Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Het algemene doel van het volgende experiment is om op lentivirus gebaseerde, opnieuw geprogrammeerde, factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen af te leiden en deze cellen om te zetten in veronderstelde klinische graad voorwaarden. Dit wordt bereikt door eerst volwassen humane dermale fibroblasten opnieuw te programmeren met een enkele ex-grote lentivirale stamcelcassette of stamcarr in HI PSC's. Vervolgens worden de opnieuw geprogrammeerde HI PSC's blootgesteld aan adeno Cree purr-virus voor volledige excisie en verwijdering van de stamcarr uit het gastheergenoom.

Vervolgens wordt genomisch DNA geëxtraheerd uit de feedervrije HI PSC's, gevolgd door agele analyse, wat de juiste stamcarr-excisie bevestigt. Ten slotte worden de factor drie H IPC's omgezet in veronderstelde GMP-graadvoorwaarden door middel van een langzame conversiemethodologie naar volledig gedefinieerde xenovrije voorwaarden. Uiteindelijk onderstreept de virale reprogrammering van humane volwassen dermale fibroblasten en de volledige omzetting van de H IPC's naar klinische graadvoorwaarden de brede toepasbaarheid van deze methodologie voor het opnieuw programmeren van volwassen menselijke cellen en het omzetten ervan in klinisch relevante voorwaarden.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar klinische toepassingen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, aangezien ze volledig factorvrij zijn en zijn omgezet in klinische graadvoorwaarden, waardoor ze compatibel zijn met humane therapieën. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat reprogrammeringsexcisie en klinische graadconversiestappen moeilijk te leren zijn vanwege de belangrijke ingewikkelde en specifieke procedures die moeten worden gevolgd om factor drie en klinische graad humane geïnduceerde pluripotente stamcellen op te leveren. Om te beginnen ontdooi je. Volwassen humane dermale fibroblasten of HAF's in een 37 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten.

Zorg ervoor dat de bovenkant van de fles niet onder water komt. Plaats de één milliliter slurry van cellen in een 15 milliliter kroniek flesje om de cellen te resuspenseren en het DMSO druppelsgewijs te verdunnen. Voeg langzaam vier milliliter voorverwarmd huff-medium toe, centrifugeer de violet 200 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Aspiseer vervolgens de sup, nacent en reus. Suspensie de cellen in medium tot 100.000 cellen per milliliter in een put van een zes-putten plaat preco to 0,2%gelatine. Voeg twee milliliter van de celsuspensie toe, voeg vervolgens twee milliliter suspensie toe aan een tweede.

Put, om de multipliciteit van infectie of MOI te meten, wieg de plaat heen en weer en heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen voordat ze overnacht worden geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide in een bevochtigde kamer. 24 uur later, na het tellen van de cellen, ontdooi je twee keer center de acht transductie-eenheden of S van gelijkwaardig lentiviraal concentraat en gebruik huff-medium om het te verdunnen tot een keer 10 tot de acht ts per milliliter met half medium gesupplementeerd met acht microgram per milliliter transfectiemiddel. Transduceer de cellen met een multipliciteit van infectie van 10.

Meng de transduce-putten gelijkmatig en incubeer ze overnacht, ongeveer 24 uur na lentivirale transductie. Verwijder het huff-medium en vervang het door standaard humane pluripotente stamcel- of PSC-medium. Ververs het medium dagelijks op dagen twee tot zes op de zesde dag in twee 0,2%Gelatine gecoate 10 centimeter schaaltjes plateer 1,5 tot 1,75 keer 10 tot de zes muizen embryonale fibroblasten afgeleid van complement component factor een of CF een muizen in half medium op dag zeven.

Voeg kamertemperatuur trips toe aan een put van een zes-putten plaat van de opnieuw geprogrammeerde fibroblasten. Til voorzichtig de cellen op en centrifugeer ze 100 keer G met vers humaan PSC-medium plateer alle cellen in een verhouding van één op zestien op twee 10 centimeter CFI meth-platen. Verdeel de aggregaten in een kloksgewijze spiraalbeweging en incubeer ze ongeveer 48 uur voordat het medium wordt vervangen.

Na drie tot vier weken, gebruik een 21 gauge naald om acht tot tien individuele stukken van specifieke kolonies met typische ESC-achtige morfologie te plukken en subcloneer ze in individuele putten van CFI MFS na expansie. Bevestig dat de cellen pluripotent zijn door embryolichaamsvorming en markerexpressieanalyse na verificatie van de stamcarr-integratieplaats zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Excideer stamcarr door eerst het oude humane PSC-medium af te aspireren in drie milliliter standaard PSC-medium gecombineerd.

45 microliter geconcentreerd adeno Cree pur of virus met acht microgram per milliliter transfectieagentia. Voeg vervolgens toe aan de cellen en incubeer gedurende 24 uur. Na de incubatie aspireert de virale supinate humane PSC-medium om de cellen twee keer te wassen. Voeg vervolgens HPSC-medium toe met twee microgram per milliliter pure mycine en vervang dagelijks. Na vijf dagen subcloneer je de resterende kolonies en breid ze uit zoals eerder in de video beschreven.

Ontdooi vervolgens één flesje pre Eloqua basement membrane matrix op ijs en verdun koud basaal medium tot een uiteindelijke concentratie van één op dertig. Gebruik één milliliter per put om het gewenste aantal putten van een zes-putten plaat te coaten en laat de plaat een uur op kamertemperatuur staan. Gebruik vervolgens een 18 gauge naald om minimaal 20 tot 30 kolonies van een eerder met mes gecoate put te crosshatchen.

Zorg ervoor dat je mes opheft en de cellen van de plaat overbrengt. Na de incubatie van één uur aspireert u de matrix uit de gecoate put met een 200 microliter pipette. Verwijder stukken van de kolonies door ze voorzichtig van de oude plaat te schrapen en plaats ze voorzichtig in drie milliliter vers gecombineerd medium, één in een met matrix gecoate plaat.

Na incubatie gedurende 48 uur, ververs het medium dagelijks wanneer de post-exciseerde en feedervrije omgezette HI PSC's 80%co-fluency bereiken. Gebruik een commercieel DNA-extractiekit om het genomisch DNA te extraheren met behulp van de hier getoonde primers die specifiek zijn voor exogene integraties van het stamcarr-lentivirus. Analyseer het DNA door