Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters
10 december 2014
Een nieuwe semi-automatische hybride DNA-extractiemethode voor gebruik met monsters uit de biologische pluimveehouderij werd ontwikkeld en vertoonde verbeteringen ten opzichte van een gebruikelijke mechanische en enzymatische extractiemethode in termen van de kwantitatieve en kwalitatieve schattingen van de totale bacteriegemeenschappen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een nieuwe DNA-extractietechniek te ontwikkelen die mechanische DNA-homogenisatie combineert met PCR-remmerverwijdering en de gouden standaard en somatische extractiemethode voor omgevingsmonsters langs de pluimveeproductieketen. Dit wordt bereikt door eerst een omgevingsmonster op te delen in microcentrifugebuizen die een mengsel van kralen bevatten om de complexe omgevingsmonsters effectief te homogeniseren. De tweede stap is om de buizen in een krachtige homogenisator te plaatsen om efficiënt nucleïnezuren uit de bacteriecellen en de omgevingsmatrix vrij te maken.
Vervolgens wordt het homogenaat gebruikt als startmateriaal voor de gouden standaard enzymatische DNA-extractiemethode via de PCR-remmingsbindingsfase. De laatste stap is om de monsters in een A DNA-extractie robotwerkstation te plaatsen om de gebruiker te voorzien van geëxtraheerde DNA-monsters die geschikt zijn voor een reeks downstream-toepassingen, uiteindelijk kwantitatieve PCR en microbioomanalyse met behulp van het aluminium MiSeq-platform, werden gebruikt om aan te tonen dat deze nieuwe hybride methode de beste combinatie van kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van totale bacteriegemeenschappen biedt in vergelijking met het verwerken van monsters met alleen de mechanische of enzymatische extractiemethode. Deze methode biedt inzicht in de analyse van microbiële gemeenschappen langs de pluimveeproductieketen, maar kan ook worden toegepast op andere landbouwsystemen zoals varkens, runderen of gewasproductie die eveneens complexe omgevingsmonsters bevatten.
Het demonstreren van deze procedure vandaag zal Kaitlyn Griffin zijn, een student in mijn laboratorium. Om het experiment te beginnen, stel een waterbad in op 95 graden Celsius. Weeg vervolgens drie replica's van 0,33 gram af om in totaal één gram kamertemperatuur, grond of fecale stof in een twee milliliter lysing matrix ET-buis te analyseren en verwissel handschoenen tussen monsters.
Voeg 825 microliter natriumfosfaatbuffer en 275 microliter pre-lyse-oplossing of PLS toe aan een monsterbuis. Vorm de monsters vervolgens gedurende 15 seconden en centrifugeer de buizen bij 14.000 Gs gedurende vijf minuten. Decanteer het supernatant en voeg 700 microliter buffer A SL toe. Vorm de buis vervolgens gedurende vijf seconden.
Open één buis per keer om besmetting te voorkomen. Zorg er vervolgens voor dat er een headspace van 10% van het totale volume in de conische buis is voordat u de monsters in het fast prep 24-instrument plaatst. Homogeniseer de monsters met een snelheid van zes meter per seconde gedurende 40 seconden.
Let op het verschil tussen fast prep 24 en vormen na homogenisatie. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 14.000 Gs. Breng het supernatant over naar een steriele twee milliliter microcentrifugebuis naar de resterende monster in de lysing matrix ET-buis op een aanvullend 700 microliter SL-buffer, herhomogeniseer en centrifugeer.
Gebruik de vorige instellingen, plaats plastic sluitclips op de monsterbuizen om ervoor te zorgen dat ze niet openspringen en incubeer de supernatanten gedurende vijf minuten in een waterbad van 95 graden Celsius. Open vervolgens elke microcentrifugebuis om de druk vrij te geven, dek de buizen af en vorm ze gedurende 15 seconden. Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 14.000 GS.
Na centrifugatie breng 1,2 milliliter van het supernatant over in een steriele twee milliliter microcentrifugebuis. Plaats vervolgens de blisterverpakking met de tab direct boven de open microcentrifugebuis en duw de tab voorzichtig uit de blisterverpakking in de buis. Om contact tussen de inhibit X-tab en de buis te voorkomen, voegt u één inhibit X-tab toe aan elk monster.
Vorm vervolgens de buizen totdat de monsters een uniform doffe witte vloeistof worden. Incubeer de monsters gedurende één minuut op kamertemperatuur en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 14.000 kaas terwijl u eventuele resterende deeltjes aan de bodem van de buizen vermijdt. Breng alle vloeistof over in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten op volle snelheid. Zorg ervoor dat de werkstation de juiste hoeveelheid filtertips en buffers bevat voordat u begint met geautomatiseerde DNA-zuivering. Voeg vervolgens ellucianbuizen en filterbuizen toe aan de rotoradapters en voeg 400 microliter van elk monster toe aan de middelste sleuf van de rotoradapter.
Plaats de rotoradapters in de werkstationcentrifuge en zorg ervoor dat alle deksels van de microcentrifugebuizen goed zijn bevestigd in de rotoradapter. Voeg proteinase K-oplossing toe aan een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis en plaats deze in slot A op de werkstation. Voeg twee milliliter veilige slot microcentrifugebuizen toe aan de schudsectie van de werkstation en zorg ervoor dat de deksels van de monsterbuizen stevig zijn geplaatst.
Gebruik het touchscreen op de werkstation en selecteer het DNA-stoel humane stoelpathogeendetectieprotocol en lees de volgende schermen door om er zeker van te zijn dat de werkstation correct is geladen. Zodra alle controleschermen zijn gepasseerd, selecteert u start om het protocol uit te voeren. Verwijder vervolgens de monsters uit de rotoradapters.
Combineer de drie replicaatzuiveringen voor een individueel monster met behulp van een centrifugatie-evaporatiesysteem. Eluteer het monster opnieuw naar een eindvolume van 100 microliter met tris EDTA-buffer. Dek de monsters af en plaats ze bij min 20 graden Celsius totdat ze nodig zijn voor downstream-analyse.
Deze grafiek toont aan dat de mechanische methode consistent de hoogste geschatte totale bacteriële genabundantie leverde voor feces- en strooiselmonsters. De enzymatische methode had in alle gevallen de laagste schattingen. De nieuwe hybride extractiemethode produceerde de beste combinatie van kwalitatieve en kwantitatieve geschatte totale bacteriegemeenschappen.
Van de drie geteste extractiemethoden. U zou nu een beter begrip moeten hebben van hoe u deze nieuwe, semi-geautomatiseerde hybride DNA-extractiemethode uitvoert en de nuttigheid ervan in de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van microbiële gemeenschappen uit complexe omgevingsmonsters kunt zien.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Er is een nieuwe semi-automatische hybride DNA-extractiemethode ontwikkeld voor monstervoorbereiding uit pluimveehouderijmilieus. Deze methode toonde verbeteringen in zowel kwantitatieve als kwalitatieve schattingen van totale bacteriegemeenschappen vergeleken met traditionele extractiemethoden.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Milieuwetenschap
- Biotechnologie
Achtergrond
- DNA-extractie is cruciaal voor het analyseren van microbiële gemeenschappen.
- Traditionele methoden hebben vaak moeite met complexe milieumonsters.
- Het verbeteren van extractietechnieken kan downstream-toepassingen verbeteren.
- Dit onderzoek richt zich op pluimveehouderijmilieus.
Doel van het onderzoek
- Om een hybride DNA-extractietechniek te ontwikkelen.
- Om mechanische homogenisatie te combineren met enzymatische extractie.
- Om de analyse van microbiële gemeenschappen in de pluimveehouderij te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Milieumonsters werden gehomogeniseerd met behulp van kralen.
- Er werd een krachtige homogenisator gebruikt voor het vrijmaken van nucleïnezuren.
- Het homogenaat werd verwerkt met behulp van een gouden standaard enzymatische methode.
- Een robotwerkstation vergemakkelijkte de extractie van DNA-monsters.
Belangrijkste resultaten
- De hybride methode leverde superieure kwalitatieve en kwantitatieve resultaten op.
- Het presteerde beter dan zowel mechanische als enzymatische extractiemethoden alleen.
- Resultaten werden gevalideerd met behulp van kwantitatieve PCR en microbioomanalyse.
- De methode is toepasbaar op andere landbouwsystemen met complexe monsters.
Conclusies
- De nieuwe hybride methode verbetert de DNA-extractie uit milieumonsters.
- Het biedt waardevolle inzichten in microbiële gemeenschappen in de pluimveehouderij.
- Deze techniek kan worden aangepast voor gebruik in andere landbouwcontexten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust DNA extraction from complex environmental samples is critical for accurate microbiome profiling and quantitative bacterial community assessment in agricultural R&D. The hybrid extraction method enhances both qualitative and quantitative outputs, supporting higher predictive confidence in microbial community analyses. This capability is strategically relevant for biopharma teams developing or validating disease-relevant models and translational biomarkers in animal health and production systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of microbial community structure in complex matrices.
- Improves detection of Gram-positive bacteria, reducing biological ambiguity in target validation.
- Supports functional assessment of microbial contributions to host phenotypes.
- Facilitates portfolio triage by providing reliable community composition data.
Screening & Assay Development
- Delivers high-quality DNA suitable for quantitative PCR and microbiome sequencing workflows.
- Standardizes extraction across diverse sample types, improving assay reproducibility.
- Enhances throughput and reduces manual error via semi-automation.
- Enables reliable downstream screening of microbial or host-microbe interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial community assessment with disease-relevant animal models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in agricultural and animal health research.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by providing robust quantitative and qualitative data.
- Facilitates biomarker discovery and validation in complex environmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This hybrid extraction method fits at the interface of sample preparation and downstream molecular analysis, bridging early discovery and preclinical research in agricultural and animal health pipelines.
- Discovery Biology: Provides reliable DNA extraction for hypothesis testing and microbial pathway clarification.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility for quantitative and qualitative microbial analyses.
- Analytics: Supports quantitative PCR and microbiome sequencing outputs for comparative studies.
- Translational Research: Enables robust microbial community profiling in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, semi-automated workflow adaptable to various complex environmental samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial community studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable DNA extraction across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-quality data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of animal health and agricultural R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and environmental sample handling.
- Needs access to high-powered homogenizers and automated DNA extraction workstations.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and data comparability.
- Adaptable to various environmental matrices with similar complexity to poultry production samples.
- Potential limitations include initial equipment investment and protocol optimization for new sample types.
