Name: Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer een hybride DNA-extractiemethode voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van bacteriële gemeenschappen in pluimveeproductiemonsters. Deze techniek combineert mechanische homogenisatie met enzymatische extractie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Latoya Wiggins en Katelyn Griffin bedanken voor hun hulp bij het verkrijgen van monsters, evenals Laura Lee Rutherford voor hun hulp bij het bemonsteren en moleculaire analyses. We willen ook Sarah Owens van Argonne National Lab bedanken voor de voorbereiding en sequencing van microbiomische monsters. Deze onderzoeken werden gelijkelijk ondersteund door de Agricultural Research Service, USDA CRIS Projecten “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 en “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

1. Mechanische homogenisering van Milieu pluimveeproductie Monsters <ol style="margin-left: 40px;"><li> Vóór extractie, stellen een waterbad tot 95 ° C en laat het waterbad tijd om die temperatuur te bereiken. </li><li> Weeg 0,33 g van de bodem of fecaal materiaal in een 2 ml Lysing Matrix E buis. <ol><li> Niet meer dan 0,33 g monster in de buis, aangezien de volgende oplossingen leiden tot de capaciteit van de buis overschrijden. </li><li> Ontdooi bevroren monsters naar RT voorafgaand aan het wegen. </li><li> Met het oog op een totaal van 1 g grond / uitwerpselen te analyseren, wegen uit 3 repliceren 0,33 g monsters voor elke individuele milieu monster. </li><li> WINKEL monsters bij -20 ° C binnen de conische matrix buisjes voorafgaand aan extractie, indien noodzakelijk. </li></ol></li><li> Voeg 825 ul natriumfosfaatbuffer en 275 ul van PLS oplossing voor een monster buis. Meng met een vortex gedurende ~ 15 seconden en centrifugeer de monsters bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Schenk de Supernatant en voeg 700 ul van Buffer ASL. Meng met behulp van een vortex gedurende 5 sec. <ol><li> Zorg ervoor dat er headspace (~ 10% totale volume) beschikbaar in de conische buis op dit punt. Als er geen vrije ruimte wordt de buizen neiging te lekken gedurende de volgende homogenisatiestap die kunnen leiden tot kruisbesmetting en / of monster verlies hebben. </li></ol></li><li> Plaats de monsters in een FastPrep 24 Instrument, en homogeniseer de monsters met een snelheid van 6,0 m / sec tot 40 sec. </li><li> Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenstaande een steriele 2 ml microcentrifugebuis. </li><li> Om het DNA herstel van het monster te maximaliseren, herhaalt u de stappen 1,4-1,6, het combineren van de bovenstaande vloeistoffen in dezelfde steriele, 2 ml microcentrifugebuis. </li></ol> 2. Enzymatische Remming van remmers van Monster Homogenaten OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de QIAamp DNA Stool Mini Kit. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Incubeer desupernatans in een 95 ° C waterbad gedurende 5 min om DNA herstel van de resterende cellen in het supernatant maximaliseren. <ol><li> Incubeer bij 70 ° C voor monsters die voornamelijk Gram-negatieve organismen. Maar als Gram-positieve organismen aanwezig zijn (wat het geval is bij pluimvee fecale monsters) zijn, incubeer bij 95 ° C. </li><li> Met plastic bevestigingen aan de reactievaatjes zodat de buizen niet &quot;pop&quot; open en potentieel monstervolume verliezen mogelijke opbouw van druk in deze gesloten reactievaatjes. </li></ol></li><li> Open elke microcentrifugebuis om de druk, re-cap de microcentrifugebuizen los en meng met behulp van een vortex gedurende 15 sec. </li><li> Centrifugeer het monster bij 14.000 xg gedurende 1 min, verwijdert 1,2 ml van de bovenstaande vloeistof en breng deze in een nieuwe steriele 2 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 1 tab Inhibitex aan elk monster, en meng met behulp van een vortex tot de steekproef wordt een gelijkmatig wit / off-witte vloeistof. <ol><li> Vermijd touching het tabblad Inhibitex terwijl het plaatsen van het in de microcentrifugebuis met het monster. Om dit te bereiken, plaatst de blisterverpakking met de tab direct boven de open microcentrifugebuisje en duw het tabblad uit de blisterverpakking en in de microcentrifugebuisje. </li></ol></li><li> Incubeer het monster gedurende 1 min bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) en gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Breng alle vloeistof op een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. <ol><li> Vermijd resterende deeltjes die eventueel gepelleteerd onderaan de microcentrifugebuis aan het einde van stap 2.5 bij het overbrengen van de vloeistof. </li></ol></li></ol> 3. Geautomatiseerde DNA Purification Met behulp van de QIAcube Robotic Workstation OPMERKING: Het aantal plastic verbruiksgoederen, de opstelling van het monster rotor adapters in de centrifuge, en de benodigde volumes van de buffers / oplossingen zijn afhankelijk van de number van de monsters die worden geleid. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Voeg elutiebuisjes en filter buizen naar de juiste sleuven in de rotor adapters. Voor elk monster, voeg 400 ul aan het middelste sleuf van de rotor adapter. Plaats de rotor adapters in het werkstation centrifuge in de juiste opstelling volgens het aantal monsters gezuiverd. <ol><li> Zorg ervoor dat alle van de microcentrifugebuisje deksels goed zijn vastgezet binnen de rotor adapter omdat een mislukking te doen kan resulteren in het scheren tijdens een van de centrifugeren stappen van de zuivering protocol. </li></ol></li><li> Voeg de vereiste aantal 1.000 III en 200 pi filter-tips om het werkstation, en vul de geleverde buffer flessen met het vereiste volume van buffers. OPMERKING: De voor deze zuivering protocol (AL, AW1, AW2, en AE) buffers zijn allemaal opgenomen in de QIAamp DNA Stool Mini Kit. De gebruiker moet 100% ethanol die nodig is voor de AW BU leverenffers en als een oplossing in het zuiveringsproces. </li><li> Voeg de vereiste hoeveelheid van de geleverde proteinase K oplossing in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en plaats deze in een sleuf op het werkstation. Voeg ook het vereiste aantal (gelijk aan het aantal monsters gezuiverd) van 2 ml safe-lock microcentrifuge monsterbuizen RB het gedeelte shaker van het werkstation. <ol><li> Zorg ervoor dat de deksels van het monster buizen goed zijn geplaatst in de juiste sleuven op het werkstation, aangezien een niet te doen zal resulteren in een foutmelding wanneer de machine voor het eerst scant het werkstation om ervoor te zorgen dat alle benodigde kunststoffen en vloeistoffen zijn beschikbaar voor de gevraagde draaien. </li></ol></li><li> Met behulp van het touchscreen op het werkstation, selecteer het DNA Kruk - Human Kruk - detectie van pathogenen Protocol, en lezen via de volgende schermen om ervoor te zorgen dat het werkstation correct werd geladen. Zodra alle check-schermen worden doorgegeven, selecteert u Start om dit protocol uit te voeren. <ol><li> Als het extraheren van DNA van meer dan 12 monsters, beginnen de homogenisering proces (stap 1) voor de volgende reeks monsters, omdat een run van 12 monsters neemt ~ 72 min in te vullen op het werkstation. </li></ol></li><li> Verwijder de monsters van de rotor adapters, cap hen en plaats bij -20 ° C totdat het nodig is voor daaropvolgende stroomafwaartse analyses. <ol><li> Op dit punt, combineren de 3 herhaalde zuiveringen een individueel monster (totaal geanalyseerde hoeveelheid = 1 g) met een centrifugatie / verdamping systeem. Combineer de duplo en opnieuw uitstromen tot een eindvolume van 100 pl Tris-EDTA buffer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+currently+used+commercial+DNA-extraction+methods+give+different+results+of+clostridial+and+actinobacterial+populations+derived+from+human+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+ecology%22%5BJournal%5D)">The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples.</a> FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).</li>
<li>Tang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+isolation+of+DNA+from+pig+faeces+and+comparison+of+five+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods.</a> Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).</li>
<li>McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+methods+for+extraction+of+bacterial+DNA+from+human+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples.</a> Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).</li>
<li>Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+kits+for+PCR-DGGE+analysis+of+human+intestinal+microbial+communities+from+fecal+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens.</a> Nutrition journal. 9, 23(2010).</li>
<li>Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+method+affects+microbial+community+profiles+from+soils+and+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment.</a> Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).</li>
<li>Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+Bacterial+DNA+Extraction+from+Faecal+Samples%3A+Comparison+of+Three+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+microbiology+journal%22%5BJournal%5D)">Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods.</a> The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).</li>
<li>Claassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+efficiency+of+five+different+commercial+DNA+extraction+kits+for+extraction+of+DNA+from+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples.</a> Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).</li>
<li>Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+methods+for+analysis+of+turkey+cecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota.</a> Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).</li>
<li>Salonen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fecal+DNA+extraction+methods+with+phylogenetic+microarray%3A+effective+recovery+of+bacterial+and+archaeal+DNA+using+mechanical+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis.</a> Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+direct+boiling+method+with+commercial+kits+for+extracting+fecal+microbiome+DNA+by+Illumina+sequencing+of+16S+rRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags.</a> Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+extraction+and+purification+of+DNA+from+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome.</a> PloS one. 7, 33865(2012).</li>
<li>Qu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Metagenomics+Reveals+Host+Specific+Metavirulomes+and+Horizontal+Gene+Transfer+Elements+in+the+Chicken+Cecum+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome.</a> PloS one. 3, 2945(2008).</li>
<li>Sekelja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abrupt+temporal+fluctuations+in+the+chicken+fecal+microbiota+are+explained+by+its+gastrointestinal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin.</a> Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).</li>
<li>Oakley, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poultry-Associated+Microbiome%3A+Network+Analysis+and+Farm-to-Fork+Characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations.</a> PloS one. 8, 57190(2013).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nitrogen+retention+and+microbial+populations+in+poultry+litter+treated+with+chemical%2C+biological+or+adsorbent+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+management%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments.</a> Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+mineralization+of+organic+nitrogen+forms+in+poultry+litters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters.</a> Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alum+addition+on+microbial+communities+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter.</a> Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+QIAamp+DNA+Stool+Mini+Kit+for+ecological+studies+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota.</a> Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).</li>
<li>Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precalence+of+Methanobrevibacter+smithii+and+Methanosphaera+stadtmanae+detected+in+the+human+gut+using+an+improved+DNA+detection+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol.</a> PloS one. 4, 7063(2009).</li>
<li>Harms, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+nitrifying+bacteria+in+a+municipal+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+and+technology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant.</a> Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).</li>
<li>Rothrock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvolume+DNA+quantification+methods+for+use+with+volume-sensitive+environmental+DNA+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+natural+and+environmental+sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts.</a> Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).</li>
<li>Navas-Molina, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNavas-Molina%2C+JA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCHIME+improves+sensitivity+and+speed+of+chimera+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.</a> Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyNAST%3A+a+flexible+tool+for+aligning+sequences+to+a+template+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.</a> Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).</li>
<li>Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FastTree+2%E2%80%93approximately+maximum-likelihood+trees+for+large+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments.</a> PloS one. 5, 9490(2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+microbial+community+in+an+anaerobic+swine+waste+treatment+lagoon%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon.</a> Anaerobe. 16, 74-82 (2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+alum+treatment+on+the+concentration+of+total+and+ureolytic+microorganisms+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter.</a> Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).</li>
<li>Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+shifts+in+microbial+population+structure+within+poultry+litter+associated+with+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties.</a> Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De DNA-extractie methode geschiedt de kwantitatieve en kwalitatieve totale bacteriële gemeenschap schattingen voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters, het ondersteunen van de analyses van monsters afhankelijke karakter van de DNA-extractie methoden eerder 1,3,6 gezien. Voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters, de volgorde van uitvoering van de DNA-extractie methoden was anders voor de kwantitatieve (Mechanische&gt; Hybrid&gt; Enzymatic) en de kwalitatieve (Enzymatic&gt; Hybrid&gt; Mechanical) totale bact...

Bij het analyseren van complexe klinische of omgevingsmonsters (bijv. uitwerpselen, bodems), zijn er twee hoofdmethodologieën die worden gebruikt voor de extractie van DNA. De eerste is een mechanische verstoring van de matrix door middel van een intense bead-beating stap, terwijl de tweede een enzymatische verstoring van de matrix is om bacteriële cellen chemisch vrij te maken en PCR-remmers uit de matrix tegelijkertijd te remmen. Gezien de verschillende manieren waarop deze twee typen extractiemethoden werken, is het niet verrassend dat eerdere onderzoeken aantoonden dat de geschikte DNA-extractiemethode zowel zeer monster- als analyseafhankelijk is. Vergelijkende DNA-extractiestudies toonden eerder aan dat sommige methoden geschikter zijn voor verbeterde DNA-kwaliteit en -hoeveelheid uit omgevingsmonsters1-3, terwijl andere verbeteringen aantoonden voor analyse op gemeenschapsniveau zoals denaturerende gradient gelelektroforese (DGGE)4-6, terminaal beperkt fragmentlengte polymorfisme (T-RFLP)7, geautomatiseerde ribosomale intergene ruimteanalyse (ARISA)8 en fylogenetische microarrays9. Daarom moeten geschikte DNA-extractiemethoden worden gebruikt of ontwikkeld, afhankelijk van de soorten omgevingsmonsters en de soorten analyses die op die monsters worden uitgevoerd, vooral gezien de recente vooruitgang in analyse van bacteriegemeenschappen.
Next generation sequencing, in combinatie met meer kwantitatieve gemeenschapsbeoordelingen (bijv. kwantitatieve PCR (qPCR)), wordt steeds meer gebruikt in de omgevings- en klinische wetenschappen, maar er is zeer weinig onderzoek gedaan om het effect van DNA-extractiemethoden op deze datasets te bepalen. De meeste DNA-extractie vergelijkende studies hielden zich bezig met microbiomische gemeenschapsschattingen uit menselijke of menselijke modelmonsters10,11, niet uit monsters van landbouwhuisdieren. De weinige kippengerichte next generation sequencing studies hielden zich bezig met specifieke metagenomische12,13 of microbiomische14 vragen; ze bespraken niet het effect van DNA-extractiemethode op de resulterende microbiomische analyses. Gezien de complexe aard van omgevingsmonsters met betrekking tot pluimveehouderij (bijv. uitwerpselen, stro/bedstro, weilandbodem), moeten DNA-extractiemethoden zorgvuldig worden geselecteerd. Het is bekend dat pluimveegerelateerde omgevingsmonsters grote hoeveelheden PCR-remmers bevatten en er zijn wel 500-voudige DNA-extract verdunningen vereist voor PCR en daaropvolgende downstream analyse15-17. Daarom is het essentieel dat DNA-extractiemethoden worden geoptimaliseerd voor deze soorten monsters om niet alleen de matrix fysiek te verstoring, maar ook om het grote aantal aanwezige remmers te kunnen verminderen/elimineren.
De QIAamp DNA Stool Mini Kit, een enzymatische extractiemethode, wordt beschouwd als de “gouden standaard” bij het extraheren van DNA uit moeilijke darm/uitwerpselmonsters1,18,19 en is met succes toegepast op omgevingsmonsters van pluimvee8,14. De enzymatische verwijdering van PCR-remmers door het gebruik van een eigen matrix is een van de grootste voordelen van het gebruik van deze methode voor deze soorten omgevingsmonsters, net als het vermogen om de doorvoer aanzienlijk te verbeteren (en de monsterverwerkingsfout te verminderen) met behulp van geautomatiseerde werkstations. Een groot nadeel is het ontbreken van een mechanische homogenisatie stap om bacteriële cellen fysiek te scheiden van de omgevingsmatrix. Bij het testen van darm- en uitwerpselmonsters van niet-pluimvee oorsprong, verhoogde de toevoeging van een bead-beating of mechanische verstoring stap binnen een DNA-extractieprotocol de extractie-efficiëntie aanzienlijk9, DNA-opbrengst/kwaliteit1,4,5 en verbeterde downstream gemeenschapsanalyses aanzienlijk in termen van rijkdom, diversiteit en dekking5,6,11. Deze studies vergeleken niet alleen mechanische bead-beating methoden met de “gouden standaard” enzymatische methode, maar sommige voegden ook de mechanische bead-beating stap toe aan het enzymatische protocol om de resultaten te verbeteren6,9,11.
Volgens de resultaten van bovenstaande studies konden bacteriegemeenschapsanalyses (zowel kwalitatief als kwantitatief) worden verbeterd uit pluimveegerelateerde omgevingsmonsters door de toevoeging van een mechanische homogenisatie stap aan de enzymatische methode. Daarom was het doel van dit onderzoek tweeledig: (1) een nieuwe DNA-extractietechniek ontwikkelen die de meest gewenste aspecten van zowel de mechanische (krachtige homogenisatie stap) als enzymatische (PCR-remmer verwijdering en automatisering) extractiemethoden gebruikt en (2) de kwantitatieve (via qPCR) en kwalitatieve (via microbiomics) bacteriegemeenschapsbeoordelingen van deze nieuwe methode vergelijken met representatieve mechanische en enzymatische methoden.

<table><tbody><tr><td>Lysing Matrix E tube</td><td>MPBio</td><td>6914-050</td><td>Verschillende maten beschikbaar en de laatste 3 cijfers van het cat. Nr. geven de maat aan (-050 = 50 buizen, -200 = 200 buizen, -1000 = 1.000 buizen)</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Solution</td><td>MPBio</td><td>6570-205</td><td>Kan afzonderlijk worden gekocht, of ook aanwezig in het FastDNA Spin Kit voor feces (Cat. Nr. 116570200)</td></tr><tr><td>PLS Buffer</td><td>MPBio</td><td>6570-201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer ASL (560 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19082</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 24 homogenisator</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td>48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. Nr. 116002527) beschikbaar om de doorvoer van de mechanische homogenisatie stap te verdubbelen</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube24 (110V)</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>Voorlopige resultaten tonen aan dat QIAcube HT (Cat. Nr. 9001793) kan worden gebruikt om de doorvoer te verbeteren, maar er zijn verschillende verbruiksartikelen vereist voor deze machine en er moet meer vergelijkend werk worden gedaan.</td></tr><tr><td>Filter-Tips, 1.000 ml (1024)</td><td>Qiagen</td><td>990352</td><td></td></tr><tr><td>Filter-Tips, 200 ml (1024)</td><td>Qiagen</td><td>990332</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)</td><td>Qiagen</td><td>990394</td><td>Voor 1,5 ml microcentrifugebuizen die zijn inbegrepen in het rotoradapterkit is er een alternatief.  Het is Sarstedt Micro tube 1,5 ml Safety Cap, Cat. Nr. 72.690</td></tr><tr><td>Sample Tubes RB (2 ml)</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td>Alternatief: Eppendorf Safe-Lok micro testbuis, Cat. Nr. 022363352</td></tr></tbody></table>

een hybride dna-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van bacteriële gemeenschappen van pluimveeproductie monsters

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

De doeltreffendheid van DNA-extractie protocollen kunnen zeer afhankelijk zowel van het type monster dat wordt onderzocht en de soorten stroomafwaartse analyses uitgevoerd. Gezien het feit dat het gebruik van nieuwe bacteriële gemeenschap analysetechnieken (bv microbiomics, metagenomica) wordt steeds meer voor in de landbouw- en milieuwetenschappen en veel milieu-monsters binnen deze disciplines kan fysiochemisch en microbiologisch unieke (bijvoorbeeld fecale en strooisel / beddengoed monsters uit zijn de pluimveehouderij spectrum), moeten passende en effectieve DNA-extractie methoden zorgvuldig worden gekozen. Daarom werd een nieuwe semi-automatische hybride DNA extractiemethode speciaal ontwikkeld voor milieu pluimveehouderij monsters. Deze methode is een combinatie van de twee belangrijkste soorten DNA-extractie: mechanische en enzymatische. Een twee-staps intense mechanische homogenisatiestap (met kraal-beating speciaal ontwikkeld voor environmental monsters) werd toegevoegd aan het begin van de &quot;gouden standaard&quot; enzymatische DNA extractiemethode voor fecale monsters naar de verwijdering van bacteriën en DNA uit het monster matrix verhogen en de terugwinning van Gram-positieve bacteriën leden van de gemeenschap. Nadat de enzymatische extractie gedeelte van de hybride methode werd ingeleid, werd het resterende zuiveringswerkwijze geautomatiseerd met een robot werkstation monsterdoorvoer verhogen en monster verwerkingsfout verminderen. In vergelijking met de strenge mechanische en enzymatische DNA-extractie methoden, deze nieuwe hybride methode voorwaarde dat de beste totale gecombineerde prestaties bij het overwegen van kwantitatieve (met behulp van 16S rRNA qPCR) en kwalitatieve (met behulp van microbiomics) een raming van de totale bacteriële gemeenschappen bij het verwerken van gevogelte uitwerpselen en zwerfvuil monsters .

Voor deze studie werden verse uitwerpselen uitwerpselen en zwerfvuil monsters hersteld van een commerciële vleeskuikens huis (~ 25.000 vogels) in het zuidoosten van de Verenigde Staten. De vleeskuikens (Gallus gallus) waren Cobb-500 kruist, en ze waren 59 dagen oud op het moment van de bemonstering. Verse uitwerpselen en zwerfvuil monsters werden hersteld van vier verschillende gebieden binnen het huis (in de buurt van cooling pad, in de buurt van de waterer / aanvoerlijnen, tussen de waterer / aanvoerlijnen, e...

Een nieuwe semi-automatische hybride DNA-extractiemethode voor gebruik met monsters uit de biologische pluimveehouderij werd ontwikkeld en vertoonde verbeteringen ten opzichte van een gebruikelijke mechanische en enzymatische extractiemethode in termen van de kwantitatieve en kwalitatieve schattingen van de totale bacteriegemeenschappen.

Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een nieuwe DNA-extractietechniek te ontwikkelen die mechanische DNA-homogenisatie combineert met PCR-remmerverwijdering en de gouden standaard en somatische extractiemethode voor omgevingsmonsters langs de pluimveeproductieketen. Dit wordt bereikt door eerst een omgevingsmonster op te delen in microcentrifugebuizen die een mengsel van kralen bevatten om de complexe omgevingsmonsters effectief te homogeniseren. De tweede stap is om de buizen in een krachtige homogenisator te plaatsen om efficiënt nucleïnezuren uit de bacteriecellen en de omgevingsmatrix vrij te maken.Vervolgens wordt het homogenaat gebruikt als startmateriaal voor de gouden standaard enzymatische DNA-extractiemethode via de PCR-remmingsbindingsfase. De laatste stap is om de monsters in een A DNA-extractie robotwerkstation te plaatsen om de gebruiker te voorzien van geëxtraheerde DNA-monsters die geschikt zijn voor een reeks downstream-toepassingen, uiteindelijk kwantitatieve PCR en microbioomanalyse met behulp van het aluminium MiSeq-platform, werden gebruikt om aan te tonen dat deze nieuwe hybride methode de beste combinatie van kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van totale bacteriegemeenschappen biedt in vergelijking met het verwerken van monsters met alleen de mechanische of enzymatische extractiemethode. Deze methode biedt inzicht in de analyse van microbiële gemeenschappen langs de pluimveeproductieketen, maar kan ook worden toegepast op andere landbouwsystemen zoals varkens, runderen of gewasproductie die eveneens complexe omgevingsmonsters bevatten.Het demonstreren van deze procedure vandaag zal Kaitlyn Griffin zijn, een student in mijn laboratorium. Om het experiment te beginnen, stel een waterbad in op 95 graden Celsius. Weeg vervolgens drie replica's van 0,33 gram af om in totaal één gram kamertemperatuur, grond of fecale stof in een twee milliliter lysing matrix ET-buis te analyseren en verwissel handschoenen tussen monsters.Voeg 825 microliter natriumfosfaatbuffer en 275 microliter pre-lyse-oplossing of PLS toe aan een monsterbuis. Vorm de monsters vervolgens gedurende 15 seconden en centrifugeer de buizen bij 14.000 Gs gedurende vijf minuten. Decanteer het supernatant en voeg 700 microliter buffer A SL toe. Vorm de buis vervolgens gedurende vijf seconden.Open één buis per keer om besmetting te voorkomen. Zorg er vervolgens voor dat er een headspace van 10% van het totale volume in de conische buis is voordat u de monsters in het fast prep 24-instrument plaatst. Homogeniseer de monsters met een snelheid van zes meter per seconde gedurende 40 seconden.Let op het verschil tussen fast prep 24 en vormen na homogenisatie. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 14.000 Gs. Breng het supernatant over naar een steriele twee milliliter microcentrifugebuis naar de resterende monster in de lysing matrix ET-buis op een aanvullend 700 microliter SL-buffer, herhomogeniseer en centrifugeer.Gebruik de vorige instellingen, plaats plastic sluitclips op de monsterbuizen om ervoor te zorgen dat ze niet openspringen en incubeer de supernatanten gedurende vijf minuten in een waterbad van 95 graden Celsius. Open vervolgens elke microcentrifugebuis om de druk vrij te geven, dek de buizen af en vorm ze gedurende 15 seconden. Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 14.000 GS.Na centrifugatie breng 1,2 milliliter van het supernatant over in een steriele twee milliliter microcentrifugebuis. Plaats vervolgens de blisterverpakking met de tab direct boven de open microcentrifugebuis en duw de tab voorzichtig uit de blisterverpakking in de buis. Om contact tussen de inhibit X-tab en de buis te voorkomen, voegt u één inhibit X-tab toe aan elk monster.Vorm vervolgens de buizen totdat de monsters een uniform doffe witte vloeistof worden. Incubeer de monsters gedurende één minuut op kamertemperatuur en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 14.000 kaas terwijl u eventuele resterende deeltjes aan de bodem van de buizen vermijdt. Breng alle vloeistof over in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten op volle snelheid. Zorg ervoor dat de werkstation de juiste hoeveelheid filtertips en buffers bevat voordat u begint met geautomatiseerde DNA-zuivering. Voeg vervolgens ellucianbuizen en filterbuizen toe aan de rotoradapters en voeg 400 microliter van elk monster toe aan de middelste sleuf van de rotoradapter.Plaats de rotoradapters in de werkstationcentrifuge en zorg ervoor dat alle deksels van de microcentrifugebuizen goed zijn bevestigd in de rotoradapter. Voeg proteinase K-oplossing toe aan een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis en plaats deze in slot A op de werkstation. Voeg twee milliliter veilige slot microcentrifugebuizen toe aan de schudsectie van de werkstation en zorg ervoor dat de deksels van de monsterbuizen stevig zijn geplaatst.Gebruik het touchscreen op de werkstation en selecteer het DNA-stoel humane stoelpathogeendetectieprotocol en lees de volgende schermen door om er zeker van te zijn dat de werkstation correct is geladen. Zodra alle controleschermen zijn gepasseerd, selecteert u start om het protocol uit te voeren. Verwijder vervolgens de monsters uit de rotoradapters.Combineer de drie replicaatzuiveringen voor een individueel monster met behulp van een centrifugatie-evaporatiesysteem. Eluteer het monster opnieuw naar een eindvolume van 100 microliter met tris EDTA-buffer. Dek de monsters af en plaats ze bij min 20 graden Celsius totdat ze nodig zijn voor downstream-analyse.Deze grafiek toont aan dat de mechanische methode consistent de hoogste geschatte totale bacteriële genabundantie leverde voor feces- en strooiselmonsters. De enzymatische methode had in alle gevallen de laagste schattingen. De nieuwe hybride extractiemethode produceerde de beste combinatie van kwalitatieve en kwantitatieve geschatte totale bacteriegemeenschappen.Van de drie geteste extractiemethoden. U zou nu een beter begrip moeten hebben van hoe u deze nieuwe, semi-geautomatiseerde hybride DNA-extractiemethode uitvoert en de nuttigheid ervan in de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van microbiële gemeenschappen uit complexe omgevingsmonsters kunt zien.

a-hybrid-dna-extraction-method-for-qualitative-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Twee complementaire analyses van biologische atmosferische deeltjes uit bemonsterde luchtfilters worden hier beschreven: de extractie en detectie van endotoxine en van DNA.

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van de DNA-monsters van het voedsel en milieu microbiomes voor gezamenlijke detectie en subtypering van Salmonella via quasimetagenomic sequencing. Het gecombineerd gebruik van cultuur verrijking, immunomagnetic scheiding (IMS) en meerdere verplaatsing mogelijk versterking (MDA) van de effectieve concentratie van Salmonella genomic DNA van voedsel en milieu monsters.

Quasi-metagenomic analyses van Salmonella uit voedsel en milieu voorbeelden

Inzicht in de biologische samenstelling van milieu zwevende deeltjes is belangrijk voor de studie van de significante effecten op de volksgezondheid en verspreiding van de ziekte. Hier, we drie soorten bioaerosol bemonsteringsmethoden en een biologische analyse van airborne microben gebruikt om beter verkennen vanuit de lucht microbiële gemeenschappen onder verschillende omgevingsomstandigheden.

Samenstelling en analyse van de verdeling van Bioaerosols onder verschillende omgevingsomstandigheden

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Hier beschrijven we een methode voor het genereren van kiemvrije kuikens uit eieren van een commerciële vleeskuikenlijn, de Ross PM3. Deze methode kan worden aangepast voor het genereren van kiemvrije dieren van andere pluimveesoorten.

Productie van kiemvrije snelgroeiende vleeskuikens uit een commerciële lijn voor microbiotastudies

Dit protocol beschrijft een alomvattende aanpak voor het kweken, sequentiëren en de novo hybride genoomassemblage van urinebacteriën. Het biedt een reproduceerbare procedure voor het genereren van volledige, circulaire genoomsequenties die nuttig zijn bij het bestuderen van zowel chromosomale als extrachromosomale genetische elementen die bijdragen aan urinaire kolonisatie, pathogenese en verspreiding van antimicrobiële resistentie.

Hybride de novo genoomassemblage voor het genereren van complete genomen van urinebacteriën met behulp van short- en long-read sequencing-technologieën

Het protocol presenteert twee methodologieën om de isolatie van anaërobe darmbacteriën te verbeteren. De eerste richt zich op de isolatie van een breed scala aan bacteriën met behulp van verschillende kweekmedia. De tweede richt zich op de kweekstappen van een specifieke microbiële groep, die mogelijk myo-inositol assimileert, om de ecologische betekenis ervan volledig te begrijpen.

Strategieën om de teelt van anaërobe bacteriën uit het maagdarmkanaal van kip te verbeteren

Het nauwkeurig kwantificeren van Salmonella in pluimvee op lage niveaus is een huidige industriële en regelgevende uitdaging. Dit protocol beschrijft een MPN-test die kwantificering van Salmonella in rauwe en kant-en-klare pluimveeproducten mogelijk maakt. Deze methode is snel, gevoelig en sluit aan bij de FSIS-richtlijnen, waardoor de voedselveiligheid wordt verbeterd en de inspanningen op het gebied van de volksgezondheid worden ondersteund.

Gewijzigde Most Probable Number Assay om salmonella in rauwe en kant-en-klare kipproducten te kwantificeren

Betrouwbare en nauwkeurige vormen van veldinzetbare DNA-analyse zijn cruciaal voor veel industrieën. Dit artikel biedt twee methoden voor milieumicrobiële analyse in het veld: 1) de isolatie van microbieel DNA uit omgevingsmonsters met behulp van een biologische extractie-veldkit, en 2) de analyse van DNA via de field qPCR-eenheid.

Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

Leer een hybride DNA-extractiemethode voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van bacteriële gemeenschappen in pluimveeproductiemonsters. Deze techniek combineert mechanische homogenisatie met enzymatische extractie.

Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters (Video) | JoVE Journal

Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters

Meer video's verkennen