeren.
Gebruik vervolgens primers voor ten minste één positieve en één negatieve controle genomische regio. Analyseer de kwaliteit van het immunoprecipiteerd DNA door kwantitatieve PCR volgens de geschikte parameters van de materialen voor de analyse. De resultaten worden uitgedrukt als het percentage van de herstel van de input voor de volgende generatie sequencing onder protocollen.
Klik vervolgens op het bibliotheekvoorbereidingspictogram, kies vervolgens de voorkeursbibliotheekvoorbereidingstechnologie en stel de reagentia in volgens de instructies op het lay-outinformatiescherm. In dit experiment werden bijvoorbeeld sequencingprofielen gegenereerd voor zes verschillende histonmodificaties die geassocieerd zijn met genexpressie. De hoge piekcorrelatie die tussen deze histonmarkers werd waargenomen, duidt op het vermogen van het geautomatiseerde systeem om nauwkeurige en betrouwbare gegevens te genereren.
Bovendien tonen deze grafieken de verdeling van de pieken voor de verschillende histonmodificaties op specifieke genomische regio's. Ten slotte, voor een geautomatiseerd chromatine immunoprecipitatie-experiment voor monsters met een laag aantal cellen, stelt u het geautomatiseerde chromatine immunoprecipitatie 200 microliter-protocol in op het automatiseringssysteem zoals zojuist is gedemonstreerd. Laad vervolgens het systeem met de ChIP-seq, kwaliteitsantilichamen en reagentia geoptimaliseerd om te werken op chromatinehoeveelheden tussen 10.000 en 100.000 cellen met slechts 10 microliter proteïne, A gecoate magnetische kralen voor elke reactie.
Na het chip, voert u de bibliotheekvoorbereiding uit, selecteert u het micro plex-bibliotheekvoorbereidingsprotocol en stelt u de reagentia in volgens de instructies die op het lay-outinformatiescherm worden weergegeven. In deze representatieve kwantitatieve PCR van een chromatine immunoprecipitatie van een 10.000 cellen startmonster, werden significante verrijkingen met de anti-histonantilichamen in de positieve controle regio's en verwaarloosbare signalen in de negatieve controle regio's waargenomen. Hier wordt een reeks van 10 immunoprecipitatiereacties getoond die reproduceerbaar en zeer vergelijkbaar zijn met een handmatig chromatine immunoprecipitatie-experiment, wat de mogelijkheid van het geautomatiseerde systeem aantoont om met een laag aantal cellen te werken zonder zichtbare toename van experiment-tot-experiment variabiliteit in vergelijking met handmatige immunoprecipitatie.
Deze gegevens illustreren de bio-informaticaanalyses van de sequentiebibliotheken van 10.000 en 100.000. Het betreft S3-cellen na chromatine immunoprecipitatie, die uitstekende resultaten tonen van de chromatine immunoprecipitatiemonsters met een laag aantal cellen. Deze dataset, die overeenkomt met het experiment met 10.000 cellen van startmateriaal, bevat een lage achtergrondruis met zeer betrouwbare verrijkingspieken die worden bevestigd door zowel de dataset van 100.000 cellen als de Broad Institute-referentiedataset.
Voor het encode-project is het belangrijk op te merken dat de 10.000 cellen-gegevens bijna identieke pieken demonstreren met de Broad Institute-gegevens met een 98% overlapratio van de beste 40% van de pieken gerangschikt op de betekenisvolle score zoals gebruikt in het end code-project. Het IP star geautomatiseerde systeem vereist minimale operatorinterventie en vermindert de HandsOn-tijd van de chromatine immunoprecipitatie tot slechts één tot twee uur. Bovendien vervangt het geautomatiseerde proces de talrijke foutgevoelige stappen van de handmatige chromatine immunoprecipitatie en levert het zeer consistente resultaten.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat een goede chromatine immunoprecipitatie
Overzicht
Dit artikel presenteert een geautomatiseerd platform voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) dat efficiënt lage celaantallen kan verwerken, specifiek 10.000 cellen. De methode is erop gericht de mapping van eiwit-DNA-interacties te stroomlijnen, wat essentieel is voor genomisch onderzoek.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Genomica
- Epigenetica
- Geautomatiseerde laboratoriumtechnieken
Achtergrond
- Interacties tussen eiwitten en DNA zijn cruciaal voor het begrijpen van genregulatie.
- Traditionele ChIP-methoden zijn arbeidsintensief en vereisen een groot aantal cellen.
- Automatisering kan de efficiëntie en reproduceerbaarheid van genomische experimenten verbeteren.
- Deze studie richt zich op een robotisch systeem dat handmatige interventie minimaliseert.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een geautomatiseerde ChIP-methode voor lage celaantallen.
- Het valideren van de effectiviteit van het geautomatiseerde systeem ten opzichte van traditionele methoden.
- Het faciliteren van de identificatie van epigenetische biomarkers bij gezondheid en ziekte.
Gebruikte methoden
- Bereiding van hoogwaardig gesheard chromatine uit 10.000 cellen.
- Automatisering van het ChIP-proces met behulp van een robotisch vloeistofbehandelsysteem.
- Analyse van immunoprecipiteerd DNA via kwantitatieve PCR en next-generation sequencing.
- Vergelijking van resultaten met gegevens van grotere celmonsters en bestaande datasets.
Belangrijkste resultaten
- Het geautomatiseerde systeem leverde betrouwbare en reproduceerbare resultaten die vergelijkbaar waren met handmatige methoden.
- Een significante verrijking van histonmodificaties werd waargenomen in positieve controleregio's.
- Een hoge correlatie met referentiedatasets wees op de nauwkeurigheid van de geautomatiseerde benadering.
- Minimale interventie door de operator verminderde de actieve werktijd aanzienlijk.
Conclusies
- De geautomatiseerde ChIP-methode is effectief voor lage celaantallen.
- Deze technologie kan epigenetisch onderzoek en de ontdekking van biomarkers bevorderen.
- Automatisering verbetert de consistentie en betrouwbaarheid van genomische analyses.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het automatiseren van ChIP-seq voor lage celconcentraties pakt een kritieke bottleneck aan bij de validatie van epigenetische targets, waardoor mechanistische risicoreductie van hypothesen mogelijk wordt met behulp van schaarse primaire of zeldzame celpopulaties. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellend vertrouwen in vroege discovery door reproduceerbare epigenomische profielen te genereren uit beperkte monsters, wat de triage van portfolio's en besluitvorming op basis van biomarkers ondersteunt. De technologie positioneert epigenomische assays als schaalbare, herbruikbare discovery-tools die aansluiten bij de translationele continuïteit van target-ID tot preklinische validatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen en het verduidelijken van signaalpaden mogelijk door middel van histonmodificatie-profilering vanuit monsters met een lage input.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie en functionele targetvalidatie door reproduceerbare ChIP-seq-data te genereren uit 10.000 cellen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage via betrouwbare epigenomische read-outs die correleren met referentiedatasets en handmatige benchmarks.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van gestandaardiseerde, automatiseerbare ChIP-seq-workflows.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs aan via automatisering op basis van magnetische beads en qPCR/NGS-uitlezingen.
- Schaalbaarheid: Benadrukt de gereedheid voor screening en het hergebruik van het platform door vermindering van de handmatige tijd en minimale interventie door de operator.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten via de identificatie van epigenetische biomarkers in gezonde en zieke toestanden met behulp van low-cell ChIP-seq.
- Preklinische afstemming: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente epigenomische profilering over verschillende steekproefgroottes mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt beslissingen via reproduceerbare data met een lage achtergrondruis, bevestigd aan de hand van datasets van 100.000 cellen en referentiedatasets.
Integratie van Pipeline & Workflow
De geautomatiseerde ChIP-seq-methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, waardoor epigenomische profilering in vroege stadia met beperkte hoeveelheden materiaal mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door histonmodificatieprofielen te genereren vanuit lage celhoeveelheden.
- Screening: Waarborgt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via geautomatiseerde bibliotheekpreparatie en kwantitatieve DNA-terugwinningsmetrieken.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen via qPCR (% input recovery) en NGS-piekcorrelatie voor conditievergelijking.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via biomarker-gealigneerde epigenomische profielen gevalideerd tegen orthogonale datasets.
- Enterprise Hergebruik: Positioneert het robotplatform als een herbruikbare capaciteit voor epigenetische assays over verschillende projecten heen, waardoor redundantie wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar epigenetische mechanismen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bereikt door geautomatiseerde vloeistofbehandeling en geminimaliseerde handmatige stappen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium via betrouwbare epigenomische data met een lage input.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling, ondersteund door reproduceerbare, referentie-gecorreleerde ChIP-seq-resultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chromatinepreparatie, antilichaamvalidatie en het bedienen van geautomatiseerde vloeistofhandelingssystemen.
- Vereist instrumentatie, waaronder een robotplatform (bijv. IP-Star Compact), magnetische bead-handling en een qPCR/NGS-analyse-infrastructuur.
- Vereist cross-team standaardisatie van antilichaamselectie, chromatineshearing en protocolparameters voor reproduceerbaarheid.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het opschalen van 10.000 naar 100.000 cellen of bij toepassing op primaire biopten en subpopulaties.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van specifieke antilichamen van hoge kwaliteit en optimale chromatineshearing voor succes bij lage input.
