Atomic Force Microscopy van Red-Light Fotoreceptoren behulp PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping
24 oktober 2014
Een methode voor het onderzoeken van de structuur van een eiwitfotoreceptor met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) wordt beschreven in dit artikel. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) onthult intacte eiwitdimeren op een mica-oppervlak.
Het algemene doel van deze procedure is om hoge resolutie beelden van fotoreceptor-eiwitten te verzamelen met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst een monster van het fotoreceptor te verkrijgen en het te verdunnen. De tweede stap is om het eiwitmonster gedurende ongeveer 30 seconden aan te brengen op een vers gekloven en schone mica-oppervlak.
Vervolgens wordt de MICA gespoeld met buffer om ongebonden en losjes gehechte moleculen te verwijderen. Vervolgens wordt het monster bevestigd aan een vloeistofcel die is uitgerust met een geschikte sonde. Deze assemblage wordt op de scanner geladen.
Nadat de vloeistofcel is gevuld met bufferoplossing, brengt u de punt in contact met het monster en begint u met scannen. Uiteindelijk wordt atoomkrachtmicroscopie met piekkracht gebruikt. Kwantitatief nanomechanisch eigenschapsmapping wordt gebruikt om beelden te verzamelen van enkelvoudige fotoreceptor-eiwitten op het monstersoppervlak.
Atoomkrachtmicroscopie die piekkracht q en m incorporeert, kan antwoord geven op sleutelvraagstukken op het gebied van moleculaire biologie, zoals wat de belangrijke structurele en chemische kenmerken zijn die de functie van biologisch actieve macromoleculen bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van huidige methoden zoals NMR en röntgenkristallografie is dat hoge resolutie beelden van intacte eiwitten en andere biologische macromoleculen kunnen worden verkregen in een biologisch relevante omgeving. Over het algemeen worstelen personen die nieuw zijn met deze methode omdat de afstemming van de sonde en oplossing meerdere stappen vereist, waarvan sommige behoorlijk complex zijn.
Met piekkracht q en m en geautomatiseerde software worden verschillende van deze stappen vereenvoudigd, waardoor het proces veel gemakkelijker wordt voor nieuwe gebruikers en studenten aan de bachelor. Het demonstreren van deze procedure zullen drie studenten aan de bachelor zijn uit mijn onderzoekslaboratorium, Marie Kroger, Blair Sorenson en Jessica Thomas. Deze studenten zullen dit komende jaar graduate studies volgen op het gebied van microbiologie, chemische techniek en chemie.
Deze items moeten in een specifieke volgorde worden ingeschakeld. Eerst de computer, daarna de controller en ten slotte het glasvezellicht. De microscoop moet een FM en LF fm lezen.
De camera moet gecentreerd zijn boven een FM optisch hoofd in de software. Het volgende moet worden geselecteerd. De experimentcategorie is mechanische eigenschappen.
De experimentgroep is kwantitatief nanomechanisch mapping en het experiment is piekkracht q en m in vloeistof. Met de correct geselecteerde instellingen kan het experiment worden geladen en ingesteld. De camerafocus moet eerst worden ingesteld met behulp van het Z-objectief, gevolgd door het gebruik van de grove bedieningselementen om de stage te positioneren, het doel is om de A FM-kopopening een millimeter voor de stagesoppervlak te plaatsen om de monsterschijven te manipuleren met vers gekloven mica hebben cirkelvormige grijper-pincetten.
Begin met het assembleren van de vloeistofcel uit onberispelijk schoongemaakte onderdelen. Bevestig eerst de slangadapter op de poort op de schone vloeistofcellen. Druk vervolgens met behulp van platte kopjes zeer voorzichtig de O-ring in de uitsparing op de vloeistofcel.
Vervolgens op de sondebevestigingsclip, druk licht op de veer en draai deze weg van de groef. Grijp de sonde met behulp van dezelfde pincetten en schuif deze in de groef, zodat de punt naar het midden van de cel is gericht. Beveilig vervolgens de sonde met behulp van de clip.
De volgende stap is om de klem op de A FM te controleren. Deze moet volledig zijn ingetrokken. Plaats de assemblage met de achterkant naar beneden op het monster. Pas de assemblage aan op de pennen van de A FM voor stabilisatie.
Laat de klem zakken. Om de O-ring te inspecteren, drukt u op de neerschakelingsschakelaar op de microscoop totdat de O-ring wordt gezien. Deze moet stevig worden samengedrukt tussen de steunschijf en de vloeistofcel.
De vloeistofcel kan worden gefocusseerd met behulp van de grove aanpassingsknop. Gebruik vervolgens de XY-aanpassing om te focussen op de sondetip. Het ziet eruit als een metaalgoud driehoekje.
Gebruik nu de down pizo-hendel om de tip dicht bij het monstersoppervlak te brengen, pas de focus aan op de tips, reflectie, en bewaak de positie van de cantilever ten opzichte van deze reflectie. Op dit moment zouden ze nauw gealigneerd moeten zijn, maar niet volledig overlappend. Bereid nu de spuit voor.
Vul deze met één milliliter bufferoplossing en bevestig de adapter. Bevestig vervolgens de spuit aan de afvoerslang en schuif de plunjer volledig uit. Bevestig vervolgens de slang aan de vloeistofcel met behulp van een adapter om de kamer te vullen, druk voorzichtig op de plunjer totdat het midden van de kamer vol is.
Er mogen geen luchtbellen of morsen van de vloeistofcel op de microscoop zijn. Plaats vervolgens de spuit in een goed ondersteunde positie boven de kamer. Gebruik vervolgens de camerafeed en XY-translatieknoppen.
Om de laser op het scherm te lokaliseren, zou deze als een diffuse rode stip moeten verschijnen. Eenmaal gevonden, gebruik de laserbediening om het naar de sonde te verplaatsen. Pas nu eindelijk de laser en spiegelbedieningen aan tot het somsignaal op de microscoop is gemaximaliseerd tussen vier en zes, pas de kwadrantdiode aan.
Gebruik vervolgens de knoppen op de scankop om de verticale en horizontale afwijkingen aan te passen tot de waarden op de microscoop zo dicht mogelijk bij nul zijn. Zorg ervoor dat u de juiste aanschafopties selecteert voordat u verdergaat. Stel de scanfrequentie in op ongeveer één hertz in het venster monsters per lijn.
Voer 256 in. Voor de scanassistentie automatische besturing. Selecteer individueel voor de scanassistentie automatische Z-limiet selecteren uit.
De Z-limiet moet 500 nanometer zijn en de scanschaal moet één micrometer zijn. Met de correct ingestelde instellingen, meet de sonde. Observeer de Z pizo-spanningsverandering terwijl de sondetip het oppervlak nadert.
Als de tip buiten het bereik gaat, trek dan terug en benader opnieuw, de sondetip moet mogelijk worden vervangen. Als dit niet werkt, wanneer de tip is geëngageerd, moet
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de structuur van eiwitfotoreceptoren met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). De techniek van PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) wordt gebruikt om intacte eiwitdimeren op een mica-oppervlak te onthullen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Structuurbiologie
Achtergrond
- Eiwitfotoreceptoren spelen een cruciale rol in verschillende biologische processen.
- Atomaire krachtmicroscopie maakt hoge resolutie beeldvorming van biomoleculen mogelijk.
- Het begrijpen van de structuur van deze eiwitten kan inzicht geven in hun functie.
- PF-QNM is een nieuwe techniek die de beeldvormingscapaciteiten van AFM verbetert.
Doel van het onderzoek
- Om hoge resolutie beelden van fotoreceptoreiwitten te verzamelen.
- Om de structurele integriteit van eiwitdimeren te onderzoeken.
- Om de effectiviteit van PF-QNM in het visualiseren van eiwitstructuren te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van het monster van fotoreceptoreiwitten.
- Verdunning van het eiwitmonster voor toepassing.
- Toepassing van het monster op een vers gekloven mica-oppervlak.
- Spoelen met buffer om ongebonden moleculen te verwijderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van intacte eiwitdimeren op mica.
- Demonstratie van de capaciteit van PF-QNM in nanomechanische eigenschappen kaartleggen.
- Hoge resolutie beelden die structurele details van fotoreceptoren onthullen.
- Validatie van de methode voor toekomstige studies naar eiwitstructuren.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare benadering om eiwitfotoreceptoren te bestuderen.
- PF-QNM verbetert het begrip van de relatie tussen eiwitstructuur en -functie.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere biomoleculen voor soortgelijke onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy with PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) enables high-resolution imaging of intact protein photoreceptors in biologically relevant environments, supporting target validation by revealing structural details of light-sensing proteins. This approach reduces reliance on crystallization and NMR, offering a label-free method to assess protein integrity and oligomerization states early in discovery. The automation via ScanAsyst software improves reproducibility and accessibility for screening applications, accelerating mechanistic de-risking of photoreceptor targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of protein dimerization and aggregation states to interrogate therapeutic hypotheses about photoreceptor function.
- Operational Value: Provides label-free, native-condition imaging that avoids artifacts from fixation or staining, supporting reliable target confirmation.
- Predictive Value: Supports assessment of structural stability and conformational changes under physiological buffer conditions, informing lead selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantitative nanomechanical maps (e.g., adhesion, deformation) that serve as functional readouts for compound-induced conformational shifts.
- Reproducibility: ScanAsyst automation minimizes user-dependent variability in probe tuning and scanning parameters, enhancing assay robustness.
- Scalability: Compatible with fluid imaging and routine mica preparation, allowing repeated use across multiple protein targets in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to photoreceptor proteins involved in optogenetics and circadian signaling pathways, linking structural insights to functional modulation.
- Preclinical Continuity: Enables structural validation of photoreceptor variants or mutants prior to cellular or in vivo testing.
- Mechanistic De-risking: Correlates nanomechanical properties with light-adapted states, reducing uncertainty in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
PF-QNM fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural and mechanical data that inform early go/no-go decisions. It complements biochemical assays by adding direct nanoscale imaging of target engagement and oligomerization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on photoreceptor oligomerization and structural integrity in native-like conditions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative topographical and mechanical outputs for assessing compound effects on protein structure.
- Analytics: Delivers height, adhesion, and deformation maps at each pixel, enabling multiparametric comparison of protein states.
- Translational Research: Bridges structural discovery to preclinical validation by confirming target integrity before functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable AFM workflow for diverse macromolecules, reducing revalidation effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target structure by resolving dimers and aggregates without crystallization.
- Operational Value: Automation via ScanAsyst reduces training burden and improves inter-user consistency.
- Strategic Value: Enables faster structural triage of targets, reducing time spent on low-confidence candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of protein quality and stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, fluid cell handling, and protein surface chemistry.
- Depends on access to AFM systems with PeakForce QNM and ScanAsyst software, fluid cells, and probes suitable for biological samples.
- Necessitates standardization of sample dilution, mica preparation, and buffer conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different protein concentrations, surface treatments, and environmental conditions (e.g., pH, ionic strength).
- Limited by sample adhesion efficiency and potential tip-induced deformation on very soft samples, as noted in the need for parameter optimization.
