Name: Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer hoe je transgen-vrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afleidt uit volwassen dermale fibroblasten en deze omzet naar klinisch-grade omstandigheden. Deze methode ondersteunt therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Patrick C. Lee, Cyril Ramathal en Saravanan Karumbayaram (SK) bedanken voor hun hulp bij het uitvoeren van de iPSC-afleidings- en karakteriseringsexperimenten; Aaron Cooper voor het uitvoeren van de iPSC-analyse-experimenten; Vittorio Sebastiano en Renee A. Reijo Pera voor het leiden van de initiële herprogrammeringsinspanningen; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack en Donald B. Kohn voor het leiden van de oprichting van de UCLA GMP-faciliteiten die de conversie en karakterisering van klinische iPSC's mogelijk maken; Gustavo Mostoslavsky voor het verstrekken van de STEMCCA-polycistronische herprogrammeringsvector. Dit werk is gebaseerd op een onderzoekssamenwerking met Fibrocell Science en de Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives (CIDMOD) Initiative om veilige gepersonaliseerde cellulaire therapeutische middelen te genereren. Dit werk werd ondersteund door financiering van het Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research aan UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. en de UCLA CTSI Scholar's Award aan JAB.

LET OP: Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Awe et al. 10. 1. herprogrammeren volwassen menselijke dermale fibroblasten met STEMCCA <ol><li> Ontdooi volwassen dermale humane fibroblasten (HUFs), doorgang 4 of lager, in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min, verzorgen de bovenkant van de flacon met water te dompelen. </li><li> Plaats de 1 ml suspensie van humane fibroblasten in een 15 ml conische flacon en langzaam 4 ml standaard HUF media, voorverwarmd tot 37 ° C, in een druppelsgewijze manier, verdund uit dimethylsulfoxide (DMSO) en opnieuw te schorten cellen. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in een voldoende hoeveelheid media aan een suspensie van 100.000 cellen / ml te maken en voeg vervolgens 2 ml in een putje van zes-well plaat, pre-coating gedurende 20 min met 0,2% gelatine. OPMERKING: Een zuster goed met een gelijk aantal cellen per lijn en conditie moet worden gezaaid for de cel tellen / multipliciteit van infectie (MOI) berekening. </li><li> Rock de plaat van links naar rechts en weer terug en weer naar de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Op de dag van transductie, verkrijgen celgetal (s) van de zus goed (s) ongeveer 24 uur na de eerste HUF plating. </li><li> Ontdooien 2 x 10 8 TU, of gelijkwaardig, lentivirale concentraat (STEMCCA) en vul aan tot 1 x 10 8 TU / ml in HUF media. </li><li> Transduceren cellen bij 10 MOI verhouding HUF medium aangevuld met 8 ug / ml transfectie agens. Meng getransduceerde putjes gelijkmatig en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li><li> Ongeveer 24 uur na lentivirale transductie, schakelt de HUF media om standaard menselijke pluripotente stamcellen (PSC) medium. </li><li> Op dag 2 tot en met 6, veranderen media dagelijks met menselijke PSC medium. </li><li> Op dag 6, plaat twee 0,2% gelatine beklede 10-cm platen van1,5-1,75 x 10 6 MEFs ontleend CF1 muizen HUF media 12. </li><li> Op dag 7, dat evenwel niet tot meer dan 100 xg, gebruik kamertemperatuur trypsine centrifuge op te heffen van de dag 7 geherprogrammeerd fibroblasten van de ene put van de zes-well plaat en doorgang aan een 01:16 verhouding, door platen alle cellen gelijkmatig tussen twee platen van 10 cm, met verse menselijke PSC media, die zijn bedekt met MEF de dag ervoor. Verdeel celaggregaten in wijzerzin spiraalvormige beweging en plaats in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator &#39;s nachts. </li><li> Ongeveer 48 uur na het zaaien de geherprogrammeerd cellen op MEF en elke dag daarna, uit verandering bracht menselijk PSC media met verse media. </li><li> Na 3 tot 4 weken, pick individuele kolonies met typische ESC morfologie met een 21-gauge naald en subkloneren uit in een 24-well plaat door het plaatsen van ongeveer 8 tot 10 individuele stukken van specifieke koloniën in afzonderlijke putjes in een 0,2% gelatine beklede 24-wells plaat pre-seeded met MEF ontleend CF1 muizen menselijke PSC medium. OPMERKING: Na expansie van geplukt kolonies, de kolonies moeten worden gekarakteriseerd als pluripotente bij embryoiden-vorming en expressie analyse van pluripotentie markers op eiwitniveau. </li></ol> 2. Vector Integratie Site Analyse en STEMCCA Excisie <ol><li> Analyseer de STEMCCA intergratieplaats door niet-restrictieve lineaire amplificatie PCR zoals beschreven 10. </li><li> Na het testen van een integratie te waarborgen in een gewenst gebied van het genoom, accijnzen STEMCCA door opzuigen uit de oude menselijke ESC medium. Vervolgens combineer 45 pi geconcentreerd Adeno-Cre-PuroR virus met 8 ug / ml transfectie agens in 3 ml standaard PSC media gedurende 24 uur. </li><li> Nadat de 24-uur incubatietijd, zuigen uit de gemengde virale supernatant en was de cellen tweemaal met menselijke PSC media. Plaats verse humane PSC medium met 2 ug / ml puromycine gedurende 5 dagen, veranderen de media dagelijks with verse media en antibioticum. </li><li> Na 5 dagen subkloon overblijvende kolonies met een 21-gauge naald op 0,2% gelatine beklede putjes in een 12-well platen vooraf bekleed met MEFs ontleend CF1mice en vergroten zoals hierboven beschreven. OPMERKING: Na voldoende uitbreiding naar een bevroren voorraad te verkrijgen, wordt de omzetting in-feeder-vrije omstandigheden vereist. Verwacht ten minste 95% stamcellen kolonie dood meeste cellen niet met succes wordt getransduceerd en bezwijkt antibiotica gedurende de periode van 5 dagen incubatie. Hoewel adeno-Cre-PuroR integreert op een ,001-1% rendement in gastheerchromosomen van geïnfecteerde cellen, reexposing een steekproef van-factor vrije kolonies te puromycine om ervoor te zorgen 100% celdood zal bevestigen geen integratie heeft plaatsgevonden 13. </li><li> Ontdooien één flacon vooraf in porties basaalmembraan matrix op ijs, gedurende een periode van ongeveer 2 uur (aanbevelingen van de fabrikant) tot de matrix is ​​een vloeistof en verdunnen naar een uiteindelijke concentratie van 1:30 in koude basale media. Coop gewenste aantal putten in een zes-well plaat met 1 ml per putje. Laat op kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Cross-hatch (met behulp van een 18-gauge naald, of een glas of plastic &quot;tip&quot;) ten minste 20 tot 30 kolonies van een goed voorheen bekleed met MEF. Wees voorzichtig om te verminderen MEF opbeurend en overbrengen van de plaat. <ol><li> Genereer de arcering inrichting via een aantal verschillende benaderingen van de meer gecompliceerde verwarming, trekken en het polijsten van een glazen Pasteur pipet op een open vlam, het eenvoudige gebruik van een steriele plastic pipet tip of, zoals in ons geval, 21- en / of 18-gauge naalden. </li></ol></li><li> Zuig de matrix van de beklede put na incubatie. </li><li> Verwijder stukken van de kolonies door voorzichtig schrapen van de oude plaat met een 200 ul pipet en zorgvuldig geplaatst in 3 ml vers gecombineerde medium 1 in de matrix beklede plaat. Incubeer overnacht op 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. Verandering media 48 uur na passage. </li><li> Uittreksel genomisch DNA uit post-uitgesneden en voedingsvrije omgezette hiPSCs op meer dan 80% confluentie met commerciële DNA-extractie kits. </li><li> Analyseren voor een goede excisie met primers specifiek voor exogene integraties van de STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-reverse, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Reconstrueren gevriesdroogde primers met PCR-grade water om een ​​10-uM stockoplossing. </li><li> Voer een PCR met de volgende vijf stappen protocol: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van elk van de volgende: denaturatie bij 98 ° C gedurende 20 seconden, primer annealing bij 62 ° C gedurende 15 sec en verlenging bij 72 ° C gedurende 15 seconden; gevolgd door één cyclus laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 3 min. </li><li> Voeg een 3% agarosegel door weging uit 1,5 g agarose en te plaatsen in 50 ml 1x Tris-acetaat-EDTA-buffer. Magnetron totdat agarose is opgelost en plaats in het DNA gel vlek op ptouwslager verdunning, mengen, en afzien juiste volume in gelcassette te stollen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Belasting 12 pi PCR product gemengd met 3 pl geladen kleurstof in een 3% agarose gel. Laat de gel gedurende 30 minuten bij 80 V. </li><li> Visualiseren met ultraviolet licht voor het ontbreken van een band aangeeft juiste excisie. </li></ol> 3. Kwantificering van Gene Expression Verschillen met behulp van kwantitatieve PCR uit pre- en post-weggesneden hiPSCs <ol><li> Uittreksel totaal RNA van post-uitgesneden en voedingsvrije geconverteerde hiPSCs met behulp van commerciële RNA-extractie kits. </li><li> Omgekeerde transcriptie tot 1 ug totaal RNA met gebruik van commerciële kits volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik verankerd-oligo (dT) 18 en random hexameer primers. OPMERKING: Zorg dat de PCR-protocol is op maat gemaakt voor gentranscripten van meer dan of minder dan 4 kb. Specifieke primers moeten worden gemaakt welke genen STEMCCA oorspronkelijk geïntegreerd into. </li><li> Reconstrueren de gevriesdroogde primer met PCR-grade water om een ​​20 uM stockoplossing. </li><li> Gebruik 5 ng monster per 20 pi reactie die bestaat uit 10 uM UPL sonde, 2x LightCycler 480 Probes Meester, en 20 uM forward en reverse primers. </li></ol> 4. Omzetting in GMP-grade Voorwaarden <ol><li> Op de eerste dag van de overgang van de post-weggesneden hiPSCs over aan GMP-grade omstandigheden, maken een mix van media, bestaande uit de menselijke PSC gecombineerd media 1 (gecombineerd media 1) en de klinische kwaliteit goede fabricagemethoden (GMP) compatibele media (gecombineerde media 2 ) in een 80:20 verhouding. </li><li> Zuig de oude gecombineerde media 1 en plaats 3 ml van de nieuwe gecombineerde media 1 en 2, voorverwarmd op de 80:20 verhouding. Verander media dagelijks gedurende 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Op dag 4, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 50:50 verhouding. Zuig de oude medium en replace met voorverwarmde media, de gecombineerde media 1 en 2 aan de 50:50 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Op dag 7, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 20:80 verhouding. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 aan de 20:80 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Op dag 10, maakt de gecombineerde media 1 en 2 met een 0 100 ratio. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 bij de 0: 100 verhouding. Wijzig de media elke dag op deze specifieke verhouding. De cellen zijn nu in totaal toegezegde xeno vrije media. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. OPMERKING: Tijdens dit hele conversie proces, wordt routinematige passage met een 18-gauge naald nodig om een ​​goede kolonie grootte en dichtheid te behouden. Plan op het passaging cellen elke 4 tot 5 dagen op basis van koloniegrootte, confluentie en differentiatie. </li><li> Jas een goed in een zes-well plaat met een gedefinieerde-xeno gratis substraat, zoals aanbevolen door de fabrikant. </li><li> Mechanisch passage een samenvloeiing goed, al omgezet naar xeno-vrije media voorwaarden, van een zes-well plaat met een 18-gauge naald. Belangrijker is, plaatst u de nieuwe media (gecombineerd media 2) op de cellen met 1x ROCK-remmer gedurende 1 uur, vóór passage van een pre-conditie de media. </li><li> Zuig het synthetische substraat oplossing van de nieuwe plaat die de cellen worden overgebracht naar. Verwijder alle media die de stamcellen klonten uit de oude plaat en over te dragen aan nieuwe plaat. </li><li> Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 2 dagen met minimale fysieke verstoringen (idealiter platen eenmaal binnen incubator, niet rechtstreeks geraakt aan uit) om maximale hechting mogelijk. OPMERKING: Cellen zal dagelijks media veranderingen vereisen. Voortdurende passaging om de 4 dagen zal belangrijk zijn. Met behulp van een 21-gauge naald, passage alleen de delen van de kolonies met een optimale ESC-achtige morfologie (hoog nucleocytoplasmatische ratio). Dit zorgt voor een juiste keuze iPSC kolonies die goed groeien en uiteindelijk verkregen homogene kolonies. Totale tijd om afleiding van ESC-achtige kolonies is tussen de 15-20 dagen na de eerste gecombineerde media verandering. </li><li> Bevriezen door het GMP-grade achteraf weggesneden hiPSCs door eerste cross-hatch alle kolonies met behulp van een 18-gauge naald. Til alle stukken af ​​met 200 ul pipet geheel overgaat medium dat de cellen een 15 ml conische flacon en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Terwijl de cellen centrifugeren, maak een koude medium bestaat uit gelijke volumina koude gecombineerde media 2 en invriesmedium met een uiteindelijke DMSO-concentratie van 7,5%. </li><li> Na cellen worden afgedraaid, zuigen uit oude medium en drop-wijs opnieuw op te schorten de pellet met de bevriezing media. Onmiddellijk transfer te bevriezen flesjes en in een -80 ° C vriezer. </li></ol> 5. Kenmerkend GMP-grade Post-weggesneden hiPSCs <ol><li> Voor juiste expressie van de pluripotentie markers na de conversie te waarborgen, gebruik QPCR expressie van belangrijke pluripotentie markers (SOX2, OCT4 en NANOG) met de in tabel 1 vermeld met dezelfde stappen primers kwantificeren zoals in stap 3 QPCR methoden volgen Dezelfde stappen als vermeld in stap 3. </li><li> Gebruik stromingscytometrie de niet-humane siaalzuur Neu5Gc (N -glycolylneuraminic zuur) volgens in de kit die als eerder gepubliceerd 10 standaard ziektebeelden. </li><li> Voorzichtig wassen de celkweek platen met cellen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Distantiëren kolonies met 1x dissociatie reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens de 5 minuten incubatietijd van stap 5.4 Bereid de blockingbuffer (verstrektkit) door een 0,5% Blocking Agent in ijskoude PBS. </li><li> Label de volgende set van buizen voor flowcytometrieanalyse: ongekleurd; 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) DAPI; Controle antilichaam 1: 200; Primair antilichaam 1: 200; Secundair antilichaam 1: 200 Donkey Anti-kip IgG (H + L); Monster MEF; Monster post-weggesneden cellen op matrix; en Sample post-weggesneden cellen op synthetische ondergrond. </li><li> Voorzichtig los celaggregaten uit stap 5.4 door het toevoegen van 2 ml van het blokkeren oplossing en overdracht inhoud naar een 15-ml conische buis. Centrifugeer bij 80 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen tweemaal met blokoplossing en gecentrifugeerd zoals in stap 5.7. </li><li> Voorzichtig resuspendeer ongeveer 1 x 10 6 cellen in 100 pl blokkeeroplossing de overeenkomstige verdunningsvolume van elk antilichaam. Incubeer met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Herhaal wast driemaal in stap 5.8. </li><li> Re-schorten de cel pellet in 400 ul van Verdunningsmiddel Buffer (van kit) met 1: 100 DAPI voor buizen 2, 6, 7, en 8 genoemd in stap 5.6. </li><li> Stam cellen door een 40 uM zeef en lopen door doorstroomcytometer. </li></ol>

<ol><li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+field+of+induced+pluripotency%3A+Recent+progress+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li>
<li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li>
<li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells%3A+many+rabbits+in+the+hat%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li>
<li>Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Geron+Corporation+Press+Release%22">Geron Corporation Press Release</a>. , Geron. (2009).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li>
<li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
</ol>

James A. Byrne (JAB) en Agustin Vega-Crespo ontvangen onderzoeksfinanciering van Fibrocell Science, Inc. JAB is een wetenschappelijk adviseur voor Fibrocell Science, Inc. Geen andere auteurs hebben enige concurrentiebelangen te onthullen.

We beschrijven een methodiek voor het afleiden-factor vrij hiPSCs en waardoor ze klinisch relevant door het omzetten van deze cellen in het GMP-grade voorwaarden voor downstream celdifferentiatie in de toekomst menselijke geneeswijze. Hoewel dit protocol is breed toepasbaar op een verscheidenheid van celtypen, kozen we humane dermale fibroblasten herprogrammeren, wegens het gemak van extractie van de patiënt en hun toepasbaarheid op maat menselijke therapeutica. Zodra beperkingen wat worden verholpen volledige different...

Volwassen menselijke cellen zijn aangetoond in staat te zijn epigenetische hermodellering en herprogrammering te ondergaan, als resultaat van lentivirale expressie van vier belangrijke transcriptiefactoren4,5. Een belangrijke vooruitgang in het herprogrammeringsveld was het gebruik van een enkele verwijderbare lentivirale stamcelcassette (STEMCCA), die alle vier de herprogrammeringstranscriptiefactoren bevatte die een precieze stoichiometrische verhouding van eiwitexpressie mogelijk maakten6. Bovendien kan STEMCCA, wanneer getransduceerd in specifieke besmettingsmultiplicitieiten, leiden tot overwegend enkele genomische integratie-gebeurtenissen tijdens het herprogrammeringsproces7. De introductie van een verwijderbare versie van STEMCCA, die gebruik maakt van Cre/loxP technologie gevolgd door excisie van het herprogrammeringsvector na afstamming van de stamcellijn, maakte het mogelijk om factor-vrije humane geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen te ontwikkelen8. Bovendien, om therapeutische toepassingen van hiPSC's te verbeteren, was er een nieuwe, snelle en direct toepasbare methodologie nodig voor goede fabricagepraktijken (GMP)-kwaliteit cellijnconversie, van xeno-bevattende naar xeno-vrije condities. Hier bespreken we een relevante methodologie die geïntegreerde genexpressieve verschillen nauwkeuriger beoordeelt, specifiek wanneer geïntegreerd in een intron, en celconversie van klinisch niveau naar veronderstelde GMP-condities. 
Eerder onderzoek heeft alleen relatief ongevoelige microarray transcriptieanalyse gebruikt om genexpressieve verschillen in geïntegreerde genen na STEMCCA transductie te analyseren3,9. Hier introduceren we de methodologie van gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) analyse, om verder geïntegreerde genexpressieve verschillen te onderzoeken. Belangrijk is dat huidige veilige-haven criteria hiPSC's verwerpen die genen hebben met virale integraties, waardoor de toepasbaarheid van deze cellen voor downstream humane cellulaire therapieën wordt beperkt9. We stellen voor dat de status quo kan veranderen met het gebruik van volledig gekarakteriseerde en transgen-vrije intronic geherprogrammeerde hiPSC's. Bovendien introduceren we een robuust GMP-kwaliteit celconversieprotocol dat direct kan worden toegepast op een verscheidenheid aan verschillende celtypen, die oorspronkelijk zijn ontwikkeld onder xeno-bevattende condities10. Dit biedt aanzienlijke mogelijkheden voor de ontwikkeling van toekomstige celherprogrammeringsexperimenten, die klinisch niveau condities vereisen om humane therapeutische relevantie te behouden. 
Deze methodologieën vormen een basis waarop huidige veilige-haven criteria kunnen worden uitgebreid om gekarakteriseerde STEMCCA geherprogrammeerde hiPSC lijnen te omvatten die een normaal genexpressieprofiel behouden na STEMCCA excisie uit de geïntegreerde intron. Ook zal volledige conversie naar klinische kwaliteit condities, vrij van niet-menselijke dierlijke antigenen, helpen om veel meer celtypen te kunnen incorporeren, die eerder alleen onder xeno-bevattende condities zijn geherprogrammeerd en gekarakteriseerd. Deze methodologieën gecombineerd, zijn overtuigende gronden voor de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om te overwegen hun beperkte goedkeuring uit te breiden van op humane embryonale stamcel (ESC) gebaseerde therapieën naar hiPSC-gebaseerde therapieën11. 
We hebben onlangs de afleiding van een factor-vrije hiPSC lijn gedetailleerd die volledig is gekarakteriseerd en omgezet in veronderstelde klinische kwaliteit condities10. Hier beschrijven we het protocol voor hiPSC afleiding door gebruik van de STEMCCA lentivirus. Deze stamcellen ondergaan vervolgens een excisieproces gevolgd door genexpressie karakterisering. Ten slotte worden de hiPSC's omgezet naar GMP-kwaliteit condities door een langzame conversiemethode.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media en reagentia</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (basismedia)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penicilline-streptomycine, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Ontdooi bij 4 &deg;C, verdeel in porties en bewaar bij &minus;20 &deg;C</td></tr><tr><td>Knockout serum vervanging</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Ontdooi bij 4 &deg;C, verdeel in porties en bewaar bij &minus;20 &deg;C</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Verdun stock tot 0,05% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td><td>GSR-2001</td><td>Reconstitueer tot 10 &micro;g/ml stock in 0,1% bovien serum albumine opgelost in 1x PBS en bewaar bij &minus;80 &deg;C</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, USA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (basale membraanmatrix)</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>356231</td><td>Verdun stock Matrigel fles met 10 ml DMEM/F12 terwijl het op ijs staat voor een 1:2 verdunning. Verdeel in porties en bewaar bij &minus;20 &deg;C.</td></tr><tr><td>CELLstart (synthetisch substraat)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (Basel, Zwitserland)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medium/vriesmedium</td><td>Lonza (Basel, Zwitserland)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, uit varkenshuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Maak stock van 0,2% in PBS, autoclaveer en bewaar op kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td><td>5850</td><td>Combineer Supplement 5x met het basismedium, verdeel in porties en bewaar bij 4 &deg;C gedurende maximaal 2 weken.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Cultuurmedium</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>Ontdooi bij 4 &deg;C O/N, verdeel in porties en bewaar bij 4 &deg;C gedurende maximaal 2 weken.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (dissociatiereagens)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene/transfectie-agens</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>12-wells platen</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>6-wells platen</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>10-cm platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge naald</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge naald</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>BD LSRII Flow Cytometer</td><td>KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Version 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA Isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td><td>Basic Pack</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Gecombineerde media 1</td><td>StemCell Technologies en Stemgent</td><td></td><td>Bestaat uit gelijke delen mTeSR1 en Nutristem</td></tr><tr><td>Gecombineerde media 2</td><td>StemCell Technologies en Stemgent</td><td></td><td>Bestaat uit gelijke delen TeSR2 en Nutristem</td></tr><tr><td>HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium/F12 [DMEM/F12] aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x Glutamax, en 1x Primocin</td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cell Media</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 aangevuld met 20% knockout serum vervanging, 1x Glutamax, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x Primocin, 1x &beta;-mercaptoethanol, en 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium/F12; PBS, fosfaat-gebufferde zoutoplossing.</td></tr></tbody></table>

afleiden en karakterisatie van een transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente stem cell line en de omschakeling naar defined klinisch-grade voorwaarden

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kan worden gegenereerd met lentivirale gebaseerd herprogrammering methodieken. Echter, sporen van potentieel oncogene genen resterende actief getranscribeerde gebieden van het genoom, beperken hun potentieel voor toepassing in humane therapeutische toepassingen 1. Bovendien, niet-menselijke antigenen afgeleid van stamcellen herprogrammering of differentiatie in therapeutisch relevante derivaten belet deze hiPSCs wordt gebruikt in een klinische context 2. In deze video, presenteren we een procedure voor het herprogrammeren en analyseren-factor vrij hiPSCs vrij van exogene transgenen. Deze hiPSCs kunnen vervolgens worden geanalyseerd op genexpressie afwijkingen in de specifieke intron bevat het lentivirus. Deze analyse kan worden uitgevoerd met gevoelige kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR), die voordeel minder gevoelige technieken vroeger gebruikt om genexpressie 3 verschillen te detecteren is. Volledige omzetting inklinisch-grade goede fabricagemethoden (GMP) voorwaarden, laat de menselijke klinische relevantie. Ons protocol biedt een andere methode op voorwaarde dat de huidige veilige haven criteria zullen uitbreiden en onder-factor vrij gekarakteriseerde iPSC-gebaseerde derivaten voor menselijke therapeutische toepassingen-voor het afleiden van GMP-grade hiPSCs, die elke immunogeniciteit risico moet elimineren als gevolg van niet-menselijke antigenen. Dit protocol is breed toepasbaar lentivirale geherprogrammeerd cellen van elk type en verschaft een reproduceerbare werkwijze voor het omzetten geherprogrammeerd cellen in GMP-grade omstandigheden.

We presenteren een protocol voor het afleiden van klinisch-grade-factor vrij hiPSCs met behulp van de STEMCCA lentivirale-gebaseerde herprogrammering aanpak. Figuur 1A toont een representatief beeld van drie verschillende pre-weggesneden iPSC lijnen, na herprogrammering met de STEMCCA aanpak op een laag van MEF. Het belangrijkste voordeel van de STEMCCA herprogrammering aanpak ligt bij de consistente herprogrammering succes bereikt door meerdere wetenschappers, in verschillende onderzoeksgroepen en loca...

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om op lentivirus gebaseerde, opnieuw geprogrammeerde, factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen af te leiden en deze cellen om te zetten in veronderstelde klinische graad voorwaarden. Dit wordt bereikt door eerst volwassen humane dermale fibroblasten opnieuw te programmeren met een enkele ex-grote lentivirale stamcelcassette of stamcarr in HI PSC's. Vervolgens worden de opnieuw geprogrammeerde HI PSC's blootgesteld aan adeno Cree purr-virus voor volledige excisie en verwijdering van de stamcarr uit het gastheergenoom.Vervolgens wordt genomisch DNA geëxtraheerd uit de feedervrije HI PSC's, gevolgd door agele analyse, wat de juiste stamcarr-excisie bevestigt. Ten slotte worden de factor drie H IPC's omgezet in veronderstelde GMP-graadvoorwaarden door middel van een langzame conversiemethodologie naar volledig gedefinieerde xenovrije voorwaarden. Uiteindelijk onderstreept de virale reprogrammering van humane volwassen dermale fibroblasten en de volledige omzetting van de H IPC's naar klinische graadvoorwaarden de brede toepasbaarheid van deze methodologie voor het opnieuw programmeren van volwassen menselijke cellen en het omzetten ervan in klinisch relevante voorwaarden.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar klinische toepassingen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, aangezien ze volledig factorvrij zijn en zijn omgezet in klinische graadvoorwaarden, waardoor ze compatibel zijn met humane therapieën. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat reprogrammeringsexcisie en klinische graadconversiestappen moeilijk te leren zijn vanwege de belangrijke ingewikkelde en specifieke procedures die moeten worden gevolgd om factor drie en klinische graad humane geïnduceerde pluripotente stamcellen op te leveren. Om te beginnen ontdooi je. Volwassen humane dermale fibroblasten of HAF's in een 37 graden Celsius waterbad gedurende twee minuten.Zorg ervoor dat de bovenkant van de fles niet onder water komt. Plaats de één milliliter slurry van cellen in een 15 milliliter kroniek flesje om de cellen te resuspenseren en het DMSO druppelsgewijs te verdunnen. Voeg langzaam vier milliliter voorverwarmd huff-medium toe, centrifugeer de violet 200 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Aspiseer vervolgens de sup, nacent en reus. Suspensie de cellen in medium tot 100.000 cellen per milliliter in een put van een zes-putten plaat preco to 0,2%gelatine. Voeg twee milliliter van de celsuspensie toe, voeg vervolgens twee milliliter suspensie toe aan een tweede.Put, om de multipliciteit van infectie of MOI te meten, wieg de plaat heen en weer en heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen voordat ze overnacht worden geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide in een bevochtigde kamer. 24 uur later, na het tellen van de cellen, ontdooi je twee keer center de acht transductie-eenheden of S van gelijkwaardig lentiviraal concentraat en gebruik huff-medium om het te verdunnen tot een keer 10 tot de acht ts per milliliter met half medium gesupplementeerd met acht microgram per milliliter transfectiemiddel. Transduceer de cellen met een multipliciteit van infectie van 10.Meng de transduce-putten gelijkmatig en incubeer ze overnacht, ongeveer 24 uur na lentivirale transductie. Verwijder het huff-medium en vervang het door standaard humane pluripotente stamcel- of PSC-medium. Ververs het medium dagelijks op dagen twee tot zes op de zesde dag in twee 0,2%Gelatine gecoate 10 centimeter schaaltjes plateer 1,5 tot 1,75 keer 10 tot de zes muizen embryonale fibroblasten afgeleid van complement component factor een of CF een muizen in half medium op dag zeven.Voeg kamertemperatuur trips toe aan een put van een zes-putten plaat van de opnieuw geprogrammeerde fibroblasten. Til voorzichtig de cellen op en centrifugeer ze 100 keer G met vers humaan PSC-medium plateer alle cellen in een verhouding van één op zestien op twee 10 centimeter CFI meth-platen. Verdeel de aggregaten in een kloksgewijze spiraalbeweging en incubeer ze ongeveer 48 uur voordat het medium wordt vervangen.Na drie tot vier weken, gebruik een 21 gauge naald om acht tot tien individuele stukken van specifieke kolonies met typische ESC-achtige morfologie te plukken en subcloneer ze in individuele putten van CFI MFS na expansie. Bevestig dat de cellen pluripotent zijn door embryolichaamsvorming en markerexpressieanalyse na verificatie van de stamcarr-integratieplaats zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Excideer stamcarr door eerst het oude humane PSC-medium af te aspireren in drie milliliter standaard PSC-medium gecombineerd.45 microliter geconcentreerd adeno Cree pur of virus met acht microgram per milliliter transfectieagentia. Voeg vervolgens toe aan de cellen en incubeer gedurende 24 uur. Na de incubatie aspireert de virale supinate humane PSC-medium om de cellen twee keer te wassen. Voeg vervolgens HPSC-medium toe met twee microgram per milliliter pure mycine en vervang dagelijks. Na vijf dagen subcloneer je de resterende kolonies en breid ze uit zoals eerder in de video beschreven.Ontdooi vervolgens één flesje pre Eloqua basement membrane matrix op ijs en verdun koud basaal medium tot een uiteindelijke concentratie van één op dertig. Gebruik één milliliter per put om het gewenste aantal putten van een zes-putten plaat te coaten en laat de plaat een uur op kamertemperatuur staan. Gebruik vervolgens een 18 gauge naald om minimaal 20 tot 30 kolonies van een eerder met mes gecoate put te crosshatchen.Zorg ervoor dat je mes opheft en de cellen van de plaat overbrengt. Na de incubatie van één uur aspireert u de matrix uit de gecoate put met een 200 microliter pipette. Verwijder stukken van de kolonies door ze voorzichtig van de oude plaat te schrapen en plaats ze voorzichtig in drie milliliter vers gecombineerd medium, één in een met matrix gecoate plaat.Na incubatie gedurende 48 uur, ververs het medium dagelijks wanneer de post-exciseerde en feedervrije omgezette HI PSC's 80%co-fluency bereiken. Gebruik een commercieel DNA-extractiekit om het genomisch DNA te extraheren met behulp van de hier getoonde primers die specifiek zijn voor exogene integraties van het stamcarr-lentivirus. Analyseer het DNA door

derivation-characterization-transgene-free-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Regelmatige karakterisering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), om het behoud van hun pluripotente toestand vast te stellen, is een belangrijke stap voordat deze cellen voor andere toepassingen worden gebruikt. Hier beschrijven we een methode voor de kleinschalige vermenigvuldiging van menselijke iPSC's, specifiek ontworpen om hun eenvoudige en routinematige karakterisering via immunocytochemie mogelijk te maken.

Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Leer hoe je transgen-vrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afleidt uit volwassen dermale fibroblasten en deze omzet naar klinisch-grade omstandigheden. Deze methode ondersteunt therapeutische toepassingen.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden (Video) | JoVE Journal

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Meer video's verkennen