Name: Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer een labelvrije biosensormethode om HLA-gekoppelde tumorantigenen in patiëntmonsters te detecteren voor borstkankerdiagnostiek. Deze techniek maakt snelle patiëntstratificatie voor immunotherapie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studies werden gedeeltelijk ondersteund door de Development Corporation of Abilene, die laboratoriumruimte en salarisondersteuning biedt voor Experimmune, een centrum voor immunotherapeutische ontwikkeling aan het Texas Tech University Health Sciences Center en Resonant Sensors Incorporated.

Ethische verklaring: De-geïdentificeerde menselijke weefsels en plasma monsters werden verkregen van Hendrick Medical Center onder een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. 1. Toevoeging van gebiotinyleerd antilichaam OPMERKING: Monitoring van deze stap is optioneel. Zie alternatief protocol als niet te bewaken. <ol><li> Te verkrijgen in de handel verkrijgbare avidine afgeleide gecoate platen (zie materialen en apparatuur tabel). </li><li> Voeg 50 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2 putjes. OPMERKING: Preincubate PBS bij 28 ° C tot gerelateerd resonantie verschuivingen minimaliseren. </li><li> Open bioassay scanner software en volg de Setup Wizard om de experimentele procedure die selectie van blanks, standaarden en monsters in de plaat lay-out, temperatuurinstelling (28 ° C), het aantal scans per minuut inclusief define (1), en de lengte van het experiment ( 150 min om tegemoet te preparatieve stappen). </li&gt; <li> Plaats de bereide testplaat in het label vrij bioassay scanner en start de eerste scan. Toen de eerste scan is voltooid, selecteert &quot;self verwijzing te starten&quot;. De basislijn is de eerste reeks scans verzameld op het begin van het experiment. Als dit de eerste lezen uitgevoerd op deze specifieke plaat, zodat de scanner werking temperatuur evenwicht en elimineren drift baseline. Zie figuur 2 voor een screenshot van een baseline, gevolgd door toevoegen van een monster. </li><li> Nadat de basislijn gestabiliseerd, althans 5 scans, pauzeren lezen en uitwerpen van de plaat. </li><li> Verwijder PBS door het storten in de gootsteen en voeg 50 ul RL21A gebiotinyleerd antilichaam bij [10 ug / ml in PBS pH 7,2] alles behalve controle wells. Voeg 50 pl PBS om de controleputjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen totdat verzadiging bereikt is, ongeveer 1,5 uur. </li><li> Pauzeer de lees- en uitwerpen van de plaat. </li><li> Was de<html> plaat 3 maal met 200 ul / putje fosfaatgebufferde zoutoplossing + 0,05% Tween 20 (PBST), gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS pH 7,2. Herhaal met PBS. Tik overtollige PBS van de plaat op keukenpapier voorafgaand aan het verplaatsen naar de volgende stap. OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op een automatische plaatwasser of was de plaat 3 maal met 200 pi PBST door storten vloeistof in een gootsteen en het vervangen van PBST met een pipet. </li><li> Voeg 50 ul PBS pH 7,2 tot alle actieve putjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen te controleren post-wash resonantie. </li><li> Stop de lees- en uitwerpen van de plaat. </li></ol> Alternatieve protocol voor Stap 1: <ol start="13"><li> Voeg 50 ul RL21A gebiotinyleerd antilichaam bij [10 ug / ml PBS] aan alle putjes. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de plaat 3 maal met 200 ul / putje PBST, gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS zoals in stap 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Toevoeging van analyt <ol><li> Verwijder de PBS en voeg 50 ul per putje van geschikte testbuffer. Voor deze test werd de handel verkrijgbare normaal menselijk serum gebruikt 1:20 verdund in PBS. </li><li> Open bioassay scanner software en volg de installatiewizard om experimentele procedure te definiëren. </li><li> Plaats de plaat in de bioassay scanner en beginnen met een baseline te lezen. Als dit de eerste lees- uitgevoerd op dit specifieke bord, laat de scanner draaien om de temperatuur in evenwicht komen en te elimineren drift in baseline. </li><li> Nadat de basislijn gestabiliseerd, althans 5 scans, pauzeren lezen en uitwerpen van de plaat. </li><li> Verwijder de testbuffer uit de putjes. </li><li> Spike controles met HLA A * 02: 01 monomeer lager relevante (FLSL) of irrelevant (SLLV, YLEV, of KVL) peptiden in concentraties die variëren van [,625-10 ug / ml] in assaybuffer. Voeg 50 ul van normen de controle putjes van de plaat </li><li> Voeg 50 ul van analyt in assaybuffer het monsterputjes van de plaat. Voor deze test spiked handel verkrijgbaar humaan serum werd gebruikt. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen totdat verzadiging is bereikt, ongeveer 30-60 min. </li><li> Pauzeer de lees- en uitwerpen van de plaat. </li><li> Was de plaat 3 maal met 200 ul / putje PBST, gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS zoals in stap 1.9. </li><li> Voeg 50 ul assaybuffer alle actieve putjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen te controleren post-wash resonantie. </li><li> Stop de lees- en uitwerpen van de plaat. OPMERKING: De testbuffer kunnen PBS, weefselcultuur of humaan serum 1:20 verdund in PBS, afhankelijk van het doel van de assay. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Analyseren met behulp van de bioassay scanner software of exporteren ruwe data bestanden naar de voorkeur van statistische analyse software. De bioassay scanner software genereert de binding curve gebaseerd op het automatischplaatindeling verstrekt tijdens experimentele opstelling. OPMERKING: Als het niet gebruiken van de biologische scanner software voor analyse, volgt u de stappen 3,2-3,4. </li><li> Aftrekken van de basislijn en de negatieve controle van elke volgende data punt. </li><li> Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking voor duplo putjes op elk tijdstip. </li><li> Genereren van een grafiek van de bindende curve of selecteer eindpunt gegevens voor staafdiagrammen. </li></ol>

<ol><li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Producing+nature%27s+gene-chips%3A+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li>
<li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li>
<li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li>
<li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide%2FHLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li>
<li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li>
<li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li>
<li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li>
<li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li>
<li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trial+results+of+the+HER-2%2Fneu+%28E75%29+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients%3A+from%5BTitle%5D)+AND+%22US+Military+Cancer+Institute+Clinical+Trials+Group+Study+I-01+and+I-02.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li>
<li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li>
<li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li>
<li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li>
<li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+principle+for+optical+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li>
<li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
</ol>

De auteurs, Debra Wawro Weidanz en Robert Magnusson, respectievelijk Chief Executive Officer en Chief Technology Officer bij Resonant Sensoren Incorporated, die de biologische plaat lezer en assayplaten gebruikt in dit artikel oplevert.

De werkwijze die hierin beschreven introduceert een biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker die een snelle detectie van oplosbare peptide / HLA-complexen in de patiënt serum, plasma, urine of speeksel in staat zou stellen in een high throughput 96- of 384-wells-formaat. Dit testsysteem gebruikmakend van de T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen en een ongelabelde detectiesysteem snijdt de analyse tot minder dan 1 uur in vergelijking met 3,5 uur met conventionele ELISA. Deze high-throughput aanpak maakt een snelle stratificatie van patiënten met klinische proeven voor therapeutische vaccins tegen kanker of biofarmaceutica. Huidige werkwijzen voor de detectie van deze ziekte doelen vereisen affiniteitszuivering en HPLC-MS / MS van individuele patiëntenmonsters, een omslachtig en tijdrovend proces. Hoewel deze methode is vatbaar voor conventionele ELISA-technieken is er bezorgdheid dat secundaire detectie reagentia zoals de anti-β2-microglobuline antilichaam de structuur van de ontluikende HL kunnen wijzigenEen molecuul en remt binding aan de TCRm beperken detectie. Label-free detectie verlicht deze zorgen. Deze procedure kan worden aangepast voor gebruik op andere labelvrije systemen zoals oppervlakte plasmon resonantie systeem. Dit zou echter sterk verminderen de hogere doorvoer mogelijkheden in vergelijking met de bioassay systeem gebruikt in deze studie. Dit protocol kan effectief worden aangepast voor de detectie van niet-HLA biomarkers patiënt serum en plasma met volgen van een paar kritische stappen. Controle van de oorspronkelijke antilichaam bekledingsproces wordt aanbevolen voor optimalisering van het oppervlak, als &lt;200 pm verschuiving zal waarschijnlijk resulteren in lage signaal voor de daaropvolgende detectiestap. De basislijn en post-wash leest bruikbaar voor de eindpuntanalyse de overvloed aan serumeiwitten binding van lage concentratie analyt kan maskeren. Ten slotte kan de temperatuur variatie van de monsters resulteren in goed om goed variatie. Het wordt aanbevolen dat alle monsters vooraf worden geïncubeerd eend het label gratis biosassay eenheid temperatuurregelaar worden ingesteld op 2-3 ° C boven kamertemperatuur. Gekoelde stalen moeten worden toegestaan ​​genoeg tijd om de bedrijfstemperatuur te bereiken. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal multiplexing van TCRm op de plaat oppervlak. De bioassay systeem nog vatbaar spotten van putjes met een dichtheid van ten minste 8-plex. Door de introductie van 4-8 TCRm aan elk putje, per monster volumes worden verminderd en kan de collectie van steeds complexere gegevens per patiënt. Deze mogelijkheid zou kunnen patiënten verder te informeren met betrekking tot de therapeutische opties.

De klasse I menselijk leukocyt antigeen (HLA) monsters peptiden van 8-11 aminozuren in lengte afgeleid uit de proteasomale degradatie van het intracellulaire eiwit repertoire en presenteert deze peptiden op het oppervlak van een kernhoudende cel 1,2. De HLA-complex is &quot;biomarker van de natuur&quot;, met vermelding van de gezondheid van elke cel (figuur 1) om circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Erkenning van de ziekte geassocieerd peptiden resulteert in verwijdering van de gewraakte cel door CTL. Dus de adaptieve immuunreactie is zeer effectief bij het elimineren van virale infectie en tumor. Echter, het immuunsysteem druk uitoefent die vaak bevordert keuze voor virussen of tumoren kunnen ontwijken een effectieve CTL respons. T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek peptide / HLA-A * 02 herkennen 01 complexen zoals die afgeleid van borstkanker geassocieerde eiwitten, macrofaagmigratie remmende factor (MIF19-27) 3 en NY-ESO-1 157-165, maken detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons 4,5. Deze vertegenwoordiger werk is gericht op het HLA-A * 0201 molecuul, die wordt uitgedrukt tot 30% van de bevolking. De identificatie van andere relevante HLA / peptide-complexen, gevolgd door de productie van TCRm maakt de ontwikkeling van gerichte immuuntherapie en companion diagnostica, uitbreiden van de bruikbaarheid van dit werk een veel bredere populatie. Een deel van het peptide / HLA-complexen gebonden voor het celoppervlak wordt vrijgegeven in het plasma. Vanwege de zeer complexe aard van peptide / HLA zwembaden, de huidige methoden voor de mijnbouw de immunopeptidome voor HLA geassocieerd biomarkers zijn tijdrovend. Dit proces vereist de affiniteitszuivering van oplosbare HLA uit het plasma scheiden van HLA geassocieerde peptiden met omgekeerde fase hogedrukvloeistofchromatografie(RP-HPLC) en peptide sequentiebepaling door tandem massaspectrometrie (MS / MS) 6,7. Hoewel deze werkwijze een haalbare optie voor de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten is een moeizaam proces als gezelschap diagnostisch hulpmiddel voor HLA bijbehorende doelen reeds in de therapeutisch vaccin of biofarmaceutische pijpleiding 8-10. TCRm tegen de targets bieden de instrumenten voor snelle companion diagnostics ontwikkeling gericht op stratificatie patiënten in relevante klinische studies en meer gefundeerde therapeutische opties. In dit werk wordt een doorbraak biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker gepresenteerd die TCRm en een label-free bioassay systeem dat de biologische interacties met minimale stappen-monitors gebruikt. De ongelabelde bioassay is gebaseerd op een werkwijze, waarbij de geleide-modus resonantie (GMR) effect dat optreedt diëlektrische golfgeleider roosters 11-14 gebruikt. Toen breedband licht contact met de diffractierooster in de voor dit systeem platen worden twee specifieke golflengten gereflecteerd. De binding interactie tussen een geïmmobiliseerde receptor en zijn ligand wordt gevolgd in real time door het volgen van de resonantie golflengteverschuiving met een spectrum analyzer 12. Afzonderlijke resonantiepieken voordoen bij incident TE (elektrische vector loodrecht op het vlak van inval) en TM (magnetische vector loodrecht op het vlak van inval) polarisatietoestanden verschaffen van meerdere gegevenspunten die potentieel kan verhogen detectienauwkeurigheid 11,14. Met behulp van antilichaam pre-gesensibiliseerd platen in dit label-free testsysteem, de test run tijd met data-analyse is ongeveer 45 min. Bovendien kunnen meerdere patiëntmonsters worden opgevraagd in een 96- of 384 putjes, een duidelijk voordeel over een HPLC-MS / MS-gebaseerd formaat.

<table><tbody><tr><td>ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ResoVu software</td><td>Resonant Sensors Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A Biotinylated TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A Biotinylated TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>volledige peptidesequentie: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>volledige peptidesequentie: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>volledige peptidesequentie: YLEPGPVTV</td></tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>volledige peptidesequentie: KVLEYVIKV</td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Serum&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Cell Supernatant</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Cellen gekweekt in IMDM, 10% FBS en 1% penn/strep. Supernatant verzameld uit 3 dagen confluente culturen.</td></tr><tr><td>Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2&rsquo;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-human &beta;2 microglobulin&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; microplates</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 microplate reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress Reagent Kit</td><td>Vector</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>Vector</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin QS</td><td>Vector</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van humaan leukocytenantigeen biomarkers bij borstkanker gebruikmakend-label gratis biosensortechnologie

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Volgens de American Cancer Society, meer dan 200.000 vrouwen worden gediagnosticeerd met invasieve borstkanker elk jaar ongeveer 40.000 zullen sterven aan de ziekte. Het menselijk leukocyt antigeen (HLA) klasse I monsters peptiden afgeleid van proteasomale afbraak van cellulaire eiwitten en presenteert deze fragmenten op het celoppervlak voor ondervraging door circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Vorming van T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die borstkanker herkennen specifiek peptide / HLA-A * 02: 01 complexen zoals die afgeleid van macrofaagmigratie remmende factor (MIF 19-27) en NY-ESO- 1 157-165 inschakelen detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons. Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door borstkankercellen en vertegenwoordigen potentieel relevante kanker biomarkers. In dit werk, een doorbraak biomarker screening voor kanker diagnostisches opnemen van T-cel receptor na te bootsen monoklonale antilichamen in combinatie met een nieuw, label-free biosensor gebruik te maken van geleide-modus resonantie (GMR) sensortechnologie wordt gepresenteerd. Detectie van loods MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 celsupernatanten, spiked humaan serum en plasma van de patiënt wordt aangetoond. De impact van dit werk kon gepersonaliseerde geneeskunde een revolutie door de ontwikkeling van de ziekte companion diagnostics voor gerichte immuuntherapie.

Een representatieve reeks experimenten werd uitgevoerd met de goed gekarakteriseerde TCRm, RL21A, een murine IgG2a monoklonaal antilichaam dat specifiek een peptide (MIF 19-27 of FLSL) in de context van het HLA-A * 02: 01 molecule 3. De verwante peptide / HLA monomeer en irrelevant HLA monomeer 15 werd gebruikt om de procedure te tonen. Figuur 3 illustreert de testformaat. RL21A is specifiek voor de FLSL / HLA monomeer met weinig kruisreactiviteit met andere peptide / HLA complexen 3. Deze specificiteit wordt geïncorporeerd met de labelvrije bioassay (zie figuur 4). De gevoeligheid van het label vrij bioassay voor dit experiment in de lage nanomolaire bereik zoals bepaald door titratie van de RL21A antilichaam op geïmmobiliseerde FLSL / HLA monomeer (figuur 5). Hoewel het achtergrondsignaal significant verhoogd in serummonsters, sSPECIFIEKE detectie van FLSL / HLA monomeer spiked humaan serum bereikt in figuur 6 en een concentratiegradiënt gemakkelijk waarneembaar in deze monsters. Tenslotte supernatanten van de MDA-MB-231 cellijn, waarvan eerder is aangetoond de FLSL / HLA-A * 02 voorstellen: 01 molecule, getoond oplosbare FLSL monomeer bevatten met dit label vrij assay platform (figuur 7). Na toevoeging van FLSL / HLA monomeer verhoogt het signaal op RL21A (figuur 7). Vanwege de gevoeligheid van het systeem, goed goed variatie om negatieve resonantie verschuivingen kunnen optreden als gevolg van temperatuurschommelingen gezien als functie van de standaardafwijkingen in de figuren 4 en 5. Deze variaties kunnen drastisch worden verminderd door pre-incubatie van alle monsters en de bioassay plaatlezer bij een temperatuur in geringe overmaat kamertemperatuur (bijvoorbeeld 28 ° C). In figuur 8 kort 96-Goed polystyreen platen werden bekleed met [10 ug / ml] van RL21A gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gewassen met PBST, geblokkeerd met 0,5% magere melk, gewassen met PBST en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met seriële verdunningen van FLSL HLA monomeer in normaal menselijk serum 1:10 verdund in PBS tot een standaardcurve of patiënt plasma 1:10 verdund in PBS. De plaat werd gewassen met PBST, 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur met konijn anti-humaan β2-microglobuline [1: 5000] aan intacte HLA detecteren en gewassen in PBST. De platen werden vervolgens gedurende 30 minuten met geit anti-konijn IgG [1: 10.000] en gewassen met PBST. Colorimetrische detectie werd uitgevoerd met ABTS (2,2&#39;-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur] -diammonium zout) substraat met een 15 min incubatietijd en waargenomen bij 405 nm op een microplaat lezer. FLSL / HLA werd ontdekt in drie monsters van patiënten. In figuur 8B, werd patiënt plasma RL.064 1:20 verdund in PBS en voeged aan de plaat en bewaakt de labelvrije detector gedurende 60 min. Specifieke detectie van FLSL / HLA complex patiënt serum werd bereikt. Student&#39;s t test werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,05). In figuur 8C werden coupes gekleurd bij 1 ug / ml met muizen anti-HLA-A2 (BB7.2) als een positieve controle, RL21A, IgG2b en IgG2a respectievelijk als negatieve controles. Kleuring werd gedetecteerd met een anti-muis detectiekit, DAB (diaminobenzadine) en hematoxyline QS nucleaire kleuring zoals aangegeven door de fabrikant. Kleuring van tumorweefsel door RL21A bevestigt presentatie van FLSL / HLA-complexen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Tumor antigeen presentatie door de klasse I menselijk leukocyt antigen Cancerous transformatie is een intracellulaire stoornis. HLA monster intracellular eiwitten en onthullen kankergerelateerde veranderingen op het celoppervlak. CTL en TCRm zijn in staat om kankercellen te herkennen door middel van HLA-peptide complexen onderscheiden om die cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. Screenshot van data voor de biologische scanner software Voorbeeld data acquisitie die de oorspronkelijke basislijn scan gevolgd door RL21A antilichaam Naast een plaat bekleed met 10 ug / ml FLSL / HLA complex. Concentraties van antilichaam zijn zoals aangegeven. Elke regel staat voor een individu goed de tijd gevolgd. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figuur 3:. Test uitvoering illustratie van antilichamen geïmmobiliseerd op de diffractieve roosteroppervlak van de testplaat vastleggen relvante peptide / HLA-complexen in oplossing. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figuur 4: Specificiteit van RL21A voor FLSL / HLA complex Demonstratie van de specificiteit van gebiotinyleerd RL21A TCRm voor haar relevante (FLSL) HLA-monomeer in vergelijking met irrelevante HLA monomeer (YLEV, SLLV en KVL).. Gebiotinyleerde RL21A TCRm [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak avidine gecoat en detectie werd uitgevoerd met ongelabelde relevant of irrelevante HLA monomeer [10 ug / ml] in PBS. RL21A was specifiek voor FLSL / HLA Complex. Two-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,001). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figuur 5:. Binding gevoeligheid van RL21A zijn verwant peptide / HLA complex Illustratie van de detectiop de limiet en bindende gevoeligheid van RL21A aan de FLSL / HLA-complex. Gebiotinyleerd HLA Monomeer FLSL [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak ongemerkt RL21A werd aan de plaat toegevoegd seriële verdunningen in PBS aangegeven. Detectie voor dit systeem was in de lage nanomolaire bereik. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figuur 6: Detectie van HLA Complexen in Spiked Human Serum Demonstratie van de detectie van HLA in humaan serum.. Gebiotinyleerde RL21A TCRm [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak avidine gecoat. Samengevoegd normaal humaan serum verrijkt met relevante (FLSL) of irrelevant (SLLV) HLA monomeer werd 1:20 verdund in PBS en vervolgens aan de plaat toegevoegd en bewaakt de labelvrije detector gedurende 60 min. Specifieke detectie van FLSL / HLA complex in humaan serum werd uitgevoerd. In het algemeen, achtergrond signaal (irrelevante SLLV monomeer) is hooger voor verdunde serummonsters tegenover gezuiverd analyten in PBS (zie figuur 4). Two-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,0001). <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figuur 7:. Borstkanker celkweek supernatanten oplosbare HLA complexen gedetecteerd Het vermogen om HLA detecteren borstkanker celsupernatanten aangetoond. Gebiotinyleerde RL21A TCRm, RL9A TCRm (negatieve controle), en een isotypecontrole werden geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak. Spiked [5 pg / ml] en-verrijkte MDA-231 celkweek supernatanten werden toegevoegd en binding werd gedurende 60 min op de labelvrije detector. FLSL en SLLV HLA monomeer spiked samples vertegenwoordigen positieve controles voor RL9A en RL21A bindend. One-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,0001). Figuur 8:. Specifieke detectie van FLSL / HLA complexen in patiëntmonsters (A) Traditionele Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) werd gebruikt om FLSL / HLA specifieke complexen detecteren patiënt plasma. (B) gebiotinyleerd RL21A TCRm of IgG2a [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op het avidine testplaat. (C) Borst tumorweefsel van patiënten RL.064 werd gekleurd zoals eerder beschreven 3 tot tumor presentatie van de FLSL / HLA-complexen te controleren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door kankercellen, wat neerkomt op een potentieel relevante kanker biomarker. Met behulp labelvrije sensortechnologie en T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen, detectie van stal MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 cel supernatanten, spiked humaan serum en plasma van een patiënt wordt aangetoond, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe kankertherapie diagnostisch platform.

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Het algemene doel van deze procedure is om humaan leukocyten antigeen of HLA-geassocieerde tumorantigenen in patiëntvloeistoffen te meten voor stratificatie van patiënten voor relevante immunotherapie. Dit wordt bereikt door eerst T-cel receptor nabootsende antilichamen, bekend als TCRM, op het MICROPLATE-oppervlak te immobiliseren. De tweede stap is het toevoegen van het patiëntmonster samen met seriële verdunning van doelwitpeptide HLA-monomeren om een standaardcurve te genereren, die de kwantificering van het doelwitantigeen in patiëntmonsters mogelijk maakt.Vervolgens wordt de binding van het doelwitantigeen aan het antilichaam in het label-free bioassay-systeem gemonitord totdat het evenwicht is bereikt. De laatste stap is het analyseren van de resulterende gegevens door de standaardcurve te gebruiken om de hoeveelheid doelwitantigeen in patiëntmonsters te kwantificeren. Uiteindelijk wordt label-free biosensortechnologie gebruikt om kankerbiomarkers in patiëntmonsters te detecteren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals lc MSS, is de snelle hoge doorvoer detectie van HLA-geassocieerde antigenen. Dit maakt de snelle stratificatie van kankerpatiënten voor behandelingsmodaliteiten mogelijk omdat het dient als een biomarker detectieplatform. Hoewel deze methode gerelateerd is aan het screenen van kankerbiomarkers, is het systeem eigenlijk toepasbaar op vele toepassingen, inclusief cel-gebaseerde assays, immunofenotypering hybride screening, of het screenen van kleine molecuulbibliotheken.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we een therapeutisch T-cel receptor nabootsend antilichaam ontwikkelden. We vroegen ons af hoe we patiënten zouden kunnen identificeren die het meeste baat zouden hebben bij dit type therapie? Het demonstreren van deze procedure zal Kristen Dahl zijn, een biotechnologie afgestudeerde studente die in mijn laboratorium werkt.Begin met het voorincuberen van de fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS bij 28 graden Celsius om temperatuurgerelateerde resonantieverschuivingen te minimaliseren. Voeg 50 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS pH 7,2 toe aan de putjes van avadon-afgeleide gecoate platen. Open vervolgens de bioassay scanner software.Volg de setup wizard om de experimentele procedure te definiëren, inclusief selectie van blanco's, standaarden en monsters in de plate lay-out, temperatuurinstelling, aantal scans per minuut en de lengte van het experiment. Plaats vervolgens de voorbereide assayplaat in de label-free bioassay scanner en start de eerste scan. De baseline is de initiële set scans die aan het begin van het experiment zijn verzameld.Als dit de eerste lezing is die op deze specifieke plaat wordt uitgevoerd, laat de scanner lang genoeg draaien om de temperatuur te stabiliseren en drift in de baseline te elimineren. Nadat de baseline is gestabiliseerd of na minimaal vijf scans, pauzeer de lezing en verwijder de plaat. Giet de PBS weg en voeg 50 microliter RL 21, een biotinylerend antilichaam, toe aan alle behalve controleputjes op de plaat.Voeg vervolgens 50 microliter PBS toe aan de controleputjes. Plaats vervolgens de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen tot verzadiging is bereikt. Na ongeveer 1,5 uur, pauzeer de lezing en verwijder de plaat.Was vervolgens de plaat drie keer met 200 microliter per putje van PBS plus 0,05% Tween 20 of PBST. Volg de was met drie spoelingen van 200 microliter per putje van PBS pH 7,2 zonder detergent. Tik overtollig PBS van de plaat op papieren handdoeken voordat u naar de volgende stap gaat.Voeg vervolgens 50 microliter PBS toe aan alle actieve putjes. Plaats vervolgens de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen om de post-wash resonantie te monitoren. Na het lezen, stop het lezen en verwijder de plaat.Voeg de analyt toe. Verwijder de PBS en voeg 50 microliter per putje van een geschikte assaybuffer voor deze assay toe. Commercieel verkrijgbaar normaal humaan serum werd verdund tot 1 op 20 in PBS.Open vervolgens de bioassay scanner software en volg de setup wizard. Om de experimentele procedure te definiëren, plaats de plaat in de bioassay scanner en begin met een baseline lezing. Nadat de baseline is gestabiliseerd of na minimaal vijf scans, pauzeer de lezing en verwijder de plaat. Verwijder vervolgens de assaybuffer uit de putjes.Bepaal vervolgens de controles met HLAA oh 2 0 1 monomeren met relevante of irrelevante peptiden bij concentraties variërend van 0,625 tot 10 microgram per milliliter in assaybuffer. Voeg vervolgens 50 microliter van de standaarden toe aan de controleputjes van de plaat. Voeg vervolgens 50 microliter van de analyt in assaybuffer toe aan de monsterputjes van de plaat.Voor deze assay werd gespikt commercieel verkrijgbaar humaan serum gebruikt. Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen tot verzadiging is bereikt. Ongeveer 30 tot 60 minuten na verzadiging, pauzeer de lezing en verwijder de plaat. Was vervolgens de plaat drie keer met 200 microliter per putje van PBST, gevolgd door drie spoelingen met 200 microliter per putje van PBS zoals eerder, voeg vervolgens 50 microliter assaybuffer toe aan alle actieve putjes.Plaats vervolgens de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen om de post-wash resonantie te monitoren voordat u het lezen stopt en de plaat verwijdert. Analyseer tenslotte de gegevens met behulp van de bioassay scanner software of exporteer de ruwe gegevensbestanden naar de gewenste statistische analysesoftware. De bioassay scanner software genereert automatisch de bindingscurve op basis van de plate lay-out die tijdens de experimentele setup is opgegeven.Biotinyleerde RL 21 A-T-C-R-M of IgG two A werd geïmmobiliseerd op de AVID AVIDAN assayplaat. Representatieve resultaten tonen detectie van het doelwit tumorantigeen F-L-S-L-H-L-A in een patiëntplasmamonster bij evenwicht en na wassen. IgG two A wordt gebruikt als controle voor niet-specifieke binding. Weefselsecties werden gekleurd met een positieve controle en negatieve controles. En voor RL 21 a kleuring van tumorweefsel door RL 21 A bevestigt presentatie van F-L-S-L-H

detection-human-leukocyte-antigen-biomarkers-breast-cancer-utilizing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Lectine-geconjugeerde POROS kralen werden gebruikt voor HPLC. Glycopeptide normen dienden als positieve en negatieve controles. MARS-14 leeg is, werd trypsine-verteerd menselijk plasma gechromatografeerd en flow-through (FT) en gebonden fracties verzameld voor ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptiden werden verrijkt in de gebonden fractie ten opzichte van FT.

Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

Magnetische modulatie biosensing systeem wordt gebruikt om snel, gevoelig en eenvoudig te detecteren biologische assays, zoals DNA-moleculen en eiwitten.

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Begin with a bacterial biosensor culture suspended in a medium.These engineered bacteria produce a transcription factor that, upon binding to a specific fecal metabolite, activates a promoter associated with a fluorescent reporter gene.To this culture, add a filtered human fecal sample containing metabolites, such as lactate, that are involved in host-microbiome interactions.Dilute this mixture with a fresh medium to maintain an optimal reaction volume.Incubate without shaking to mimic the...

Detection of Human Fecal Metabolites Using a Bacterial Biosensor

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

In deze studie ontwikkelden we een goedkope oppervlakte-verbeterde Raman scattering (SERS) -gebaseerde vingerafdruk nanoprobe met gunstige biocompatibiliteit om labelvrije levende celbioimaging te tonen en twee bacteriestammen te detecteren, die in detail laten zien hoe SERS-spectra van levende cellen kunnen worden verkregen in een niet-destructieve methode.

Labelvrije oppervlakte-verbeterde Raman Scattering Bioanalyse op basis van Au@Carbon Dot Nanoprobes

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Leer een labelvrije biosensormethode om HLA-gekoppelde tumorantigenen in patiëntmonsters te detecteren voor borstkankerdiagnostiek. Deze techniek maakt snelle patiëntstratificatie voor immunotherapie mogelijk.

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

Meer video's verkennen