Name: Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer hoe u een zebravis-model van polycystische nierziekte maakt door wnt5a knockdown met morpholino-injectie in Tg(wt1b:GFP) embryo's. Fluorescentiemicroscopie toont niercystevorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH (DK093625 aan LH en DK069909 en DK047757 naar JHL) en de VA (Merit Award I01BX000820 aan JHL). We willen graag Dr Michael Pack en Dr. Jie Hij dankt aan de Universiteit van Pennsylvania zebravis Core voor het verstrekken van essentiële ondersteuning.

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Eastern Virginia Medical School. 1. Morfolino Voorbereiding <ol><li> Ontwerp en synthetiseren translatie-blokkering (, bijgedragen) en splice-remmende (Splice-) antisense morfolino (MO) oligonucleotiden voor het gen van belang volgens instructies van de fabrikant (Figuur 1A). Zie informatie van de fabrikant in tabel 1. OPMERKING: MO&#39;s worden geleverd als gevriesdroogde aandelen in glazen flessen. </li><li> Voeg hoogwaardige steriel water om de glazen flessen te resuspenderen MO tot een eindconcentratie van 25 ug / ul. Zorg ervoor dat de oligonucleotide volledig is opgelost. Als sommige solide overblijfselen, verwarm de flacon met de voorraad oligonucleotide oplossing bij 65 ° C gedurende 5 tot 10 min en vortex kort. </li><li> Bewaar de MO voorraad oplossing bij RT. Bewaar ze niet bij 4 ° C of -20 °; C omdat lagere temperaturen kunnen leiden MO oligonucleotide bindt aan de houderwand. Meet de concentratie van de stockoplossing met behulp van een spectrofotometer (zie tabel 1) elke keer een nieuwe MO-stamoplossing wordt bereid. </li><li> Bereid de MO werkoplossing op de dag van de injectie door verdunning van de voorraadoplossing met hoogwaardige steriel water om de gewenste dosis. Voeg 0,5% fenolrood tot een concentratie van 0,05% te bereiken. Om bijvoorbeeld 5 ui werkoplossing met een concentratie van 15 ng / nL, voegt 3 ul MO voorraadoplossing en 0,5 pi 0,5% fenolrood 1,5 ui water. OPMERKING: Met deze werkconcentratie, elke druppel (500 pl) van injectie bevat 7,5 ng MO en twee druppels bevatten 15 ng MO. </li></ol> 2. Bereiding van de injectie-inrichting <ol><li> Aankoop glas pre-getrokken naalden (zie tabel 1 voor nadere informatie). Als alternatief, trek de glazen injectienaald with een naald trekker. </li><li> Schakel de luchtcompressor en stel de druk instellen op 50 psi. Zet de dissectiemicroscoop lichtbron en Pico micro-injectie pomp en de instellingen als volgt aan te passen: houd de druk 20 psi, uitwerpen druk 10 psi, periode waarde van 2,5 en 100 usee scala van gating. </li><li> Laad het glas vooraf getrokken naald met 5 pl van de injectie-oplossing en plaats de naald in een verticale positie met de punt naar beneden gericht. Wacht tot alle de oplossing van de naald, zonder zichtbare luchtbellen bereikt. Plaats de naald houder in een geschikte positie naast de microscoop en steek de glazen naald in de houder. Pas de injectiehoek tot 45 graden. </li><li> Breng de naald in beeld onder de microscoop, hoog boven het podium, en zich richten op het dunste deel van de tip. Breek de naaldtip met fijne punt pincet. </li><li> Plaats een liniaal en een capillaire buis met inwendige diameter van 0,15 mm naast elkaar onder de microscoop;de injectie in een uiteinde van de capillaire buis een vloeistofkolom maken. Pas de eject tijd om elke 17 druppels per 1 mm lengte van de kolom vloeistof te bereiken, dan is het volume van elke druppel is 1 nl (druppel volume = π x straal van 2 x lengte (van vloeistof kolom) / count (druppels). OPMERKING: Een druppel met een diameter van 0,1 mm geeft een injectievolume van 500 pl (druppelvolume = 4/3 x π x straal 3). </li></ol> 3. Voorbereiding van bevruchte zebravis embryo&#39;s en Injectie met Morpholinos <ol><li> Het opzetten van Tg (wt1b: GFP) transgene zebravis broedparen volgens gepubliceerde protocollen voor standaard zebravis veeteelt en onderhoud. Verzamel embryo&#39;s na natuurlijke paaien, en bewaar ze in een 10 cm petrischaal gevuld met E3 water (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Start MO injectie meteen 13. Monitor embryomorfologie onder de microscoop en zorg ervoor MO injectie is op de een-cel stadium, of uiterlijk op de vier-cel stadium. <ol><li> Breng de embryo&#39;s een 10 cm petrischaal met wigvormige agar troggen. Zuig het extra E3 water en druk de embryo&#39;s in de troggen. </li><li> Manipuleren van de embryo&#39;s met de micropipet 1-cellig stadium embryo zichtbaar onder de stereomicroscoop. Doordringen in de chorion en de dooier één of twee druppels MO injecteren in de dooier (1 druppel = 500 pl). Breng de geïnjecteerde embryo&#39;s een 10 cm petrischaal met E3 water en incubeer bij 28.5 ° C. </li></ol></li><li> Na de injecties, verwijder de dode embryo&#39;s en noteer het aantal geïnjecteerde embryo&#39;s. Vervang het E3 water in de schaal elke 24 tot 48 uur. </li></ol> 4. Fenotype Rescue Experimenten <ol><li> Selecteer een ortholoog van een andere soort die een verschillende primaire basenparen structuur (meestal 3-7 basepaar mismatches) heeft en derhalve bestand tegen de MO voor redding. Bijvoorbeeld, in dit experiment kozen wemuis omdat de muis Wnt5a mRNA sequentie verschilt van de sequentie zebravis. </li><li> Ontwerp een primerset met de voorwaartse primer vanaf het translationele plaats en de reverse primer op bijna het einde van het mRNA coderend gebied. Voeg een T7 promoter sequentie aan het 5&#39;-uiteinde van de voorwaartse primer sequentie. In dit experiment gebruikten we de volgende primer sequenties; vooruit: 5&#39;-taa tac gac tca cta tag GGA cta tga TGC TGC tga agc tga a- 3 &#39;en achteruit: 5&#39;-tca CTT gca gac gta CTG gtc- 3&#39;. </li><li> Voer een 50 pl Polymerase Chain Reaction (PCR) met het primerpaar (0,5 uM van elke primer) hierboven ontworpen en 0,1 ug template DNA dat het muizen Wnt5a cDNA-sequentie met de volgende PCR-programma: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 5 min; 35 cycli van 95 ° C (30 sec) 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); en laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min. </li><li> Na het afronden van tHij cyclus, lopen 2 pl van het PCR-product op 1% agarosegel om ervoor te zorgen dat de band is de juiste maat. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Controleer DNA-concentratie met een spectrofotometer. Bewaar het gezuiverde PCR-product bij -20 ° C of direct gebruiken afgetopte RNA transcriptie in de volgende stap. </li><li> In vitro te synthetiseren afgedekt mRNA met een afgetopte RNA synthese kit volgens de instructies van de fabrikant. Verdun het mRNA in 20 ul RNase vrij water en het bepalen van de concentratie. Aliquot de RNA en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Op de dag van injectie, bereid een werkoplossing van het mRNA door RNase vrij steriel water. Merk op dat 40 pg is gewoonlijk de hoogste RNA dosis waarbij niet-specifieke of toxische effecten van het RNA niet optreden. Houd de werkende oplossing op ijs. Injecteer de embryo met MO en vervolgens de redding mRNA, of co-injecteren beide samen. Als bijvoorbeeld de concentratie van het mRNA VOORBEREIDINGed in stap 4.5 0.6 ug / ul, voeg 0,67 pl mRNA (0,4 ug) 4,33 gl RNase vrij water tot een eindconcentratie van 0,08 ug / ul maken dan één druppel (500 pl) van elke injectie bevat 40 pg van mRNA. MO Bereid zoals beschreven in stap 3. </li></ol> 5. Voorbereiding van de geïnjecteerde embryo&#39;s voor TL-Imaging <ol><li> Na incubatie bij 28.5 ° CO / N, voeg 0.003% N-fenylthioureum (PTU) het E3 water melanisatie, die observatie van pronephros structuur middels fluorescentiemicroscopie beïnvloedt voorkomen. Echter niet PTU toevoegen voordat gastrulatie, omdat het van invloed vroege embryonale ontwikkeling. </li><li> Op 48 HPF, handmatig dechorionate de embryo&#39;s met fijne pincet. Neem foto&#39;s van 48 en 72 HPF embryo&#39;s onder een lichte dissectie microscoop. LET OP: Deze foto&#39;s kunnen worden genomen zonder verdoving. </li><li> Ongeveer 10 min voor beeldvorming onder de fluorescentiemicroscoop, verdoven de embryo door ze in10 cm petrischaal die 160 ug / ml gebufferd tricaïne. Wacht 5-10 minuten, en dan licht raken de zebravis te bevestigen dat ze niet kunnen bewegen en dus de verdoving werkt. </li><li> Nadat de embryo&#39;s worden verdoofd, monteer ze in 3% methylcellulose en oriënteren ze in een buikligging onder een stereomicroscoop (zie tabel 1). </li><li> Let op de pronephros structuur onder een fluorescentie microscoop (zie tabel 1) en foto&#39;s op verschillende vergrotingen (10X en 20X) nemen. </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li>
<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Polycystische nierziekte (PKD) is een van de belangrijkste oorzaken van eindstadium nierziekte bij de mens en wordt gekenmerkt door progressieve cyste vorming, nier- uitbreiding, en abnormale tubulus ontwikkeling 14. Autosomaal dominant PKD (ADPKD) is een genetische ziekte waarbij mutatie van hetzij PKD1, codeert polycystine-1 (PC1) of PKD2, codeert polycystine-2 (PC2), resultaten in polycysteuze nieren. Vele andere genen, vooral die coderen voor eiwitten in de primaire cilium, wordt gedacht betrokken te zijn...

Zebravis (Danio rerio) embryo&#39;s zijn op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen van de ontwikkeling van de nieren en polycysteuze nierziekte. Er zijn vele voordelen aan het gebruik zebravis als diermodel: de haalbaarheid van het bestuderen van genetische interacties, het vermogen om antisense morfolino (MO) gebruikt voor proteïne knockdown, de mogelijkheid om snel assay grote aantallen embryo&#39;s, en het kijkgemak orgaan fenotypes levende larven 1. De pronephros is de eerste nier te ontwikkelen in vertebraten en functioneel is in larvale zebravis 2. De structuur van de zebravis pronephros relatief eenvoudig in vergelijking met de zoogdier metanefros, de derde en laatste nier ontwikkelen bij zoogdieren. De nefron is de werkeenheid van de nier, waarbij elke humane nier die tussen 500,000-1,000,000 nefronen 3,4 en elke muis nier met ongeveer 13.000 nefronen 5, waardoor het moeilijk om één nefron structuur waarnemen in mens of muis nieren. De zebravis heeft slechts twee nefronen, en elke zebravis nefron bevat alle belangrijke componenten in de glomerulus en buisjes van muizen en mensen 6 en soortgelijke gespecialiseerde renale celtypen. Vergeleken met andere gewervelde modellen zoals Xenopus, zebravis het nefron meer lijkt het zoogdier nefron omdat het een gesloten systeem 7. De laatste jaren heeft de zebravis genoom sequentie is bepaald, waardoor de brede invoering van genetische hulpmiddelen, uitgebreide mutant middelen en verzamelingen van transgene reporter lijnen zebravismodellen. De zebravis pronephros vormt tussen 12-72 uur na bevruchting (HPF) en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de transparante embryo. De Wilm&#39;s tumor WT1 eiwit is een essentiële factor voor de ontwikkeling van de nieren. Transgene zebravis lijnen expressie groen fluorescent proteïne (GFP) onder de controle van de promoter wt1b Tg (wt1b: GFP) tonen GFP Expression specifiek gelegen in pronephric regio&#39;s in de zebravis embryo&#39;s, vanaf 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), een autosomaal recessieve cystische nierziekte, veroorzaakt door mutaties van genen NPHP 9. NPHP4 knockdown door morfolinogroep veroorzaakt vorming van cysten in de Tg (wt1b: GFP). Vis 10 Daarom is deze transgene vis is een geschikt model voor het observeren van de nieren structuren en cyste vorming tijdens de ontwikkeling nier. Belangrijk is, kan de invloed van modulatoren van nierontwikkeling bestudeerd door deze stam in tijd en arbeid efficiënte wijze. Onze paper beschrijft het gebruik van Tg (wt1b: GFP) vis als een model om de nieren cyste vorming visualiseren na genmodulatie. We gebruikten start- en splice-terrein anti-sense MO&#39;s af te breken de Wnt5a gen in de zebravis. Wnt5a is een niet-canonieke uitgescheiden glycoproteïne van de familie Wnt die een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van verschillende organen en postnatale cellulairefunctie 11. Wnt5a werkt door Wnt banen, waaronder de vlakke cel polariteit (PCP) route, die is gevonden om een ​​rol georiënteerde celdeling spelen tijdens renale tubulaire rek. Wnt5a regelt de Wnt / PCP reactieweg door een complex te vormen met de receptor, zoals tyrosine kinase (Ryk), die verder overbrengt Wnt5a signalering door vorming van een complex met de VANGL vlakke cel polariteit eiwit 2 (Vangl2), waardoor Vangl2 stabiliteit 12 bevorderen. Defecten in het PCP traject kan resulteren in willekeurige celdeling en veroorzaken niercyste formatie. We gebruikten de Tg (wt1b: GFP) zebravis lijn naar de nieren cyste vorming observeren volgende Wnt5a knockdown. De Tg (wt1b: GFP) zebravis model maakt live beeldvorming en tijdige waarneming van nier structuur. Na Wnt5a knock-down, werd niercyste formatie gevonden beginnend bij 24 hpf; 72 HPF cysten kan worden gevonden in de glomeruli en de proximale tubuli. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om screen andere genen die de nieren cyste vorming kunnen veroorzaken.

<table><tbody><tr><td>0.5% Fenol-Red</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Kleurindicator voor injectie</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td><td>(aangepast)</td><td>Aangepast ontworpen voor het gen van belang</td></tr><tr><td>Voorgetrokken naald</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>Als een grote hoeveelheid naalden vereist is, kunt u ook een naaldtrekker kopen en de naald in het lab bereiden</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Voor in vitro transcriptie om bekapt mRNA te maken voor reddingsexperiment</td></tr><tr><td>N-Fenyltiyoureum</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Voor preventie van melanisering</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Ook wel ethyl 3-aminobenzoaat genoemd, voor narcose bij zebravissen</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Voor positie van zebravis</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Voor zuivering van PCR-product voor cap RNA-synthese.</td></tr><tr><td>dNTP-mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>Voor PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>Voor PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Voor het meten van morpholino- en RNA-concentratie</td></tr><tr><td>Luchtcompressor</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Luchtbron voor injectie</td></tr><tr><td>Pico micro-injectiepomp</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pneumatische PicoPump</td><td>Andere soorten micro-injectiesystemen kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Micro-manipulator</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Rechterhand (MMJL voor linkshandigen)</td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Om de naald vast te houden voor micromanipulatie</td></tr><tr><td>Dumont-pincet</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11253-20</td><td>Om de naaldtip af te breken</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica M205C</td><td></td><td>Voor het observeren en beelden van zebravis-embryo's</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss Axio Observer D1m</td><td></td><td>Voor beeldvorming van zebravis-pronephros</td></tr><tr><td>Capillaire buis (ID 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Voor het meten van het volume van elke geïnjecteerde druppel</td></tr></tbody></table>

een mogelijke zebravis model van pkd: knockdown van wnt5a oorzaken cysten in zebravis nieren

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystische nierziekte (PKD) is een van de meest voorkomende oorzaken van eindstadium nierziekte, een verwoestende ziekte waarvoor er geen geneesmiddel is. De moleculaire mechanismen die leiden tot cystevorming in PKD blijven enigszins onduidelijk, maar er worden veel genen verondersteld te zijn betrokken. Wnt5a is een non-canoniek glycoproteïne dat een breed scala aan ontwikkelingsprocessen reguleert. Wnt5a werkt via de planaire celpolariteit (PCP) route die georiënteerde celdeling reguleert tijdens verlenging van renale tubulaire cellen. Defecten van de PCP-route zijn gevonden als oorzaak van cystevorming in de nier. Ons artikel beschrijft een methode voor het ontwikkelen van een zebravis model voor cystische nierziekte door knockdown van het wnt5a gen met wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotiden. Tg(wt1b:GFP) transgene zebravissen werden gebruikt om de nierstructuur en niercysten te visualiseren na wnt5a knockdown. Twee verschillende antisense MO's (AUG - en splice-site) werden gebruikt en beide resulteerden in een gekrulde staart naar beneden fenotype en cystevorming na wnt5a knockdown. Injectie van muis Wnt5a mRNA, resistent tegen de MO's vanwege een verschil in primaire basenpaar structuur, redde het abnormale fenotype, wat aantoont dat het fenotype niet te wijten was aan “off-target” effecten van de morpholino. Dit werk ondersteunt de geldigheid van het gebruik van een zebravis model om wnt5a functie in de nier te bestuderen.

Wnt5a knock down werd bereikt door de invoering vertaling blokkeren MO (augustus-MO) of exon / intron grens splice MO (splice-MO) bij de zebravis embryo&#39;s in de ene cel podium. De augustus-MO richt het startcodon en derhalve remt zowel moeder en zygote Wnt5a boodschap. De splice-MO richt de derde splitsingdonorplaats en remt alleen de zygote transcript van Wnt5a (figuur 1A). De, bijgedragen en splice- morphants phenocopied elkaar met meerdere gebreken, waaronder krullende staart na...

We beschrijven een methode om een mogelijk zebravismodel van polycystische nierziekte te genereren. We gebruikten Tg(wt1b:GFP) vissen om de nierstructuur te visualiseren. Knockdown van wnt5a gebeurde door middel van een morpholino-injectie. Pronefrische cystevorming na wnt5a knockdown werd waargenomen in deze GFP-transgene zebravis.

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een mogelijk zebravismodel van polycystische nierziekte te genereren. Dit wordt bereikt door morph te injecteren tegen Wind vijf A in transgene WT een BGFP zebravis embryo's in het eencellig stadium. Vervolgens wordt een reddingsexperiment uitgevoerd door micro-injectie van muis Wint vijf A Mr.Nna, met de Wint vijf a morpho.Vervolgens worden de geïnjecteerde embryo's verdoofd en ingebed op 48 en 72 uur na bevruchting om de nierstructuur en cystevorming te monitoren. Na wind vijf A knockdown, laten de resultaten zien dat wind vijf A knockdown niercystevorming veroorzaakt in transgene WT een BG FP zebravis op basis van fluorescentiemicroscopie van prone nierstructuren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het opbouwen van een model vancy nierziekte omdat de transparantie van de vis embol bedekt met het gebruik van nierspecifiek Fluor-eiwit transgene toelaat een directe weergave van nierstructuren in een AL-organisme.Deze methode kan inzicht geven in win vijf a knockdown dat zorgt voor cystevorming in de nier van de zebravis. Het kan ook worden toegepast om veel andere genen te testen die worden vermoed niercystevorming te veroorzaken. Dit protocol is eenvoudig en neemt minder tijd in beslag.Na het ontwerpen en synthetiseren van morpho's volgens de instructies van de fabrikant, voeg hoogwaardig steriel water toe aan de glazen flessen om volledig te resuspenderen tot een eindconcentratie van 25 microgram per microliter. Gebruik een spectrofotometer om de concentratie te meten en bewaar de stockoplossing bij kamertemperatuur op de dag van de injectie, gebruik hoogwaardig steriel water om de morpho's te verdunnen tot de gewenste concentratie, en bij 0,5% fenol rood tot een eindconcentratie van 0,05%. Zet vervolgens de luchtcompressor aan en pas de drukinstelling aan op 50 si. Schakel vervolgens de lichtbron van de dissectiemicroscoop en de pico micro-injectiepomp in en pas de instellingen als volgt aan.Gebruik vijf microliters injectieoplossing om een vooraf getrokken glazen naald te laden en plaats de naald in een verticale positie met een punt naar beneden wanneer er geen zichtbare luchtbellen zijn, steek de naald in de houder. Stel de injectiehoek in op 45 graden. Breng het naaldpunt in zicht onder de microscoop, hoog boven het stadium, en focus op het dunste gebied van het punt.Gebruik vervolgens fijne pincetten om het puntje van de naald af te breken. Plaats een capillair buisje met een binnendiameter van 0,15 millimeter onder de microscoop. Injecteer de oplossing in één uiteinde.Pas de uitworptijd op de pico micro-injectiepomp aan totdat 17 druppels een vloeibare kolom vormen van één millimeter lang. Dit maakt het volume van elke druppel gelijk aan één nanoliter. Stel volgens gepubliceerde protocollen voor standaard zebravishouderij en onderhoud transgene WT een BG FP zebravis kweekparen op.Na een natuurlijke spawn verzamel embryo's en breng ze over in een petrischaal met E drie water. Gebruik de embryo's tussen de een en vier cellen fase, breng ze over naar een 10 centimeter petrischaal met wigvormige auger troggen. Na het aspireren van het medium drukt u de embryo's voorzichtig in de troggen. Onder de dissectiemicroscoop oriënteert u de embryo's om de cel te visualiseren.Ga vervolgens met de injectienaald door de Corian en vervolgens door het dooier om een of twee druppels morpho in het dooier te injecteren. Breng de geïnjecteerde embryo's over naar een 10 centimeter petrischaal met E drie water en incubeer bij 28,5 graden Celsius. Noteer het aantal levensvatbare geïnjecteerde embryo's om een fenotypereddingsexperiment uit te voeren.Selecteer een ortho log van een gen van een andere soort dat een andere primaire basepaarstructuur heeft en daarom resistent is tegen de morpho. In dit voorbeeld werd muis went vijf A gekozen. Ontwerp een primerset met de voorwaartse primer beginnend bij de translationele startplaats en de omgekeerde primer dicht bij het einde van de MR NA-coderegio.Voeg een T zeven promotorsequentie toe aan het vijf prime-uiteinde van de voorwaartse primersequentie met de primers en één microgram sjabloon-DNA bevattende de muis wind. Vijf A-C-D-N-A-sequentie. Stel een 50 microliter PCR-reactie op en voer deze uit volgens het hier getoonde programma.Na het verifiëren van de grootte van het PCR-product, het zuiveren en controleren van de concentratie, gebruikt u een gecapt RNA-synthesekit om in vitro gecapt mRNA te synthetiseren. Volg de instructies van de fabrikant, gebruik 20 microliters RNAs vrije water om de MR NA te verdunnen en bepaal de concentratie-aliquot en bewaar het RNA op negentig graden Celsius op de dag van de injectie. Bereid een werkoplossing van de MR NA voor die een dosis van 40 picogram of lager zal leveren om niet-specifieke of toxische effecten op het embryo te voorkomen.Houd de MNA-oplossing op ijs en injecteer morphoses en vervolgens mRNA in de embryo's of co-injecteer de oplossingen. Verwijder de volgende dag dode embryo's en controleer of embryo's gas hebben ondergaan. Voeg vervolgens 0,003% end fenyl THREA of PTU toe aan het E drie water om melanoom te voorkomen op 48 uur na bevruchting.Gebruik fijne pincetten om de embryo's handmatig te coaten voordat u een dissectiemicroscoop gebruikt om afbeeldingen te maken onmiddellijk en op 72 uur na bevruchting ongeveer 10 minuten voorafgaand aan beeldvorming onder een fluorescentiemicroscoop, verdoof de embryo's door ze in een 10 centimeter petrischaal te plaatsen die 160 microgram per microliter gebufferd trica bevat. Gebruik 3% methylcellulose om de embryo's te monteren en onder een dissectiemicroscoop oriënteert u ze in een prone positie. Gebruik vervolgens 10 keer en 20 keer vergroting om afbeeldingen te maken.De embryo's onder een fluorescentiemicroscoop wind vijf A knockdown werd bereikt door translation blocking morpho te introduceren, ook wel een UG morpho of exon intro border splice morpho, ook wel splice morpho genoemd, naar zebravis embryo's. In het eencellig stadium richt de A UG morpho zich op het startcodon en remmt daarom zowel de maternale als zygotische win vijf a

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Dit werk presenteert een nieuw in vivo model van segmentale nierbeschadiging met behulp van transplantale zebravis van GFP van de nieren. Het model zorgt voor de inductie van de gerichte ablatie van nierepitheelcellen om de cellulaire mechanismen van nephron letsel en reparatie te tonen.

Precise Cellular Ablation Approach voor het modelleren van acute nierbeschadiging bij het ontwikkelen van zebravis

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

Leer hoe u een zebravis-model van polycystische nierziekte maakt door wnt5a knockdown met morpholino-injectie in Tg(wt1b:GFP) embryo's. Fluorescentiemicroscopie toont niercystevorming.

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Meer video's verkennen